陳榮榮 石新如 閭星 賈春雷 江澤平 竇桂銘 史勝青

摘要：為提高資源利用效率，實現(xiàn)栗園的可持續(xù)管理，本研究通過對栗園廢棄物（栗樹枝木屑、落葉、栗花、綠色雜物）分別添加鹿糞和尿素進行好氧堆肥，分析堆肥的理化性質(zhì)、對堆肥過程中及堆肥結(jié)束微生物種類進行分離鑒定，分析堆肥對大豆發(fā)芽率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，添加鹿糞和尿素的堆肥pH值偏堿性且2種堆肥均已充分腐熟，達到應用標準；在2種處理中檢測到的微生物分別為35種和39種，其中有益微生物分別有13種和10種，其中共有的微生物為6種，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、深綠木霉（Trichoderma atroviride），均為有益菌，能夠促進植物生長或抵抗病原菌。此外，堆肥浸提液對大豆種子萌發(fā)無明顯抑制現(xiàn)象，可施用于田間實現(xiàn)資源利用。因此，本研究中尿素及鹿糞堆肥均已達到腐熟，含有多種有益菌，可以施用于田間以提高板栗廢棄物的利用，實現(xiàn)栗園的可持續(xù)管理。該試驗為栗園廢棄物堆肥技術的改良和有益微生物的發(fā)掘奠定了基礎。

關鍵詞：板栗廢棄物；堆肥；微生物；種類鑒定

中圖分類號：S141.4；S182? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0208-08

栗別稱板栗，屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea）堅果類植物，是我國廣泛栽培的經(jīng)濟林樹種，栽培面積約186.67 萬hm2［1］。然而，栗園經(jīng)營過程中大量化肥以及除草劑的使用導致土壤退化嚴重，土壤微生物多樣性顯著降低［2］。集約經(jīng)營10年的栗園土壤中水溶氮和全氮含量顯著下降，微生物的群落豐富度明顯高于復合肥處理［3-5］。此外，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，農(nóng)村電能、天然氣、太陽能逐漸普及應用，替代了傳統(tǒng)的秸稈、柴草等能源［6］。這導致板栗產(chǎn)區(qū)秋冬后修剪枝條、落葉、空蓬等廢棄物大量堆積田間，不僅造成資源浪費，也容易引發(fā)火災。因此，開展栗園廢棄物堆肥處理和利用研究，對提高板栗產(chǎn)區(qū)生物質(zhì)資源化利用率以及微生物多樣性具有重要的實踐意義。

堆肥是有機固體廢棄物在微生物作用下充分腐熟的過程，包括升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期［7-8］。目前國內(nèi)外對堆肥的研究主要集中在對畜禽糞便、秸稈、園林廢棄物的利用以及工業(yè)垃圾的應用方面，很少有研究板栗廢棄物的堆肥過程及其對植物生長的影響［9-10］。且以往對堆肥的研究主要集中在堆肥的理化性質(zhì)及對土壤的影響方面［11］。近年來，隨著微生物研究的興起，國內(nèi)外研究開始聚焦在堆肥過程中微生物種類和功能以及微生物菌劑對堆肥的影響［12］。大部分堆肥微生物的研究主要集中在微生物屬水平上及相對豐度的變化，很少聚焦到某一特定微生物的功能［13-14］。其中，嗜溫期以好氧性菌群為主，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）等［15］。嗜熱期會產(chǎn)生決定堆肥效率的關鍵菌群，如高溫雙岐菌屬（Thermobifida）、曲霉屬（Aspergillus）、芽孢桿菌屬等；降溫期和腐熟期的優(yōu)勢菌群主要為芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）、棒狀桿菌屬等［16］。Ventorino等對板栗廢棄物堆肥中主要微生物的鑒定表明，主要微生物類群屬于已知可降解木質(zhì)纖維材料的屬［17］。宋影對板栗廢棄物堆肥研究發(fā)現(xiàn)，當板栗空蓬落葉 ∶栗蘑菌渣 ∶雞糞比為4 ∶2 ∶4時，能顯著提高速效養(yǎng)分含量和有機質(zhì)含量，改善土壤結(jié)構(gòu)和提高土壤保水性，對板栗增產(chǎn)效果最顯著［18］。

然而，目前還未見對板栗廢棄物堆肥中微生物種類進行研究的報道。因此，本研究在成熟的堆肥技術的基礎上，擬以板栗廢棄物（修剪樹枝、落葉、新生萌條、雜草）為原料，分別添加鹿糞和尿素進行堆肥發(fā)酵，分析堆肥過程中微生物種類變化以及堆肥的理化性質(zhì)，以及堆肥對黃豆發(fā)芽的影響，為提高栗園廢棄物資源化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 堆肥原料

堆肥原料為粉碎的栗樹枝木屑、落葉、栗花、綠色雜物（新生萌條和主要雜草，切成15～20 cm小段）以及鹿糞和尿素。處理1為添加鹿糞堆肥（LF），原料配比是30%木屑＋20%落葉＋10%栗花＋20%綠色雜物＋20%鹿糞；處理2為添加尿素堆肥（NS），原料配比是將處理1的鹿糞替換為添加尿素（木屑質(zhì)量的5%）。

1.2 堆肥方法

堆肥地點在位于河北省遷西縣漢兒莊鎮(zhèn)楊家峪村的國家板栗公園。利用栗枝搭建4個堆肥圍欄：底寬1.8 m，高1.5 m，長1.8 m，分別各用2個添加鹿糞和尿素處理。堆肥時間從2020年7月30日開始至11月中旬結(jié)束，期間根據(jù)監(jiān)測溫度進行翻堆。分別在堆肥發(fā)酵中期和堆肥結(jié)束時采集樣品，每個圍欄采集3個點，帶回實驗室暫時4 ℃保存。一部分用于微生物分離和鑒定，另一部分用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.3 指標測定方法

1.3.1 理化性質(zhì)分析

pH值、電導率（EC值）測量：堆肥樣品風干過1 mm篩，稱取10 g風干樣，按樣品 ∶蒸餾水=1 g ∶10 mL進行浸提，振蕩20 min后過濾。然后，濾液分別用酸堿度測量儀和臺式電導率儀直接測量。

堆肥樣品中全氮含量采用凱氏定氮法測定［19］；總有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化，比色法測定；土壤有機質(zhì)含量采用土壤有機碳×1.724計算［20］。碳氮比（C/N）比為二者的比值［21］。

1.3.2 微生物分析

堆肥中細菌和真菌的分離采用梯度稀釋平板法，培養(yǎng)基分別是LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和麥芽提取物瓊脂（MEA）培養(yǎng)基。細菌和真菌分離純化后，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） 法提取DNA，并在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）與1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）與ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增，電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。通過BLAST對各序列進行比對，鑒定細菌或真菌種類［22］。

1.3.3 種子萌發(fā)測試

稱取10 g風干樣，按樣品 ∶蒸餾水=1 g ∶10 mL進行浸提，振蕩20 min后過濾。在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪入相應大小的濾紙1張，分別放入10粒顆粒飽滿、大小接近的大豆種子，用移液管吸取10 mL堆肥浸提液于培養(yǎng)皿中，以蒸餾水作為對照，每個樣品重復3次。培養(yǎng)皿在25 ℃下孵化48 h后，測定幼苗的芽長（BL）和種子發(fā)芽率（SGP）。以去離子水潤濕的植物的BL和SGP作對照。發(fā)芽指數(shù)（GI）根據(jù)以下公式確定GI=（樣品處理的發(fā)芽率/樣品處理的平均根長）/（空白的發(fā)芽率/空白樣品處理的平均根長）×100%［23］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。利用單因素方差分析（one-way ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗計算差異顯著性，顯著性水平設定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥原料的理化性質(zhì)

對堆肥原料的理化性質(zhì)進行分析（表1）發(fā)現(xiàn)，堆肥原料中木屑全氮含量最低，全氮主要來自于鹿糞；落葉中有機碳和有機質(zhì)含量最低，木屑、栗花和萌條中有機碳及有機質(zhì)含量較高；鹿糞中C/N最低，為15.15，木屑中C/N最高，達到98.59，而落葉中C/N最適宜，接近26 ∶1。

2.2 堆肥的理化性質(zhì)

堆肥結(jié)束時與堆肥中期相比，全氮含量增加，有機碳、有機質(zhì)含量和C/N均有所降低（表2）。堆肥結(jié)束時尿素處理的總氮含量最高，有機碳和有機質(zhì)含量在尿素處理的堆肥發(fā)酵過程中含量最高，其次是尿素處理的堆肥結(jié)束時；鹿糞處理的堆肥發(fā)酵過程中C/N最高，其次為尿素處理的堆肥發(fā)酵過程中，但在堆肥結(jié)束時，鹿糞處理的堆肥和尿素處理的堆肥C/N相差不大，尿素處理的堆肥C/N略高一些。2種處理堆肥結(jié)束時的pH值均偏堿性，鹿糞處理的堆肥更高，為8.25，而與之相反，堆肥結(jié)束時，尿素處理的堆肥電導率值偏高，為 511.4 μS/cm。

2.3 堆肥過程中微生物的變化

2.3.1 細菌群落的變化

添加鹿糞堆肥中期和堆肥結(jié)束時共鑒定到19種細菌（表3），分別屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和其他；從屬水平分類來看，分別屬于芽孢桿菌屬、Chryseomicrobium、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、假黃單胞菌屬、Paenarthrobacter、鏈霉菌屬以及其他。其中，堆肥中期細菌有6種，包括枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、P. suwonensis和白淺灰鏈霉菌。堆肥結(jié)束時細菌有15種，包括阿氏芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、C. amylolyticum、豚鼠氣單胞菌、P. baetica、熒光假單胞菌、摩拉維亞假單胞菌、韓國假單胞菌、 P. nicotinovorans、 P. aurescens以及不可培養(yǎng)細菌。2個階段共有的細菌為枯草芽孢桿菌和沙福芽孢桿菌。這表明堆肥過程中細菌種類變化較大，且在堆肥結(jié)束時細菌種類有所增加。

添加尿素的堆肥中期和結(jié)束時共鑒定到21種細菌（表4），分別屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、其他；從屬水平上看分別屬于芽孢桿菌屬、副球菌屬、埃希氏菌屬、假單胞菌屬、纖維菌屬、微球菌屬、微桿菌屬、黃桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬。堆肥發(fā)酵過程中檢測出細菌種類為16種，而堆肥結(jié)束時共檢測出細菌種類為8種，表明尿素處理堆肥發(fā)酵過程中細菌種類有所減少。堆肥發(fā)酵過程中細菌種類分別為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、漳州芽孢桿菌、P. acridae、P. huijuniae、大腸桿菌、惡臭假單胞菌、丁香假單胞菌、M. chenggongense、氣生微桿菌、M. foliorum、人參黃桿菌和田鞘氨醇桿菌以及不可培養(yǎng)細菌。堆肥結(jié)束時8種細菌分別為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜氣芽孢桿菌、摩拉維亞假單胞菌以及芬式纖維微菌。2個時間階段共有細菌為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌以及短小芽孢桿菌。

在鹿糞和尿素添加處理中期和結(jié)束2個階段中，共檢測出33種細菌。堆肥結(jié)束時，鹿糞處理與尿素處理相比，細菌多樣性更高一些，多出7種細菌，相同細菌有4種，分別為枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌以及摩拉維亞假單胞菌。鹿糞和尿素堆肥中期和堆肥結(jié)束共有的菌有2種，分別為枯草芽孢桿菌和沙福芽孢桿菌。

2.3.2 真菌群落的變化

鹿糞處理的堆肥中期和結(jié)束時共鑒定出真菌為16種（表5）。堆肥中期只檢測出5種真菌，而結(jié)束時共有13種真菌，分別屬于子囊菌門、毛霉門以及其他；從屬水平來看，分別屬于曲霉屬、鐮刀菌屬、木霉屬、綠僵菌屬、Albifimbria、青霉屬、枝孢屬、毛霉屬、其他。堆肥中期檢測到真菌種類有構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、長枝木霉、羅爾夫青霉、卷枝毛霉。堆肥結(jié)束時的真菌種類為構(gòu)巢曲霉、煙曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、腐皮鐮孢菌、平展木霉、蓋姆斯木霉、深綠木霉、木雛菊木霉、金龜子綠僵菌、A. viridis、枝狀枝孢霉、uncultured fungus。堆肥2個階段共有真菌構(gòu)巢曲霉和黑曲霉。

尿素處理的堆肥中期和結(jié)束時共鑒定出真菌18種，堆肥中期只有6種，堆肥結(jié)束時有14種（表6）。18種真菌中有17種屬于子囊菌門，僅1種屬于擔子菌門。從屬水平上看，18種真菌分別來自曲霉屬、木霉屬、青霉屬、Lomentospora、棒囊殼、Paraphaeosphaeria、Asterodon。堆肥中期真菌為塔賓曲霉、構(gòu)巢曲霉、A. tabacinus、L. prolificans、C. sepedonium、P. arecacearum。堆肥結(jié)束時真菌為日本曲霉、聚多曲霉、塔賓曲霉、毛簇木霉、綠木霉、擬康寧木霉、T. sulphureum、深綠木霉、木雛菊木霉、非洲哈茨木霉、P. glabrum、草酸青霉、L. prolificans、A. ferruginosus。堆肥2個均檢測到的真菌種類為塔賓曲霉和L. prolificans 2種。

在鹿糞和尿素處理中期和結(jié)束2個階段中，共檢測到31種真菌。堆肥結(jié)束時，鹿糞處理堆肥與尿素處理的相比少1種真菌，共有真菌為深綠木霉、木雛菊木霉。

2.4 堆肥對種子發(fā)芽勢的影響

大豆種子在鹿糞和尿素添加的2種堆肥浸提液中處理48 h和72 h時，與對照相比，芽長和發(fā)芽率均無顯著差異（表7），表明2種堆肥對大豆種子萌發(fā)無抑制作用。當GI＞50%時，表示堆肥基本腐熟，對植物基本無毒性；當 GI＞80%時，表示堆肥完全腐熟，對植物完全無毒性，GI相對越高，堆肥成品品質(zhì)越高，本研究中2種堆肥處理的大豆種子發(fā)芽指數(shù)均超過了80%，表明堆肥均已充分腐熟。

3 討論與結(jié)論

3.1 堆肥的理化性質(zhì)

堆肥過程中pH值的變化不僅影響微生物水平和堆肥進程，還影響酶活性和生物反應速度［24-25］。根據(jù)NY/T 3442—2019《畜禽糞便堆肥技術規(guī)范》及NY 525—2021《有機肥料》可知，堆肥合理pH值范圍應在5.5～8.5之間，最佳范圍為6.5～8.0。本研究中添加鹿糞和尿素的堆肥pH分別為8.3和7.9左右，符合堆肥應用規(guī)范，但添加鹿糞的pH值略高于最佳范圍，可能是由于糞便中大量的金屬離子增加了堆肥中離子濃度和陽離子交換量，從而使pH值升高［26-28］。此外，電導率（EC值）反映了有機物的降解和礦化，能夠反映堆肥浸提液中可溶性鹽含量，當堆肥中EC值大于4 000 μS/cm時會對植物生長造成抑制［29-30］。本研究中EC值分別為 442.1、511.4 μS/cm，低于4 000 μS/cm，表明不會對作物造成鹽害。

目前，堆肥C/N的最佳范圍尚未確定，一般認為，堆肥過程的理想初始C/N為20～35，當 C/N 降到20以下表示堆肥已腐熟。堆肥中C/N過高會引起植物“氮饑餓”，導致有機物分解緩慢，土壤能源過多，不利于植物生長；反之會導致“燒苗”。本研究中2種堆肥C/N均低于20，表明已符合標準［31］。

3.2 堆肥的微生物群落

2種堆肥中真菌微生物群落分別屬于子囊菌門、毛霉門、擔子菌門，子囊菌門為優(yōu)勢門類，這一結(jié)果與 Zhang等的研究結(jié)果［32-33］一致。曲霉屬（8個種）和木霉屬（10個種）是2種堆肥鑒定的主要菌屬，占檢測到總真菌數(shù)量的一半。在所鑒定的31種真菌中有6種有益菌，具有促進植物生長、抗病毒、破壞植物病原菌的拮抗作用［34-38］。草酸青霉不僅具有溶磷作用，降解農(nóng)藥減輕土壤污染，而且能夠高效分泌降解木質(zhì)纖維素的酶，青霉生長速度快而且產(chǎn)酶較全，能顯著提高工業(yè)化生產(chǎn)效率［39-42］。塔賓曲霉菌是一種新型的解磷真菌，解磷能力一般為細菌的10倍，且不易失去解磷活性，對鹽堿地的小麥幼苗生長有明顯的促進作用，可作為一種鹽堿地新型生物菌肥［43-44］。此外，有些真菌對植物生長具有積極作用，但在特定環(huán)境下會引發(fā)病害或使植物腐爛，如煙曲霉、腐皮鐮孢菌、黑曲霉等可以引起植物不同部位發(fā)生腐爛［45-46］；枝狀枝孢可引起植物病害［47］；L. prolificans可使動物染?。?8-49］，棘孢曲霉為海南產(chǎn)紅毛丹果實褐斑病的主要致病菌［50］。但本研究中還有一部分真菌尚未查詢到具體功能研究。

堆肥樣品中細菌微生物群落總共有15個屬33種細菌，分別屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門。這與王建才等的研究結(jié)果［51-52］一致。本研究鑒定細菌中有9種有益菌，具有抑制病原菌、控制土傳病害，以及高效分泌多種蛋白及其代謝產(chǎn)物、根際促生菌等作用［53-56］。芬氏纖維微菌具有減輕番茄Cr毒性、降解增塑劑的作用［57-58］；解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，廣泛的抑制細菌和真菌，能有效防治馬鈴薯赤霉病、小麥黃花葉病、大豆疫病等多種病害，具有很好的應用前景［59-63］；阿氏芽孢桿菌為一種高效的解硅菌株，而嗜氣芽孢桿菌具有氧化和分解石油的能力［64］。在堆肥樣品中，還發(fā)現(xiàn)了幾種有害菌，如豚鼠氣單胞菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見致病菌［65］，丁香假單胞菌為常見的革蘭氏陰性的植物病原菌，分布地區(qū)廣泛，并且能感染多種經(jīng)濟農(nóng)作物如玉米、煙草、番茄和豆科等，被普遍認為是世界上最主要的植物細菌病原體之一［66-67］。

3.3 堆肥對大豆生長的影響

堆肥能夠在土壤中安全使用的基礎是堆肥的穩(wěn)定性和堆肥的成熟度，堆肥的穩(wěn)定性與微生物活性有關，而堆肥的成熟度則與堆肥的生長潛力或植物毒性相關［68］。發(fā)芽指數(shù)是堆肥的活力指標，表示堆肥的毒性水平，是堆肥成熟和穩(wěn)定的標志，目前種子的發(fā)芽試驗被認為是最可靠的評價堆肥腐熟度的指標［69］。發(fā)芽指數(shù)能夠反映堆肥的植物毒性，當其大于50%時表明堆肥已達到腐熟，達到80%時表明堆肥已經(jīng)完全腐熟［70-71］。本研究中堆肥浸提液處理大豆種子后發(fā)芽指數(shù)大于80%，表明已經(jīng)達到完全腐熟。堆肥的成熟度和穩(wěn)定性通常可以互換使用，二者之間是同時進行的，堆肥的毒性物質(zhì)通常是由堆肥中的不穩(wěn)定微生物產(chǎn)生的，因此不能單一地通過某種指標對堆肥效果進行評價，而要綜合多種因素。

本研究結(jié)果表明，添加鹿糞和尿素處理的堆肥已經(jīng)充分腐熟，pH值顯堿性，C/N符合堆肥標準，對大豆種子萌發(fā)未見顯著影響。在堆肥中期和腐熟階段共鑒定出64種微生物，真菌類群中子囊菌門為主要門類，細菌中厚壁菌門、放線菌門、變形菌門為主要門類，總共包括16種有益菌，其中大部分為根際促生菌。本研究不僅為后續(xù)栗園廢棄物堆肥發(fā)酵技術的優(yōu)化和改善提供基礎，還可從中發(fā)掘有益菌用于腐熟或抗病菌劑的研發(fā)和利用。

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