張雨萌

徐 芳2

姚雨含2

李晨陽(yáng)2

趙 軍2

(1. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046;2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830004)

小茴香(Foeniculumvulgare)為傘形科茴香屬草本植物茴香的干燥成熟果實(shí),具有散寒止痛、理氣和胃的功效,主要含有揮發(fā)油、生物堿、黃酮、脂肪酸、甾醇和糖苷等多種類型的化合物[1]。小茴香揮發(fā)油主要含有單萜類化合物和苯丙烷類化合物,具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、增加胃腸蠕動(dòng)等作用。小茴香揮發(fā)油中主要成分為反式茴香腦、D-檸檬烯、γ-萜品烯、茴香酮、雌蒿腦、茴香醛。反式茴香腦在小茴香揮發(fā)油中的含量可達(dá)到65%～80%[2],此類化合物呈油狀具有強(qiáng)烈的茴香香味,存在易揮發(fā)、不穩(wěn)定、對(duì)光線和溫度敏感等性質(zhì),容易氧化分解變質(zhì),給揮發(fā)油的貯藏、使用以及開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)極大不便[3]。

目前,揮發(fā)油多選β-環(huán)糊精進(jìn)行包合,β-環(huán)糊精利用分子作用力將揮發(fā)油包嵌進(jìn)空腔結(jié)構(gòu)形成包合物,可明顯提高其穩(wěn)定性,克服揮發(fā)性,改善水溶性,降低刺激性氣味,以便揮發(fā)油更好地在生產(chǎn)生活中使用。鄭燕菲等[4]采用飽和水溶液法以包合收率為指標(biāo),利用β-環(huán)糊精包合八角茴香油制備包合物。謝媛等[5]采用細(xì)胞破碎法以揮發(fā)油包合率和包合收率為指標(biāo),利用純膠包合小茴香揮發(fā)油制備包合物。已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)小茴香包合物中揮發(fā)油的控制指標(biāo),大多為傳統(tǒng)的包合率和包合收率,對(duì)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)鑒定不夠全面。研究擬通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到可提高小茴香揮發(fā)油包合率和包合產(chǎn)率的包合工藝,并通過(guò)掃描電鏡法、薄層色譜法、傅立葉紅外光譜法、差示掃描量熱法4種方法對(duì)包合物進(jìn)行鑒定,以期將該工藝方法推廣應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小茴香:河北百合健康藥業(yè)有限公司;

β-環(huán)糊精:北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司;

反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)品:成都曼斯特生物科技有限公司;

無(wú)水乙醇、石油醚:分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;

甲醇:色譜純,賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備儀器

高效液相色譜儀:LC-10ATvp型,島津上海實(shí)驗(yàn)器材有限公司;

恒溫磁力攪拌器:85-2型,江蘇金怡儀器科技有限公司;

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:SU8010型,日立科學(xué)儀器北京有限公司;

差示掃描量熱儀:DSC 404F3型,耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)上海有限公司;

傅立葉紅外光譜儀:70 RAM II型,浙江賽德儀器設(shè)備有限公司;

澄明度檢測(cè)儀:YB-2型,天津大學(xué)精密儀器廠;

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):TGL-16型,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 小茴香揮發(fā)油制備 采用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮發(fā)油。小茴香粉碎過(guò)10目篩,稱取500 g小茴香粉末置于圓底燒瓶中,按料液比1∶12 (g/mL)加蒸餾水浸泡4 h,加熱提取5 h。收集蒸餾液,加入約0.1 g/mL的無(wú)水硫酸鈉干燥,隨后過(guò)濾得到揮發(fā)油,得率為1.9 mL/100 g。小茴香揮發(fā)油為淡黃色透明油狀物,有輕微的辛辣味,將其置于-20 ℃下貯藏備用。

1.2.2 小茴香揮發(fā)油包合物制備工藝研究

(1) 包合物制備:采用飽和水溶液法[6],其流程如下:

β-環(huán)糊精8 g→加入6倍量的蒸餾水→磁力攪拌50 ℃→攪拌溶解→揮發(fā)油1 mL用無(wú)水乙醇4 mL溶解緩慢逐滴加入→恒溫?cái)嚢? min→冷卻至室溫→4 ℃冷藏24 h→抽濾→石油醚沖洗3次每次1 mL→室溫放置過(guò)夜→自然揮干→小茴香揮發(fā)油包合物

(2) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)文獻(xiàn)[3]以及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定表1所示的因素及數(shù)值對(duì)包合物制備的影響較大。設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化小茴香揮發(fā)油包合物制備工藝條件。

表1 小茴香揮發(fā)油包合物制備工藝正交試驗(yàn)因素水平表

(3) 包合物中反式茴香腦含量測(cè)定:適量稱取小茴香揮發(fā)油包合物,置于10 mL容量瓶中,用無(wú)水乙醇定容,于60 ℃下超聲處理10 min使包合物中的揮發(fā)油充分溶解,取出部分溶液加入2 mL EP管中,于16 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min,取上清液,用0.45 μm的有機(jī)相濾頭過(guò)濾,供高效液相色譜(HPLC)測(cè)定反式茴香腦含量。

(4) 包合物中含油率測(cè)定:稱取小茴香揮發(fā)油包合物,置于500 mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水300 mL,按(2020版《中國(guó)藥典》四部通則)測(cè)定回收的揮發(fā)油含量,至油量不再增加時(shí)停止加熱,放置1 h,讀取油量即可。

(1)

式中:

c——揮發(fā)油空白回收率,%;

m1——收集到的揮發(fā)油質(zhì)量,g;

m2——加入揮發(fā)油質(zhì)量,g。

(6) 小茴香揮發(fā)油及包合物中反式茴香腦含量測(cè)定:采用HPLC法,根據(jù)文獻(xiàn)[7]修改如下:Shim-pack×C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)和水(B)梯度洗脫;梯度洗脫條件:0～19 min為70%～80% A,20～25 min時(shí)為80%～90% A;流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品溶液的配制:取適量反式茴香腦對(duì)照品,精密稱定后,用無(wú)水乙醇稀釋溶解配制成質(zhì)量濃度為9.60 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用無(wú)水乙醇定容搖勻,按照上述的色譜條件進(jìn)樣,記錄峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=81 823 535.493X+20 181.300,(R2=0.999);線性范圍為0.096～9.60 μg/mL。

(7) 包合率、包合產(chǎn)率及綜合評(píng)分計(jì)算:包合率為衡量包合效果的主要指標(biāo),權(quán)重系數(shù)定為0.5,反式茴香腦是包合物中揮發(fā)油的主要成分,反式茴香腦含量越高,說(shuō)明包合物中的有效成分含量高,因此權(quán)重系數(shù)定為0.3。包合產(chǎn)率在實(shí)際生產(chǎn)中可反映包合效率,權(quán)重系數(shù)定為0.2[8]。根據(jù)式(2)、式(3)和式(4)分別計(jì)算包合率、包合產(chǎn)率和綜合評(píng)分。

(2)

(3)

(4)

式中:

E——包合率,%;

采用HRV時(shí)域分析和頻域分析法，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析。HRV時(shí)域指標(biāo):① 全部竇性心搏RR間期的標(biāo)準(zhǔn)差(SDNN)；② 連續(xù)24 h正常RR間期標(biāo)準(zhǔn)差的均值(SDNN index)；③ 全程相鄰RR間期之差的均方根值(rMSSD)；④ 全程相鄰心搏RR間期之差值>50 ms的心搏數(shù)占心搏總數(shù)的百分比(pNN50)。頻域分析指標(biāo):低頻功率(LF)、高頻功率(HF)。

m3——包合物中實(shí)際含油質(zhì)量,g;

m4——制備包合物時(shí)加入揮發(fā)油的質(zhì)量,g;

F——包合產(chǎn)率,%;

m5——包合物的質(zhì)量,g;

m6——制備包合物時(shí)加入β-環(huán)糊精的質(zhì)量,g;

H——綜合評(píng)分;

G——反式茴香腦含量,%;

Emax——包合率的最大值,%;

Fmax——包合產(chǎn)率的最大值,%;

Gmax——反式茴香腦含量的最大值,%。

1.2.3 小茴香揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物表征

(1) 掃描電鏡(SEM)觀察:根據(jù)文獻(xiàn)[9]。稱取β-環(huán)糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物各1.0 mg,在電鏡下觀察。

(2) 薄層色譜(TLC)分析:將包合物按1.2.2(4)中的方法提取包合的揮發(fā)油。以茴香醛為對(duì)照,量取包合前的揮發(fā)油和最佳工藝下制備的包合物中提取出的揮發(fā)油各0.5 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇稀釋至刻度。再取包合物30 mg置于2 mL EP管用無(wú)水乙醇充分溶解,取上清液。參考《中國(guó)藥典》2020版一部,小茴香的鑒別方法,分別吸取上述樣品5 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚—乙酸乙酯(17∶2.5)為展開(kāi)劑,展開(kāi)、取出、晾干,噴以5%二硝基苯肼溶液,日光至斑點(diǎn)顯現(xiàn)。

(3) 紅外光譜(IR)掃描:根據(jù)文獻(xiàn)[10]。取揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物適量,揮發(fā)油以溴化鉀涂片法制備樣品,其余采用溴化鉀壓片法制備樣品,于500～4 000 cm-1波數(shù)范圍進(jìn)行紅外光譜掃描。

(4) 差示掃描量熱(DSC)分析:根據(jù)文獻(xiàn)[11]。稱取β-環(huán)糊精、物理混合物和最佳工藝下制備的包合物各5.0 mg,置于鋁制坩堝中,用差示掃描量熱儀進(jìn)行分析。測(cè)定參數(shù)設(shè)置:氮?dú)怏w積流量40 mL/min,升溫速度10 ℃/min,升溫范圍30～480 ℃。

1.2.4 小茴香揮發(fā)油包合物穩(wěn)定性研究

(1) 光穩(wěn)定性試驗(yàn):分別稱取小茴香揮發(fā)油包合物各3份,每份5.0 g,密封于稱量瓶中,均照射10 d(強(qiáng)度4 000 lx),每隔5 d取樣測(cè)定包合率和反式茴香腦含量。

(2) 高溫試驗(yàn):分別稱取小茴香揮發(fā)油包合物各3份,每份5.0 g,用錫紙包封置于60 ℃恒溫干燥箱內(nèi)放置10 d,每隔5 d取樣測(cè)定包合率和反式茴香腦含量。

(3) 高濕試驗(yàn):分別稱取小茴香揮發(fā)油包合物各3份,每份5.0 g,密封于稱量瓶中,每3份在25 ℃環(huán)境下,置于相對(duì)濕度分別為75%(飽和氯化鈉)和90%(飽和硝酸鉀)的2個(gè)密閉容器中放置10 d,每隔5 d取樣測(cè)定包合率和反式茴香腦含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行3次,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,利用Origin 2023軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小茴香揮發(fā)油成分分析

如圖1所示,小茴香揮發(fā)油經(jīng)β-環(huán)糊精包合后,仍有清晰的反式茴香腦圖譜。經(jīng)測(cè)定,小茴香揮發(fā)油中反式茴香腦含量為(79.16±1.04)%,包合物中反式茴香腦含量為(6.81±0.11)%。

A. 反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)品 B. 小茴香揮發(fā)油 C. 小茴香揮發(fā)油包合物

2.2 空白回收率試驗(yàn)

通過(guò)3次平行試驗(yàn)測(cè)定小茴香揮發(fā)油的空白回收率,得到小茴香揮發(fā)油的空白回收率為83%。

2.3 包合工藝優(yōu)化

以綜合評(píng)分為指標(biāo)對(duì)小茴香揮發(fā)油包合物制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。由表2可知,對(duì)包合工藝影響程度大小順序?yàn)閾]發(fā)油與β-環(huán)糊精比例>包合時(shí)間>包合溫度,最佳工藝條件為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1∶8 (mL/g),包合溫度40 ℃,包合時(shí)間60 min。

表2 小茴香揮發(fā)油包合物正交試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

取小茴香揮發(fā)油1 mL,按最佳的包合工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得小茴香揮發(fā)油平均包合率為(96.90±1.76)%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)1.81%;包合產(chǎn)率為(93.61±0.62)%,RSD 0.67%;反式茴香腦含量為(6.81±0.11)%,RSD 1.62%,綜合評(píng)分為99.68,RSD<5%,該包合工藝穩(wěn)定可行。

由表3可知,揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例及包合時(shí)間對(duì)包合率有顯著影響(P<0.05),可能是由于β-環(huán)糊精用量對(duì)包合產(chǎn)率的影響較大;包合時(shí)間長(zhǎng),使得揮發(fā)油能夠更加充分地進(jìn)入β-環(huán)糊精內(nèi)部,有利于包合物的形成。

表3 綜合評(píng)分方差分析表

2.4 小茴香揮發(fā)油包合物表征

2.4.1 掃描電鏡觀察 分別取β-環(huán)糊精、物理混合物和包合物適量,經(jīng)導(dǎo)電膠粘樣、噴金鍍膜后,觀察其形貌特征。如圖2所示,β-環(huán)糊精為大分子的環(huán)狀低聚糖結(jié)構(gòu),在1 000放大倍數(shù)下,其質(zhì)地松散,表面粗糙,β-環(huán)糊精的形態(tài)較大[11],而物理混合物是與揮發(fā)油的簡(jiǎn)單混合物,因此與β-環(huán)糊精的形態(tài)差異不大。在2萬(wàn)放大倍數(shù)下,物理混合物中小茴香揮發(fā)油呈小顆粒分散在β-環(huán)糊精的表面及四周,并未進(jìn)入其內(nèi)部。在包合物的制備中,由于在磁力攪拌的作用下?lián)]發(fā)油小分子被打散進(jìn)入到β-環(huán)糊精空腔內(nèi)部使得其發(fā)生形態(tài)學(xué)變化。同時(shí),在攪拌的過(guò)程中由大顆粒塊狀的β-環(huán)糊精細(xì)化成了小分子,并且分布均勻,呈棱狀。從圖2F可以明顯地看出,揮發(fā)油已進(jìn)入β-環(huán)糊精分子內(nèi)部,說(shuō)明包合物的形成。

A. β-環(huán)糊精(1 000倍) B. 物理混合物(1 000倍) C. 包合物(1 000倍) D. β-環(huán)糊精(2萬(wàn)倍) E. 物理混合物(2萬(wàn)倍) F. 包合物(2萬(wàn)倍)

2.4.2 薄層色譜分析 通過(guò)查閱文獻(xiàn)[12]發(fā)現(xiàn)茴香醛為小茴香揮發(fā)油中標(biāo)識(shí)性成分,并在薄層中能很好顯現(xiàn),故選擇茴香醛作為對(duì)照品。如圖3所示,從藥材中提取得到的小茴香揮發(fā)油成分,與從包合物中提取得到的揮發(fā)油成分一致。包合物在薄層色譜與茴香醛相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)并未顯示,說(shuō)明揮發(fā)油已被包合在β-環(huán)糊精中[13]。

A. 小茴香揮發(fā)油 B. β-環(huán)糊精 C. 物理混合物 D. 包合物

2.4.4 差示掃描量熱分析 由圖5可知,β-環(huán)糊精在140 ℃的特征吸收峰是由于樣品表面的小分子水、內(nèi)部結(jié)晶水和小分子物質(zhì)的分解,310 ℃的熔融峰是由于β-環(huán)糊精的主鏈及交聯(lián)鍵的斷裂,350 ℃左右為β-環(huán)糊精的分解峰[16],主要為碳?xì)堄嗟慕到?在物理混合物中同樣能夠明顯地看到在140,310,350 ℃左右仍存在β-環(huán)糊精空腔中結(jié)晶水蒸發(fā)的吸熱峰、β-環(huán)糊精的熔融峰和分解峰,說(shuō)明物理混合物的結(jié)構(gòu)與β-環(huán)糊精的十分相似。但包合物在140 ℃左右出現(xiàn)的吸熱峰并不明顯,可能是由于包合在β-環(huán)糊精空腔中的揮發(fā)油將結(jié)晶水置換出來(lái)[17],推測(cè)形成了包合物。在310,350 ℃的吸收峰也較為平緩,是由于在形成包合物后β-環(huán)糊精的熱穩(wěn)定性提高。包合物與物理混合物呈現(xiàn)出不同的吸熱狀態(tài),表明包合物形成[18],與掃描電鏡和紅外光譜分析的結(jié)果一致。

2.5 小茴香揮發(fā)油包合物穩(wěn)定性

2.5.1 光穩(wěn)定性試驗(yàn) 由表4可知,在連續(xù)光照5 d后,包合物的外觀性狀,包合率和反式茴香腦含量基本保持不變,光照10 d后包合率和反式茴香腦含量發(fā)生較小變化,光照對(duì)包合物的影響較小[19]。

表4 包合物光照試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 高溫試驗(yàn) 由表5可知,包合物經(jīng)高溫試驗(yàn)后,其外觀發(fā)生明顯變化,由原本白色粉末變成微黃色,并且出現(xiàn)質(zhì)量減少的現(xiàn)象。在高溫下,由于揮發(fā)油的揮發(fā)性會(huì)從β-環(huán)糊精的空腔中溢出,使得包合物重量減輕,出現(xiàn)揮發(fā)油似的淡黃色,說(shuō)明包合物中的揮發(fā)油在高溫烘烤下會(huì)從內(nèi)部釋放,也說(shuō)明揮發(fā)油進(jìn)入到β-環(huán)糊精內(nèi)部。隨著高溫時(shí)間的延長(zhǎng),包合率及反式茴香腦含量相較于前5 d降低速率減慢,表明包合物具有一定的高溫耐受力。但是為了保證揮發(fā)油包合物的穩(wěn)定性以及反式茴香腦含量的穩(wěn)定,應(yīng)避免將包合物置于高溫下[20]。

表5 包合物高溫試驗(yàn)結(jié)果

2.5.3 高濕試驗(yàn) 由表6可知,相對(duì)濕度為75%時(shí),第5天包合物外觀性狀變化不太明顯,第10天外緣開(kāi)始潮解,呈結(jié)塊狀,吸濕性增加,包合率和反式茴香腦含量均有所降低。而相對(duì)濕度為90%時(shí),第5天包合物就出現(xiàn)明顯的結(jié)塊和粘壁現(xiàn)象,其包合率和反式茴香腦含量也明顯降低;第10天包合物出現(xiàn)吸濕溶解現(xiàn)象,呈黏稠狀,包合率和反式茴香腦含量顯著降低。說(shuō)明75%濕度下?lián)]發(fā)油的包合率和包合物中反式茴香腦含量變化不大,在90%的濕度下對(duì)揮發(fā)油包合率和包合物中反式茴香腦含量的影響較大,表明常溫干燥環(huán)境有利于小茴香揮發(fā)油包合物的穩(wěn)定[21]。

表6 包合物高濕試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

研究采用水蒸氣蒸餾法提取小茴香揮發(fā)油,通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定小茴香包合物中反式茴香腦含量。以β-環(huán)糊精為包合材料,以包合率、反式茴香腦含量、包合產(chǎn)率為指標(biāo),由正交試驗(yàn)優(yōu)化得到揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例1∶8 (mL/g),包合溫度40 ℃,包合時(shí)間60 min,在此工藝條件下的包合率為96.90%,包合產(chǎn)率為93.61%,反式茴香腦含量為6.81%,綜合評(píng)分99.68。該包合工藝操作簡(jiǎn)便。掃描電鏡觀察、紅外光譜分析、差示掃描量熱分析和薄層色譜分析發(fā)現(xiàn),揮發(fā)油已成功包合進(jìn)β-環(huán)糊精中,并形成了包合物。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明,小茴香揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物宜貯藏在常溫干燥密封的環(huán)境下。后續(xù)可將小茴香揮發(fā)油包合物作為保鮮劑、抗菌劑、制劑原料等應(yīng)用于食品、藥品中,研究小茴香揮發(fā)油包合物中有效成分是否發(fā)揮功效作用。