賴政煬 陸冬萍 符靖雯 翁健 方禧 朱凱業(yè)

基金項(xiàng)目：惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022CQ010019）。

作者簡(jiǎn)介：賴政煬（1994—），男，廣東深圳人，本科，工程師。研究方向：食品安全分析檢測(cè)。

通信作者：符靖雯（1985—），女，廣東惠州人，本科，高級(jí)工程師。研究方向：食品檢測(cè)，重金屬污染治理。E-mail：149002195@qq.com。

摘 要：通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)硒的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定大米中的總硒的方法。結(jié)果表明，在提取硝酸體積5 mL、微波消解最高溫度為160 ℃、微波消解功率為1 000 W、趕酸溫度為135 ℃條件下，硒的提取效率最高。經(jīng)準(zhǔn)確度與精密度驗(yàn)證，該方法測(cè)定結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；電感耦合等離子體質(zhì)譜法；微波消解；硒

Response Surface Methodology Optimization for Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination of Total Selenium in Rice

LAI Zhengyang， LU Dongping， FU Jingwen*， WENG Jian， FANG Xi， ZHU Kaiye

（Huizhou Agricultural Product Quality and Safety Supervision and Testing Center， Huizhou 516000， China）

Abstract： The selenium extraction conditions were optimized through single factor and response surface experiments， and a method for the determination of total selenium in rice by inductively coupled plasma mass spectrometry was established. The results showed that under the conditions of extracting 5 mL nitric acid volume， microwave digestion at a maximum temperature of 160 ℃， microwave digestion power of 1 000 W， and acid driving temperature of 135 ℃， the extraction efficiency of selenium was the highest. After verification of accuracy and precision， the measurement results of this method are reliable.

Keywords： response surface methodology; inductively coupled plasma mass spectrometry; microwave digestion; selenium

硒（Se）是人類生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的一種微量元素，具有多種生物學(xué)功能，如清除體內(nèi)自由基、提高機(jī)體免疫力、提高抗氧化水平等，可有效預(yù)防癌癥[1-2]。人體內(nèi)無(wú)法自行合成硒，必須通過(guò)食物攝入。雖然谷物中的平均硒含量與動(dòng)物源性食物相比較低，考慮到谷物作為主食在亞洲地區(qū)具有主導(dǎo)地位，因此富硒大米是亞洲人補(bǔ)硒的良好載體。常用的硒含量檢測(cè)方法有原子吸收光譜法[3]、原子熒光光譜法[4]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）法[6]等。目前農(nóng)作物中硒含量的測(cè)定主要依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》（GB 5009.93—2017）。

本研究在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93—2017的基礎(chǔ)上，利用微波消解具有污染小、時(shí)間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)大米中硒提取進(jìn)行條件優(yōu)化。以硝酸用量、微波消解最高溫度、微波消解功率、趕酸溫度為研究因素，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定加標(biāo)回收率，確定各個(gè)因素的影響水平，進(jìn)一步通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法[7]，優(yōu)化出最佳提取條件。用數(shù)據(jù)模型為農(nóng)產(chǎn)品痕量硒的測(cè)定提供有力支撐，進(jìn)一步做好農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全保障工作。

1 材料與方法

1.1 儀器

350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，鉑金埃爾默股份有限公司；MASTER 40微波消解儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；DS-360石墨消解儀，廣州格丹納儀器有限公司；純Mili-Q A10水儀，美國(guó)Millipore公司；BSA224S分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限；碾谷機(jī)，佛山市順德區(qū)歐雅西電器有限公司；DFY-800搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

1.2 試劑

濃硝酸（分析純），默克化工技術(shù)（上海）有限公司；硒元素標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒測(cè)定的方法》（GB 5009.93—2017）中總硒的測(cè)定方法，準(zhǔn)確稱取0.2 g的樣品于消解內(nèi)罐中，加入一定體積的硝酸，靜置1 h，旋緊罐蓋，依照微波消解儀標(biāo)準(zhǔn)操作步驟（表1），設(shè)計(jì)消解程序進(jìn)行消解。冷卻后取出，于電熱板上100 ℃趕酸30 min，定容至刻度線，待測(cè)上機(jī)。試驗(yàn)樣品為空白普通大米粉，加入適量濃度的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)濃度為0.4 mg·kg-1。

1.3.2 儀器條件

射頻功率：1 350 W；等離子體氣：氬氣，流量為16.0 L·min-1；載氣：氬氣，流量為0.92 L·min-1；輔助氣：氬氣，流量為1.2 L·min-1；定量離子：Se m/z為78；檢測(cè)模式：He碰撞模式；Ni采樣錐、Ni截取錐、Ni超級(jí)截取錐。

1.3.3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

取100 mg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，制成濃度為100 μg·L-1的硒標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、

2.5 mL、5.0 mL和10.0 mL硒標(biāo)準(zhǔn)中間液于50 mL容量瓶中，用硝酸（2%）溶液定容至刻度，混合均勻，配制成含硒濃度分別為0 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1和20.0 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）硝酸體積。準(zhǔn)確稱取空白大米0.2 g，加入硒標(biāo)準(zhǔn)中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在微波消解最高溫度為115 ℃，微波消解功率為1 200 W，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察硝酸體積（1 mL、

2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和7 mL）對(duì)硒提取效率的影響。

（2）微波消解最高溫度。準(zhǔn)確稱取空白大米

0.2 g，加入硒標(biāo)準(zhǔn)中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解功率為1 200 W，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察微波消解最高溫度

（100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃和180 ℃）對(duì)硒提取效率的影響。

（3）微波功率。準(zhǔn)確稱取空白大米0.2 g，加入硒標(biāo)準(zhǔn)中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解最高溫度為115 ℃，趕酸溫度100 ℃的條件下，考察微波功率（600 W、

800 W、1 000 W、1 200 W和1 500 W）對(duì)硒提取效率的影響。

（4）趕酸溫度。準(zhǔn)確稱取空白大米0.2 g，加入硒標(biāo)準(zhǔn)中間液80 μL，渦旋混勻，放置一夜。在硝酸體積為5 mL，微波消解最高溫度為115 ℃，微波消解功率為1 200 W的條件下，考察趕酸溫度（115 ℃、125 ℃、135 ℃、145 ℃和155 ℃）對(duì)硒提取效率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

為獲得最佳的參數(shù)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以回收率為指標(biāo)，利用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)微波消解最高溫度（A）、微波消解功率（B）、趕酸溫度（C）進(jìn)行優(yōu)化（表2）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Design-Expert 13.0軟件設(shè)計(jì)本次試驗(yàn)方案，通過(guò)對(duì)其數(shù)學(xué)模型的回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并得出結(jié)論。

1.5 測(cè)定3種質(zhì)控樣的總硒含量

運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最優(yōu)前處理?xiàng)l件，對(duì)

3種不同基質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)控樣進(jìn)行總硒含量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 硝酸體積對(duì)加標(biāo)回收率的影響

硝酸體積加標(biāo)回收率的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著提取體系內(nèi)硝酸濃度的增大，提取效率不斷提高，硝酸體積為5 mL時(shí)提取效率達(dá)到峰值，隨后趨向平緩。提取體系內(nèi)硝酸濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致消解不完全，使測(cè)定結(jié)果偏低。提取體系內(nèi)硝酸濃度過(guò)高時(shí)，酸的強(qiáng)揮發(fā)性不僅損害儀器，還會(huì)給人體和環(huán)境帶來(lái)一定的危害。綜合考慮提取效率和成本，選取硝酸體積5 mL搭建本次試驗(yàn)的微波消解體系。

2.1.2 微波消解最高溫度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

微波消解最高溫度對(duì)加標(biāo)回收率的影響如圖2所示。由圖2可知，微波消解最高溫度越高，加標(biāo)回收率越高。這是因?yàn)樵谖⒉ㄏ膺^(guò)程中，微波加熱試劑的同時(shí)，增壓迫使酸試劑和樣品充分接觸并最終迅速溶解樣品，所以溫度越高，消解越完全。然而，溫度過(guò)高會(huì)對(duì)消解罐造成較大的壓力，壓力主要來(lái)源于以下幾個(gè)方面。①大米本身是碳水化合物，含有碳、氫、氧3種元素，在消解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的CO2氣體。②消解使用的硝酸會(huì)被還原產(chǎn)生NO2氣體。③試劑及水在加熱升溫過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生一定的水蒸氣。3種氣體產(chǎn)生的臨界溫度不同，因此在消解反應(yīng)中，當(dāng)溫度升高到特定值時(shí)，密閉反應(yīng)體系內(nèi)壓力會(huì)迅速增加，輕則會(huì)影響元素的穩(wěn)定性，重則會(huì)造成消解罐爆罐，造成安全問(wèn)題。因此，基于消解效果和實(shí)驗(yàn)室安全，微波消解的最高溫度為160 ℃，此時(shí)達(dá)到消解效率與安全雙平衡。

2.1.3 微波功率對(duì)加標(biāo)回收率的影響

微波功率對(duì)加標(biāo)回收率的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)消解功率為600～1 000 W時(shí)，對(duì)消解效果的影響較大，隨后趨于平緩。這是因?yàn)槲⒉üβ手苯佑绊懴鉁囟?，進(jìn)而影響消解效果。微波功率高會(huì)加快升溫速率，保證微波消解儀能快速達(dá)到設(shè)定的溫度并保持穩(wěn)定，從而使樣品消解完全。微波消解功率在600～800 W時(shí)，低功率使得在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)無(wú)法升至設(shè)定的溫度，且保溫時(shí)間較短，導(dǎo)致樣品消解不完全。當(dāng)微波功率升至1 000 W以上時(shí)，可在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)升至設(shè)定的溫度并保持穩(wěn)定，樣品能夠完全消解。但過(guò)高的功率不僅會(huì)對(duì)微波消解儀和消解罐造成損壞，還可能造成樣品消解速率過(guò)快，使消解罐內(nèi)壓力迅速增高，有爆炸的風(fēng)險(xiǎn)，觸發(fā)安全裝置自動(dòng)放氣泄壓，導(dǎo)致微量元素?fù)p失。因此，綜合考慮消解效果和實(shí)驗(yàn)室安全，選取微波功率1 000 W搭建本次試驗(yàn)的微波消解體系。

2.1.4 趕酸溫度對(duì)加標(biāo)回收率的影響

趕酸溫度對(duì)加標(biāo)回收率的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)趕酸溫度為115～145 ℃時(shí)，硒元素的加標(biāo)回收率先增大后趨于穩(wěn)定，在145 ℃時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)镮CP-MS要求酸的濃度低于2%，酸濃度過(guò)高，黏度過(guò)大，影響霧化效果，從而影響信號(hào)強(qiáng)度。趕酸一般控制在1 mL左右，太干會(huì)導(dǎo)致待測(cè)元素?fù)p失嚴(yán)重，導(dǎo)致酸濃度過(guò)高從而抑制目標(biāo)元素，腐蝕儀器部件，背景噪聲大，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。趕酸溫度低于135 ℃時(shí)，3 h內(nèi)不能將試液中的硝酸趕至1 mL。在溫度為145 ℃時(shí)，趕酸時(shí)間控制在3 h內(nèi)，回收率最高。因此，基于消解效果和時(shí)間效率，應(yīng)將趕酸溫度控制在145 ℃以下。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用軟件Design Expert 13.0對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合數(shù)據(jù)分析，得到硒提取回收率（R）對(duì)微波消解最高溫度（A）、微波消解功率（B）、趕酸溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸模型為R=94.6-1.35A-1.2B-0.65C-0.275AB+0.975AC-0.625BC-15.26A2-6.11B2-7.91C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析（表4），模型P＜0.000 1，

說(shuō)明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同條件對(duì)回收率影響大小順序?yàn)锳＞B＞C，即微波消解最高溫度＞微波功率＞趕酸溫度。模型的決定系數(shù)R2為0.994 4，

說(shuō)明該方程擬合情況好，模型具有高顯著性；R2Adj=

0.987 2代表試驗(yàn)有98.72%響應(yīng)值變異，與預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)R2Pred相對(duì)接近，說(shuō)明該數(shù)據(jù)模型較為符合真實(shí)數(shù)據(jù)情況，試驗(yàn)誤差小，具備實(shí)際指導(dǎo)意義，可用該模型對(duì)最優(yōu)提取條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)面及最優(yōu)條件確定

根據(jù)Design Expert 13.0軟件運(yùn)行結(jié)果，最優(yōu)提取條件為微波消解最高溫度160.88 ℃、微波功率981 W、趕酸溫度134.6 ℃，在此條件下模型預(yù)測(cè)的最大加標(biāo)回收率是94.7%。結(jié)合實(shí)際參數(shù)設(shè)置，將提取條件優(yōu)化為微波消解最高溫度160 ℃、微波功率

1 000 W、趕酸溫度135 ℃，在此條件下，經(jīng)過(guò)5次加標(biāo)驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的實(shí)測(cè)值平均為0.383 6 mg·kg-1，與實(shí)際添加相對(duì)誤差小于5.0%，回收率為95.9%，比預(yù)測(cè)稍高，說(shuō)明通過(guò)該數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)模型優(yōu)化得到的提取條件具有提取效率高、真實(shí)可靠等特點(diǎn)，且具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)優(yōu)化的提取條件，將硒標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成不同濃度梯度進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=80.163x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

2.4 方法的準(zhǔn)確度

2.4.1 回收率及精密度

在富硒大米和普通大米中分別加入一定量硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品的硒含量分別為0.05 mg·kg-1、

0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1，每個(gè)樣品平行測(cè)定6次，考察其回收率及精密度，見(jiàn)表5。

由表5可知，普通大米的加標(biāo)回收率為92.0%～

97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.9%～4.9%。富硒大米的加標(biāo)回收率為88.0%～97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.5%～4.2%。說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度較好，重復(fù)性較好，準(zhǔn)確度滿足要求。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證

應(yīng)用本方法分別檢測(cè)質(zhì)控樣芹菜（標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)編號(hào)：GSB-26）、蒜粉（標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)編號(hào)：GSB-13）、湖南大米粉（證書(shū)標(biāo)號(hào)：GSB-23a），結(jié)果見(jiàn)表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各元素的測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)值置信區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度高。

3 結(jié)論

采用Design Expert 13.0軟件，通過(guò)單因素和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，確定了電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定大米中總硒含量的最優(yōu)提取條件：硝酸用量5 mL、微波消解最高溫度160 ℃、微波功率1 000 W、趕酸溫度135 ℃，此時(shí)大米中的總硒加標(biāo)回收率可達(dá)到95.9%。該方法方便快捷，準(zhǔn)確有效。

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