馬慶陽，楊俊卿，羅 文，羅 映，余華榮

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，重慶 410016)

目前治療抑郁癥的針對(duì)性藥物主要以5-羥色胺(serotonin，5-HT)再攝取抑制劑和去甲腎上腺素(noradrenalin，NA)再攝取抑制劑為主。近年來中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與抑郁發(fā)生發(fā)展的關(guān)系備受關(guān)注。5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LO)是催化花生四烯酸生成白三烯類(leukotrienes，LTs)的關(guān)鍵酶，LTs參與了神經(jīng)中樞與外周炎癥反應(yīng)過程，在氧化應(yīng)激過程中舉足輕重。5-LO抑制劑咖啡酸通過抑制5-LO的激活，抑制LTs的生成，減輕氧化應(yīng)激損傷，對(duì)大鼠海馬等組織損傷有明顯保護(hù)作用［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸對(duì)神經(jīng)元退行性病變有良好的保護(hù)作用［2］。Takeda 等［3－4］通過分析咖啡酸對(duì)強(qiáng)迫游泳致急性抑郁模型和冰水刺激致急性抑郁模型的行為學(xué)作用，預(yù)測(cè)咖啡酸可能有一定的抗抑郁作用。急性抑郁模型僅是模擬短時(shí)的抑郁狀態(tài)，Takeda等也僅是提出咖啡酸抗抑郁作用可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)的初步設(shè)想。本實(shí)驗(yàn)通過模擬各種慢性不可預(yù)見性輕度刺激，建立大鼠抑郁狀態(tài)模型，觀察5-LO抑制劑咖啡酸對(duì)大鼠抑郁狀態(tài)的作用，并從氧化應(yīng)激初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

咖啡酸(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，批號(hào):ZL1006010;鹽酸舍曲林(四川省百草生物藥業(yè)有限公司)，批號(hào):090202;測(cè)總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號(hào):20110221;丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，批號(hào):20110223;雙縮脲法總蛋白測(cè)試盒，批號(hào):20101110(均南京建成生物技術(shù)有限公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

自制曠場(chǎng)行為測(cè)試儀(100 cm×100 cm×50 cm木箱，內(nèi)壁與底面漆成黑色，底面分為5×5個(gè)正方小格);自制強(qiáng)迫游泳行為測(cè)試儀〔高50 cm，直徑30 cm，其內(nèi)水深30 cm，水溫24～26℃〕;恒溫水浴鍋;UV-3150紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 動(dòng)物、慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激大鼠抑郁模型建立及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0001。在實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，在此期間進(jìn)行撫摸以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)員的操作。造模前自由飲食飲水，室溫22～24℃，濕度40% ～70%，光暗周期12 h∶12 h。

60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，參考慢性不可預(yù)知的溫和型應(yīng)急模型和孤養(yǎng)模型并加以改進(jìn)［5］(后均稱慢性應(yīng)激)。正常對(duì)照組大鼠采用大籠飼養(yǎng)，每籠5只，正常進(jìn)食飲水，不給予任何刺激。其他5組大鼠每籠1只孤養(yǎng)，并接受21 d應(yīng)激刺激，刺激包括:冰水游泳(4～5℃，5 min)、熱水游泳(40℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、禁水食(24 h)、潮濕墊料(將水加入干凈木屑，充分混合直至潮濕后替換鼠籠內(nèi)干燥墊料)、束縛(自制束縛桶，塑料做成，長(zhǎng)20 cm，直徑10 cm，頭為直徑4 cm的出氣孔，中干及尾部直徑8 cm，尾部可開合，4 h)、晝夜顛倒(24 h)、異物刺激(經(jīng)消毒后3 cm×3 cm布條或石塊)和噪聲刺激(1500 Hz，92 dB，1 h)，實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心功能實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。每日隨機(jī)給予一種刺激，3 d內(nèi)不重復(fù)。21 d后，按照分組，分別ig給予生理鹽水、舍曲林5 mg·kg－1和咖啡酸10，30 和50 mg·kg－1，連續(xù)21 d。

1.4 曠場(chǎng)行為觀察

參照許晶等［6］所使用的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)方法，給藥21 d后進(jìn)行曠場(chǎng)(open-field test)行為觀察。在可見度5 m的黑暗情況下，將大鼠放在正中央格，觀察5 min內(nèi)活動(dòng)情況。以動(dòng)物穿越底面方塊數(shù)為水平活動(dòng)(crossing)得分，以直立次數(shù)為垂直活動(dòng)(rearing)得分，以初次在中央格停留時(shí)間為潛伏期(latent time)。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)曠場(chǎng)行為測(cè)試儀進(jìn)行徹底清潔。

1.5 強(qiáng)迫游泳觀察

給藥21 d后，參照Cryan等［7］所改良的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)方法并作改進(jìn)后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳(forced swimming)行為觀察。將大鼠放入水池，記錄300 s內(nèi)每10 s末大鼠行為(包括攀爬行為、游泳行為和靜止不動(dòng)行為)。攀爬行為指大鼠在泳池中沿著泳池內(nèi)壁使用前爪向上攀爬的行為;游泳行為指大鼠在泳池內(nèi)水平面上以及泳池內(nèi)四周游動(dòng);靜止不動(dòng)行為指大鼠除了為避免沒入水中而向上的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)外，無其他行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以靜止不動(dòng)行為所占百分比(percentage of immobility，PI)表示。

1.6 海馬SOD活性和MDA含量的測(cè)定

行為學(xué)觀察結(jié)束后，每組各取4只大鼠，斷頭后分離全腦，并在冰面上快速分離出海馬，用冰生理鹽水制成10 g·L－1勻漿。以黃嘌呤酶法測(cè)定SOD活性，以硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法。具體操作按照SOD和MDA試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 咖啡酸對(duì)慢性應(yīng)激大鼠的曠場(chǎng)行為的影響

表1結(jié)果顯示，曠場(chǎng)行為測(cè)試發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，慢性應(yīng)激模型組中央格停留時(shí)間顯著增加(P＜0.01)，水平活動(dòng)次數(shù)和垂直活動(dòng)次數(shù)顯著降低(P＜0.01)。與慢性應(yīng)激模型組相比，舍曲林5 mg·kg－1組的中央格停留時(shí)間顯著縮短(P ＜0.01)，水平活動(dòng)次數(shù)顯著增多(P＜0.01)，而垂直活動(dòng)情況無顯著差異?？Х人?～50 mg·kg－1組大鼠組中央格停留時(shí)間均顯著縮短(P＜0.01)，水平活動(dòng)次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，垂直活動(dòng)無顯著差異。

Tab.1 Effect of caffeic acid on latent time，rearing and crossing in open-field test in chronic mild unpredictable stress rats

2.2 咖啡酸對(duì)慢性應(yīng)激大鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)表明，與正常對(duì)照組相比，慢性應(yīng)激模型組大鼠靜止不動(dòng)行為顯著增加(P＜0.01)。與慢性應(yīng)激模型組相比，舍曲林5 mg·kg－1組的靜止時(shí)間顯著縮短(P＜0.01)?？Х人?10～50 mg·kg－1能顯著縮短抑郁大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間，且呈劑量依賴性(r=0.985，P ＜0.01)(表2)。

Tab.2 Effect of caffeic acid on percentage of immobility(PI)in depressive rats

2.3 咖啡酸對(duì)慢性應(yīng)激大鼠海馬組織SOD活性及MDA含量的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，慢性應(yīng)激模型組大鼠海馬SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P＜0.01)。與慢性應(yīng)激模型組相比，舍曲林能夠顯著升高大鼠海馬SOD活性，降低MDA含量(P ＜0.01);咖啡酸 10 ～50 mg·kg－1也能劑量依賴性地顯著提高 SOD 活性(r=0.926，P ＜0.01)，和降低 MDA 含量(r=0.982，P ＜0.01)。

Tab.3 Effect of caffeic acid on superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content in depressive rats

3 討論

慢性應(yīng)激可以引起人類及動(dòng)物的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能亢進(jìn)，進(jìn)而出現(xiàn)抑郁狀態(tài)［7］，本實(shí)驗(yàn)所建立模型是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究抑郁發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥物的主要模型之一。曠場(chǎng)行為測(cè)試可模擬抑郁患者行動(dòng)力下降、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制的狀況。本研究使用改良后的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，采用盲法檢測(cè)大鼠5 min內(nèi)每10 s末3種行為出現(xiàn)的頻率，通過本實(shí)驗(yàn)室前期研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，此方法與 Cryan等［7］提出的每5 s末檢測(cè)一次的方法結(jié)果無顯著差異，有一定可靠性和可行性;本實(shí)驗(yàn)中大鼠處于不動(dòng)狀態(tài)時(shí)間增長(zhǎng)，在一定程度上模擬了抑郁患者“行為絕望”的狀態(tài)，近似于情緒低落所表現(xiàn)的情況［8］。

本實(shí)驗(yàn)所采用的咖啡酸給藥劑量參照公認(rèn)大鼠5-LO 抑制劑的使用劑量(10 ～ 50 mg·kg－1)［9－10］。ig給予咖啡酸后，慢性應(yīng)激大鼠在曠場(chǎng)中央格的停留時(shí)間顯著縮短，水平活動(dòng)情況顯著增加，并在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)狀態(tài)減少，且呈劑量依賴性，表明咖啡酸對(duì)大鼠抑郁行為有明顯的改善作用，與Takeda等［3－4］采用強(qiáng)迫游泳和電刺激造成急性抑郁癥治療作用相似。研究證實(shí)抑郁患者記憶能力會(huì)伴隨治療得到恢復(fù)［11］。本研究顯示，ig給予咖啡酸后，海馬氧化應(yīng)激情況改善，說明咖啡酸的抗抑郁作用與氧化應(yīng)激有關(guān)。咖啡酸通過抑制5-LO激活，使海馬花生四烯酸代謝減慢，LTs釋放減少，而LTC4，LTD4和LTE4可與體內(nèi)一些重要受體結(jié)合，誘導(dǎo)海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生;因此，5-LO激活被抑制必然導(dǎo)致海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱，使得體內(nèi)調(diào)控氧化反應(yīng)的主要活性酶之一——SOD活性升高，從而使海馬損傷減輕，表現(xiàn)為MDA含量明顯降低［12］。由此可見，咖啡酸具有修復(fù)抑郁狀態(tài)所致海馬損傷的作用。但是，抑郁狀態(tài)與腦內(nèi)許多區(qū)域有關(guān)，咖啡酸除了對(duì)抑郁海馬的損傷修復(fù)外，對(duì)于其他部位的損傷是否具有修復(fù)作用需要進(jìn)一步深入研究。

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