周 敏,胡秋明

0引言

葡萄膜炎是一組累及虹膜、睫狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜為主的炎癥疾病總稱(chēng),是世界范圍內(nèi)致盲眼病之一。炎癥反應(yīng)在葡萄膜炎的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,其病因復(fù)雜,發(fā)病與細(xì)菌、病毒以及自身免疫性疾病密切相關(guān)[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)多聚體蛋白復(fù)合物,它在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要作用。NLRP3炎癥小體可識(shí)別外源性病菌入侵和內(nèi)源性細(xì)胞損傷的危險(xiǎn)信號(hào),激活、調(diào)控炎癥反應(yīng),抵抗感染與應(yīng)激損傷,但其過(guò)度激活則會(huì)導(dǎo)致組織的炎癥損傷[2-3]。目前,國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)表明,NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此,通過(guò)研究NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的作用,深入了解其在疾病發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制,通過(guò)干預(yù)NLRP3炎癥小體的活性,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度,從而減輕葡萄膜炎的癥狀和病情,這將為開(kāi)發(fā)新的治療思路和新藥物提供方向,也為葡萄膜炎的基礎(chǔ)研究和臨床治療新靶點(diǎn)提供重要的意義。本文將綜述其相關(guān)的研究進(jìn)展。

1 NLRP3炎癥小體

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族是一個(gè)重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRRs),當(dāng)識(shí)別微生物成分中的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)、損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)等時(shí),由內(nèi)源性應(yīng)激產(chǎn)生,觸發(fā)下游炎癥通路,以消除微生物感染和修復(fù)受損組織。NLRs家族蛋白含有共同的特征性結(jié)構(gòu)：C端富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeat,LRR)、中心核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain,NBD)及N端蛋白-蛋白作用結(jié)構(gòu)域(pyrin-like domain,PYD),其中具有可變性的PYD是NLRs家族蛋白不同亞型的區(qū)分標(biāo)志[4]。炎癥小體主要為Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein,NLRP),目前在葡萄膜疾病中研究最廣泛且最深入的是NLRP3炎癥小體。

1.1NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)及功能NLRP3作為先天免疫系統(tǒng)中的重要傳感器,通過(guò)形成NLRP3炎癥小體,激活caspase-1的超分子復(fù)合物來(lái)監(jiān)測(cè)外源性病原體入侵和內(nèi)源性細(xì)胞損傷并做出反應(yīng)。NLRP3炎癥小體由3個(gè)主要成分構(gòu)成：Nod樣受體蛋白3(NLRP3)、細(xì)胞凋亡相關(guān)的微粒蛋白(ASC)以及半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)。NLRP3是一個(gè)感受器蛋白,它能夠感知細(xì)胞內(nèi)的多種刺激信號(hào),包括感染、細(xì)胞應(yīng)激、氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷等,能捕獲危險(xiǎn)信號(hào)并啟動(dòng)下游免疫。ASC是一個(gè)適配蛋白,它能夠連接NLRP3和caspase-1,從而促進(jìn)炎癥小體的形成和活化。caspase-1是一個(gè)重要的炎癥介導(dǎo)酶,能夠切割和激活多種炎癥因子,誘導(dǎo)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟;或通過(guò)膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[5-6]。

PRRs啟動(dòng)的天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵御病原體入侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的第一道防線(xiàn)[3,7]。NLRP3是細(xì)胞質(zhì)中重要的PRR,同樣具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：LRR結(jié)構(gòu)域、中心核苷酸結(jié)合域(NACHT)以及含有CARD的凋亡相關(guān)顆粒蛋白(ASC)的氨基端熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)。LRR結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用,還參與維持NLRP3的穩(wěn)定性：生理?xiàng)l件下,NACHT與LRR結(jié)合使NLRP3炎癥小體處于抑制狀態(tài)。NACHT結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合核苷酸和水解ATP的能力,激活后,能通過(guò)ATP依賴(lài)的自身寡聚化,產(chǎn)生PYD相互作用,進(jìn)一步招募連接蛋白ASC。PYD通常以同型方式相互作用,調(diào)控下游信號(hào)[8]。

ASC包含N端PYD和C端caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)。它通過(guò)同型PYD-PYD相互作用被招募到寡聚化的NLRP3分子的簇狀PYD上,形成ASC有核細(xì)絲。這些有核細(xì)絲聚集ASC的C端CARDs,作為連接效應(yīng)分子caspase-1的平臺(tái)[9-11]。caspase-1由N端的CARD、大的催化亞基p20和C端的小的催化亞基p10組成[12]。激活后的caspase-1能夠切割并激活負(fù)責(zé)細(xì)胞焦亡的gasdermin D(GSDMD)[13-14],并將IL-1、IL-18促炎細(xì)胞因子裂解為成熟的促炎細(xì)胞因子,對(duì)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)至關(guān)重要[15-17]。

1.2NLRP3炎癥小體的激活NLRP3炎癥小體的激活受到嚴(yán)格的調(diào)控,其激活機(jī)制極其復(fù)雜。迄今為止,研究表明NLRP3炎癥小體可通過(guò)3種不同的信號(hào)通路被激活。

1.2.1經(jīng)典N(xiāo)LRP3炎癥小體激活途徑經(jīng)典激活途徑需要兩個(gè)步驟：“啟動(dòng)”和“激活”。首先,NLRP3通過(guò)識(shí)別PAMPs或DAMPs參與免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子來(lái)啟動(dòng)。在啟動(dòng)階段,Toll樣受體、細(xì)胞因子受體或NLRs的配體可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,促進(jìn)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)[18]。當(dāng)“啟動(dòng)”NLRP3后,通過(guò)引起離子流(如K+外排[19]、Cl-外排[20]、Na+內(nèi)流[21]、Ca2+信號(hào)失調(diào)[22]等)、線(xiàn)粒體功能障礙、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和線(xiàn)粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的釋放[23-25]、溶酶體破裂和反式高爾基體解聚[26]等多種分子和細(xì)胞途徑,從而激活炎癥小體。

1.2.2非經(jīng)典N(xiāo)LRP3炎癥小體激活途徑研究表明,NLRP3炎癥小體激活還存在一條caspase-11(人體內(nèi)caspase-4和caspase-5)依賴(lài)的非經(jīng)典N(xiāo)LRP3炎癥小體信號(hào)通路[27-29]。在小鼠巨噬細(xì)胞中,啟動(dòng)信號(hào)對(duì)于非經(jīng)典炎癥小體的激活是必不可少的,然而在表達(dá)caspase-4的人類(lèi)細(xì)胞中,啟動(dòng)信號(hào)對(duì)于非經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激活并不是必需的[30-31]。最近的研究表明,當(dāng)革蘭氏陰性菌感染后,干擾素誘導(dǎo)蛋白IRGB10以鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GBP)依賴(lài)的方式直接靶向細(xì)菌的細(xì)胞膜,破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)完整性,并將配體LPS和類(lèi)脂A釋放到細(xì)胞質(zhì)中[32-33]。LPS和類(lèi)脂A可直接結(jié)合鼠源caspase-11的CARD結(jié)構(gòu)域或人源caspase-4和caspase-5,導(dǎo)致caspase寡聚化和自溶[30],而活化的caspase-4/5/11蛋白可水解小鼠gasdermin D(GSDMD)的Asp276 (人GSDMD的Asp275)位點(diǎn),釋放N端結(jié)構(gòu)域,與胞膜上的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸酯和磷脂酰絲氨酸結(jié)合,誘導(dǎo)孔道形成和細(xì)胞焦亡[14,34]。

1.2.3選擇性NLRP3炎癥小體激活途徑新的研究還發(fā)現(xiàn)了另一種的NLRP3炎癥小體激活途徑,即選擇性NLRP3炎癥小體途徑。在該途徑中,單獨(dú)的TLR配體不足以激活caspase-1或誘導(dǎo)人和豬單核細(xì)胞中IL-1β的成熟和分泌[35]。選擇性通路需要通過(guò)上游的TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8信號(hào)通路激活,也需要NLRP3-ASC-caspase-1信號(hào),但這種新的炎癥小體缺乏經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑相關(guān)特征。有研究表明,載脂蛋白C3(ApoC3)能激活人單核細(xì)胞中caspase-8依賴(lài)的選擇性NLRP3炎癥小體。ApoC3能通過(guò)TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2軸與Tlr2和Tlr4相互作用誘導(dǎo)其異源二聚化,進(jìn)而促進(jìn)Ca2+內(nèi)流、ROS產(chǎn)生、NADPH氧化酶和caspase-8活化[36-37],但caspase-8與NLRP3炎癥小體激活以及作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究與探索。

2葡萄膜炎

2.1流行病學(xué)及現(xiàn)狀葡萄膜炎是一組累及虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜、葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管以及玻璃體的眼部炎癥性疾病,其引起的眼部并發(fā)癥包括并發(fā)性白內(nèi)障、滲出性視網(wǎng)膜脫離、視神經(jīng)萎縮、青光眼等,是造成視力損害和失明的重要原因[38-42]。當(dāng)前,未能及時(shí)治愈的葡萄膜炎嚴(yán)重威脅著患者的視力健康。在全球,5%-10%的視力損害由葡萄膜炎引起,據(jù)統(tǒng)計(jì),葡萄膜炎在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率約為(17-52)/100000人年,患病率為(38-714)/100000人[43-44]。

2.2葡萄膜炎癥性質(zhì)的分類(lèi)按炎癥的性質(zhì),葡萄膜炎可分為感染性與非感染性。感染性葡萄膜炎主要與細(xì)菌、病毒、結(jié)核、弓形蟲(chóng)、寄生蟲(chóng)等因素有關(guān);而非感染性葡萄膜炎主要與自身免疫有關(guān),一般會(huì)合并有全身免疫性疾病,如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、多發(fā)性硬化等[1]。

3 NLRP3炎癥小體與葡萄膜炎

3.1NLRP3炎癥小體與Behcet病Behcet病(BD)是一種以口腔、生殖器、葡萄膜、皮膚等多種組織的動(dòng)靜脈同時(shí)受累的慢性、復(fù)發(fā)性炎癥為特征的全身多系統(tǒng)自身免疫性疾病[45]。目前對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但研究表明,NLRP3炎癥小體在Behcet病的發(fā)展中起到重要作用。Eun-So Lee團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了15例活動(dòng)期、15例穩(wěn)定期BD患者和15例健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),與健康對(duì)照組相比,BD患者的NLRP3炎癥小體在mRNA和蛋白水平上表達(dá)均顯著增加[46]。其中25例伴有結(jié)節(jié)性紅斑患者中NLRP3和ASC的表達(dá)增加明顯。眾所周知,IL-1β是一種獨(dú)特的促炎癥細(xì)胞因子,是自身炎癥性疾病的基礎(chǔ)[47]。IL-1β可通過(guò)TLR2/4和ROS-NLRP3炎癥小體依賴(lài)途徑,觸發(fā)肽聚糖和脂多糖參與Behcet病的發(fā)病[48]。在?z?ren的一項(xiàng)研究中,將Behcet病的患者分為血管型、皮膚黏膜型和眼部損害型,實(shí)驗(yàn)研究顯示：血管型受累的BD患者在LPS刺激后IL-1β和TNF-α水平高于眼部受累型、皮膚黏膜受累的BD患者和健康對(duì)照者[49]。同時(shí),這項(xiàng)研究也表明了不同類(lèi)型BD患者之間細(xì)胞因子分泌譜可能存在差異,揭示不同類(lèi)型的BD存在不同的發(fā)病機(jī)制。使用人源化的抗IL-1β抗體XOMA 052治療患有急性眼內(nèi)炎癥的BD患者,7例受治療的患者炎癥均減輕[50],這也證明了IL-1β在BD發(fā)病機(jī)制中確實(shí)發(fā)揮著重要的作用。而IL-1β作為NLRP3炎癥小體通路中分泌的重要炎癥細(xì)胞因子,這也表明未來(lái)有望通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥小體抑制IL-1β分泌從而減輕BD的炎癥反應(yīng)。在Tüzün團(tuán)隊(duì)的研究中還分析并探討了5例伴隨有神經(jīng)癥狀的Behcet病(NBD)患者在發(fā)作期和緩解期的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)樣本,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了DEFA1B和NLRP3蛋白基因表達(dá)顯著上調(diào)[51]。同時(shí),又在Hamzaoui等[52]的研究中得到證實(shí),檢測(cè)伴有神經(jīng)癥狀的NBD患者的腦脊液和血清分析發(fā)現(xiàn)IL-32和NLRP3炎癥小體在NBD患者中表達(dá)增加。NLRP3炎癥小體可能是IL-32釋放的重要介質(zhì),是潛在的治療靶點(diǎn)。在BD治療方面,一項(xiàng)RCT實(shí)驗(yàn)研究了關(guān)于補(bǔ)鋅對(duì)BD病患者NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用。在50例BD患者中發(fā)現(xiàn),3 mo的葡萄糖酸鋅補(bǔ)充(30 mg/d)對(duì)白細(xì)胞中NLRP3和caspase-1基因的表達(dá)明顯降低,并有效緩解了BD患者的炎性癥狀[53]?；谝陨涎芯恳脖砻?在未來(lái),調(diào)控NLRP3炎癥小體有望成為Behcet病治療的有效新靶點(diǎn)。

3.2NLRP3炎癥小體與Vogt-小柳原田綜合征Vogt-小柳原田綜合征(VKH)是一種自身免疫性疾病,以雙側(cè)肉芽腫性全葡萄膜炎為特征,全身受累包括白發(fā)癥、白癜風(fēng)、脫發(fā)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和聽(tīng)覺(jué)障礙等。其發(fā)病病因以及機(jī)制尚不完全清楚,可能與病毒感染以及免疫反應(yīng)有關(guān),但具體的機(jī)制并不是很明確[54-55]。在Liang等[56]的研究中,VKH患者在細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了異常的炎癥小體的激活,這些患者單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞(MDMs)產(chǎn)生IL-1β和ROS水平升高,下調(diào)NLRP3或抑制ROS均可抑制IL-1β的產(chǎn)生。因此,NLRP3的活化水平升高提示該炎癥小體在VKH綜合征發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著作用。然而,目前對(duì)于NLRP3炎癥小體在VKH中的作用和治療潛力的研究仍然缺乏,需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證NLRP3炎癥小體在VKH中的作用,并開(kāi)發(fā)出更有效的治療策略。

3.3NLRP3炎癥小體與內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎在眼表疾病以及眼前段炎癥中,NLRP3炎癥小體也發(fā)揮著重要的作用[57]。人類(lèi)急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis,AAU)的研究模型主要以?xún)?nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)動(dòng)物模型為主,它不是一種自身免疫過(guò)程,而是由注射細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖類(lèi)(LPS)觸發(fā)。在模型中,注射LPS(皮下或腹腔注射)后,在24 h內(nèi)可以觀(guān)察到快速但短暫的前葡萄膜炎[58-60]。該模型對(duì)于研究急性眼部炎癥感染過(guò)程的各個(gè)方面以及不同的治療干預(yù)措施非常有用。Rosenzweig等[61]通過(guò)采用免疫印跡法檢測(cè)NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-1β水平發(fā)現(xiàn)了：NLRP3、ASC和caspase-1蛋白在眼組織中呈組成性表達(dá),在EIU過(guò)程中,IL-1β蛋白產(chǎn)生增加,而且這需要caspase-1和NLRP3的共同存在。然而,敲除caspase-1或NLRP3基因的大鼠并沒(méi)改變EIU的嚴(yán)重程度。Lei等報(bào)道了一種新型抗炎小分子VVN001能有效抑制NLRP3炎癥小體的激活,減輕EIU小鼠炎癥反應(yīng)[62]。Ildefonso等[63]也研究了一種來(lái)自黏液瘤病毒的M013免疫調(diào)節(jié)蛋白。在EIU中,該蛋白能干擾NLRP3炎癥小體和NF-κB在內(nèi)的促炎信號(hào)通路,明顯減少玻璃體內(nèi)炎癥細(xì)胞的數(shù)量和顯著降低IL-1β的濃度。目前,NLRP3炎癥小體和EIU之間的具體作用機(jī)制仍然還不明確,這也是一個(gè)備受關(guān)注的研究領(lǐng)域。探索NLRP3炎癥小體在EIU中的激活途徑以及其作用機(jī)制對(duì)于該疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療方法具有重要意義。

3.4NLRP3炎癥小體與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是一種人類(lèi)內(nèi)源性葡萄膜炎的動(dòng)物模型,是通過(guò)視網(wǎng)膜S抗原(solubleanti-gen,S-Ag)、視網(wǎng)膜光感受器間維生素A類(lèi)結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoin-binding protein,IRBP)、視紫紅質(zhì)等自身抗原誘導(dǎo)EAU產(chǎn)生[58]。病變部位主要位于視網(wǎng)膜、葡萄膜,是常用的人類(lèi)非感染性葡萄膜炎的模型,與人類(lèi)的交感性眼炎、VKH和眼結(jié)節(jié)病等有相似的臨床特點(diǎn)和病理特征[64]。Kumar等[65]檢測(cè)了補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物(MAC)和NLRP3炎癥小體在正常和不能組裝補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物的C9/小鼠EAU發(fā)病機(jī)制中的作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MAC是EAU中NLRP3炎癥小體活化和IL-1β產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)因子。相反,MAC和NLRP3炎癥小體在C9/小鼠中沒(méi)有升高,更出乎意料的是,MAC的抑制劑sCD59的遞送成功地減弱了NLRP3炎癥小體的激活和減輕了EAU病理反應(yīng)。雖然,NLRP3炎癥小體的作用在葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中已被證實(shí),但機(jī)制并不明確,更多的研究者在探討其機(jī)制及調(diào)控通路。侯圣平的研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)了NLRP3可通過(guò)調(diào)控P-SIK1/SREBF1通路抑制AIM2炎癥小體介導(dǎo)的EAU,并突顯了靶向NLRP3的治療潛力[66]。樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)是抗原呈遞細(xì)胞,通過(guò)分泌IL-18和IL-1β參與T細(xì)胞活化和葡萄膜炎的致病過(guò)程。魏琳?qǐng)F(tuán)隊(duì)在EAU模型DC中發(fā)現(xiàn)可溶性CD83(sCD83)與GTP酶Ras相關(guān)蛋白(Rab1a)可相互作用,促進(jìn)Rab1a在自噬溶酶體中積累,并抑制mTORC1磷酸化和NLRP3表達(dá)。沉默Rab1a可降低活化DCs中NLRP3的表達(dá),而Rab1aQ70L過(guò)表達(dá)能夠恢復(fù)sCD83誘導(dǎo)的活化DCs中NLRP3的表達(dá)[67]。這為研究NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的作用機(jī)制提供了新思路。

4結(jié)語(yǔ)

綜上所述,本文通過(guò)闡明NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能、激活通路以及其與不同類(lèi)型的葡萄膜炎相關(guān)機(jī)制方面的研究,發(fā)現(xiàn)了NLRP3炎癥小體在人類(lèi)葡萄膜炎和動(dòng)物模型的葡萄膜炎中的異?；钚?下調(diào)NLRP3炎癥小體活性能有效緩解葡萄膜炎的炎癥反應(yīng),但其詳細(xì)的分子機(jī)制尚不明確。目前,葡萄膜炎的治療主要依靠抗炎藥物和免疫抑制劑等,但這些治療方法存在一定的局限性,未來(lái)可以通過(guò)深入研究NLRP3炎癥小體的激活、信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及與其他細(xì)胞因子的相互作用,進(jìn)一步明確NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的具體作用機(jī)制,并有望通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活通路上的相關(guān)炎性因子、基因和蛋白的表達(dá),成為葡萄膜炎基礎(chǔ)研究的新方向和臨床治療的新靶點(diǎn)。