蛋白組學在干眼研究中的應用進展

楊 穎,張嘉之,姬慧杰,高衛(wèi)萍

0引言

最新定義認為干眼是一種多因素的眼表疾病,其特征是淚膜失去穩(wěn)態(tài)導致一系列眼表癥狀,淚膜不穩(wěn)定、高滲、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常都參與其中[1]?！秶H淚膜和眼表協(xié)會干眼工作組發(fā)布第二版系列共識》認為干眼的核心機制是水分蒸發(fā)或損失引起眼表組織高滲損傷,導致上皮細胞和杯狀細胞的損失,從而進一步影響淚膜穩(wěn)態(tài)加劇高滲狀態(tài),形成惡性循環(huán)[2]。干眼的分子機制十分復雜,涉及免疫、炎癥等多種通路,如何從整體的角度深入分析,避免盲目實驗,為靶向治療提供依據(jù),也是亟待解決的問題。系統(tǒng)生物學可以從整體和全局的高度闡明生物體復雜的生理病理狀態(tài),主要包括：基因組學、微生物組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等。各類組學技術(shù)在干眼診療機制的研究受到廣泛應用和關(guān)注。國內(nèi)學者已總結(jié)了基因組學、微生物組學、代謝組學在干眼中的應用[3-5]。蛋白質(zhì)組學從生物樣本中分離和鑒定蛋白質(zhì),可以客觀準確地反映各樣本中的含量,為不同樣本蛋白質(zhì)水平的差異篩選提供了有效方法[6]。非靶向蛋白質(zhì)組學可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白變化,揭示新的生物標志物和疾病治療靶點[7]。雖然已有學者從檢測技術(shù)的角度總結(jié)了干眼蛋白組學的應用,但缺乏大樣本的研究支持[8]。本文將從干眼的發(fā)病機制入手,結(jié)合干眼的最新分類[9],綜述蛋白組學在干眼研究中的最新應用進展。

1檢測標本和常用技術(shù)

蛋白質(zhì)濃度為8-10 mg/mL的淚液因為無創(chuàng)采集且較易獲得[10],已成為干眼蛋白組學研究的常用標本。常用采集方法包括Schirmer試紙、玻璃毛細管、外科海綿等[11]。淚液蛋白根據(jù)含量不同可以分為三大類[7]：高含量組(mg/mL)蛋白由淚腺、瞼板腺、杯狀細胞和副淚腺分泌,包括溶菌酶(lysozyme, LYZ)、乳鐵蛋白(lactoferrin, LTF)、血清白蛋白(albumin, ALB)、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A, sIgA)、載脂蛋白-1(lipocalin1, LCN1)、親脂性蛋白、催淚蛋白(lacritin)和富含脯氨酸的蛋白質(zhì)(proline-rich proteins, PRR);中含量組(mg/mL到ng/mL)蛋白主要由細胞信號分子分泌;低含量組蛋白主要是細胞因子和生長因子蛋白。有限的淚液體積和大范圍波動的蛋白含量,對蛋白組學檢測的靈敏度提出了很高要求。值得注意的是,因為肽含量偏低和蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性,小分子的分泌蛋白如白細胞介素、細胞因子、趨化因子等較難通過質(zhì)譜等方式鑒定。因此,蛋白芯片技術(shù)[12]或酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法對這些免疫因子檢測更有效[13]。

目前蛋白質(zhì)組學的主流技術(shù)主要包括基于凝膠和色譜的分離技術(shù)和基于質(zhì)譜的分析技術(shù)[14]。干眼的蛋白組學技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離、變性裂解,基于凝膠或緩沖液進一步處理成小片段,最后進行質(zhì)譜分析。在處理過程中可以采用標記和非標記技術(shù)兩種。常用的標記技術(shù)包括傳統(tǒng)使用的基于二維凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組學分析[15],以及基于質(zhì)譜的同位素標記蛋白組學分析,比如使用同位素標記對肽段進行相對和絕對定量修飾的iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)技術(shù)[16]。標記定量蛋白組學敏感、準確性高,但對樣品及標記的要求高、試劑昂貴,無法應用于大規(guī)模蛋白分析。非標記定量蛋白組學是指比較的樣本無需標記[17],通過對比特定的肽段或蛋白在兩個不同樣本間質(zhì)譜信號的強弱,就可得到樣本間蛋白表達量的變化,可重復進行樣本實驗,適用于大規(guī)模蛋白分析,但是準確性不如標記定量技術(shù)。在干眼的蛋白組學研究中,這兩種方法都有廣泛應用[7]。

2參與干眼發(fā)病機制的關(guān)鍵蛋白和潛在蛋白標記物

2.1熱休克蛋白家族相關(guān)通路在氧化應激、高滲應激和干燥條件下,熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)-B上調(diào)。它激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路,進而激活應激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路,并增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α。這些炎性細胞因子刺激先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)。

2.2谷胱甘肽通路氧化應激、高滲應激抑制谷胱甘肽代謝,而谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶pi1蛋白可以重新激活谷胱甘肽代謝。

2.3過氧化物酶體增殖物激活受體途徑一方面,過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)可激活與糖脂代謝、碳水化合物相關(guān)的對干眼產(chǎn)生保護作用的重要基因。但在氧化和干燥應激下,NF-kB通路被激活,并阻斷PPAR信號傳導,炎癥基因表達并產(chǎn)生IL-17。在PPAR途徑中參與的蛋白有載脂蛋白A1/A2和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白。

2.4免疫相關(guān)途徑S100A8和S100A9都屬于S100鈣結(jié)合蛋白家族,通過T樣受體激活免疫體統(tǒng),改變眼相關(guān)淋巴系統(tǒng)的免疫耐受,并可通過激活MARK通路介導炎癥反應[18]。在S100A8和S100A9增加的情況下,APC轉(zhuǎn)化為成熟APC(mature APC, mAPC),激活Th1細胞釋放IL-17、IFN-γ、TNF-α。這些細胞因子刺激適應性免疫系統(tǒng),缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)/2α和HIF-1β基因被轉(zhuǎn)錄為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A、VEGF-C和其他血管生成蛋白。

既往關(guān)于干眼的蛋白組學研究中,2項以上的研究證實31種蛋白在干眼淚液中存在差異表達,這些蛋白和免疫、細胞修復、抗氧化、抗菌、眼表炎性等生物過程相關(guān),12種蛋白得到了獨立驗證并有望成為潛在的生物標記物[7]。12種獨立標記物中表達上調(diào)的有鈣結(jié)合蛋白S100A6/S100A8/S100A9、膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1,ANXA1)、α-1-酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1,ORM1)。鈣結(jié)合蛋白是由吞噬細胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì),在屏障功能和先天性免疫中發(fā)揮重要作用。炎癥、氧化應激、眨眼減少或其他環(huán)境因素可能是S100A8和S100A9表達增加的原因[18]。ANXA1是一種促炎介質(zhì),可調(diào)節(jié)滲透壓。ORM1是一種急性反應期蛋白,在機體出現(xiàn)炎癥、感染時增加。下調(diào)的蛋白比如LYZ、LTF、ALB、sIgA、LCN1等則是正常淚液中的主要蛋白成分。換言之,淚液正常蛋白組分的下調(diào)可能提示干眼的發(fā)生。

3蛋白標記物對干眼類型的鑒別作用

3.1脂質(zhì)異常型干眼國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9的表達與瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction, MGD)干眼的嚴重程度相關(guān)[19],并且這兩種蛋白的增加可能與MGD腺管上皮高度角化有關(guān)。然而Soria等[20]認為S100A8和S100A9并不能用來鑒別MGD干眼,甚至在MGD干眼呈現(xiàn)下降的趨勢,可能與MGD蛋白分泌整體下降有關(guān),同時提出由硫氧還蛋白、免疫球蛋白、磷脂酶A2蛋白、纖溶酶原激活物抑制劑、分泌性白細胞蛋白酶抑制因子和乳過氧化物酶蛋白組成的六個標記物組可以鑒別MGD干眼。

3.2水液缺乏型干眼Boehm等[21]報告了6種候選生物標志物蛋白,可用于鑒別水液缺乏型干眼,其中分泌蛋白疏脂蛋白A、C在水液缺乏和脂質(zhì)異常型干眼中呈現(xiàn)相反的變化趨勢,但在水液缺乏和混合性干眼中都存在PRR下調(diào)和S100A8上調(diào)[21-22]。研究者認為淚液體積的改變和淚膜成分的變化,是造成水液缺乏型干眼蛋白組學差異的主要原因,而在脂質(zhì)異常型干眼中,蛋白變化相對較小,僅僅是脂質(zhì)層的破壞,對于淚液蛋白表達的影響較小。

另有學者收集了淚腺導管開口處的淚液[23-24],發(fā)現(xiàn)其蛋白成分和眼表收集的淚液蛋白有明顯差異(1 448種vs1 165種),只有48%的蛋白成分是相同的[23]。在淚腺分泌不足和水液缺乏型干眼中,LYZ、LTF、LCN1均表達下調(diào)。而淚腺分泌不足時上調(diào)的差異蛋白多和細胞凋亡、免疫防御炎性過程相關(guān)。

3.3黏蛋白異常型干眼黏蛋白是一種高度糖基化的高分子親水蛋白家族[25]。淚膜的黏蛋白(mucins)主要包括分泌型黏蛋白(例如MUC5AC)和跨膜黏蛋白(例如MUC16)[26],參與維持淚膜穩(wěn)定。分泌型黏蛋白和淚膜的水液成分共同形成凝膠狀物質(zhì)覆蓋眼表,既可清除細胞碎片,又可發(fā)揮抗菌抗炎的屏障作用?？缒ゐさ鞍讋t在眼表形成細胞支架發(fā)揮抗黏附作用。在黏蛋白異常型干眼中,MUC家族蛋白表達顯著下降。國外學者等通過瓊脂糖凝膠電泳和化學發(fā)光檢測,使用多種抗體在淚液中檢測到MUC1、MUC4、MUC16和MUC5AC,這些蛋白可作為黏蛋白異常型干眼的生物標志物[27]。但是由于黏蛋白的糖基化水平很高和特異性抗體的形成受到限制,因此黏蛋白的定性和定量檢測仍有一定困難,也缺乏大樣本的研究[25]。

除了對類型進行鑒別,有些蛋白還具有臨床癥狀相關(guān)性。一項研究利用抗體芯片篩選出幾種干眼差異表達蛋白S100A6、MMP9和端粒結(jié)合蛋白cystatin S(CST4),并且與干眼程度相關(guān),體現(xiàn)在OSDI干眼問卷評分、Schirmer試驗、TBUT和熒光染色等方面[28]。CST4由淚腺和瞼板腺分泌,與干眼嚴重程度呈顯著負相關(guān),有望成為干眼嚴重程度分級的淚液穩(wěn)態(tài)標志物。

4蛋白組學的治療評價作用

在一項比較0.05%環(huán)孢素(cyclosporin A,CSA)和地夸磷醇四鈉(diquafosol tetrasodium, DQS)治療后的蛋白組學顯示,兩種治療方式都提高了先天免疫和獲得性免疫及細胞解毒反應[29]。內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)代謝和傷口愈合的調(diào)節(jié)在CSA治療中增加,在DQS治療中減少,而參與應激調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)反應、組織穩(wěn)態(tài)和防御反應則在CSA治療中下調(diào),在DQS治療中上調(diào)。和基線相比,DQS直接促進蛋白質(zhì)的分泌。

針灸作為在絕經(jīng)后婦女干眼的補充治療有很好的療效[30]。聯(lián)合治療組的癥狀評分改善優(yōu)于單純?nèi)斯I液組,蛋白組學結(jié)果顯示聯(lián)合治療組分泌蛋白增加,細胞質(zhì)蛋白豐度降低,免疫相關(guān)蛋白質(zhì)上調(diào),增殖相關(guān)蛋白下調(diào)。

5蛋白組學和代謝組學的聯(lián)合使用

國內(nèi)學者使用了一種非標記的納米級液體色譜與四極飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜光譜法進行干眼蛋白質(zhì)組學和代謝組學綜合分析[31]。作者發(fā)現(xiàn),淚液中表達變化的190種蛋白質(zhì)中有120多種與炎癥反應相關(guān)。關(guān)鍵的炎癥相關(guān)蛋白包括鋅α2糖蛋白、LYZ、LTF和CST4。而34種失調(diào)代謝產(chǎn)物具有抗炎和保護作用。代謝結(jié)果的網(wǎng)絡分析提示增強了先天免疫、補體和凝血反應的激活,以及糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、酪氨酸代謝和谷胱甘肽代謝。代謝變化與蛋白質(zhì)組學變化相呼應,表明代謝改變需要增加大量蛋白質(zhì)的合成。

6蛋白組學和微生物組學的聯(lián)合使用

在近期的一項研究中[32],國外學者使用全基因組鳥槍測序法檢測了40個干眼眼表樣本的微生物組學,并用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析了淚液蛋白組學,探討了兩者之間的關(guān)聯(lián)。比如干眼患者中的黏蛋白-16和不動桿菌的表達呈負相關(guān),眼表的細菌成分可能會影響淚液中黏蛋白的釋放。同時作者篩選出和眼表細菌相關(guān)且表達豐度最高的3種淚液蛋白：伴侶蛋白、抗砷性蛋白和解旋酶細菌蛋白。伴侶蛋白是在應激狀態(tài)下通過細菌感染表達的蛋白,抗砷性蛋白與細菌的氧化應激反應有關(guān),解旋酶細菌蛋白則與細菌的DNA復制有關(guān)。研究進一步證明在干眼的炎癥反應中,眼表微生物和淚液蛋白成分也存在相互作用和影響,也提示了眼表微環(huán)境對干眼發(fā)病的關(guān)鍵作用。

7結(jié)語

綜上,蛋白組學的先進技術(shù)提供了對淚液小樣本進行蛋白分析的可能,也為干眼的蛋白組學研究奠定了基礎(chǔ)。干眼的蛋白組學差異主要反映炎癥、細胞凋亡、免疫防御等機制,而其中高頻出現(xiàn)的蛋白比如鈣結(jié)合蛋白可以作為進一步研究的靶向生物標記物。不同類型的干眼體現(xiàn)出不同蛋白標志物的變化,比如在水液缺乏型干眼中,正常淚液蛋白含量下降,與干眼發(fā)病機制有一定的吻合。研究中的差異結(jié)果可能與不同研究人種有關(guān),而且無論哪種干眼都可能引發(fā)炎癥反應,導致炎癥相關(guān)蛋白增加,可能與干眼的不同發(fā)病階段也有關(guān)聯(lián)。目前,蛋白組學可應用于干眼生物標記物的鑒定、不同干眼類型的鑒別、干眼治療的療效評價,為我們理解干眼的發(fā)病機制提供了更加實際深入的循證依據(jù)。在各種組學的聯(lián)合應用和相互佐證下,干眼研究“如虎添翼”,蛋白組學有望在干眼的靶向治療中發(fā)揮更大的潛能。