紅曲霉強化發(fā)酵對黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)的影響

蔣四強，陳 功，李雄波，王澤亮，范智義，李 婷，李 恒，張其圣，鄧維琴,*

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院有限公司，四川 成都 611130；2.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；3.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030）

黃豆醬是我國著名傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一，主要由米曲霉制成的黃豆曲與一定比例鹽水均勻混合后長期發(fā)酵制得，具有醬香醇厚、酯香濃郁、咸甜適中的特點[1]。黃豆醬的發(fā)酵過程主要由制曲過程中微生物主導(dǎo)，其中以米曲霉為主，微生物通過代謝產(chǎn)生的多種酶系在一系列生化作用下生成多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[2]。米曲霉具有較強產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶的能力，在發(fā)酵過程中能充分將原料中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行分解，利于風(fēng)味物質(zhì)的生成，因此廣泛應(yīng)用于豆瓣、醬油、豆豉等傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中。但由于米曲霉單菌制得的黃豆曲中微生物種類較少，導(dǎo)致曲中酶系單一，不利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生?；炀鷱娀l(fā)酵是改善黃豆醬風(fēng)味品質(zhì)的有效方法，其可豐富發(fā)酵微生物的種類，產(chǎn)生更多酶系分解原料，進一步促進風(fēng)味物質(zhì)的形成。紅曲霉具有較強的糖化力和酯化力，而米曲霉相應(yīng)能力較弱，紅曲霉制曲后混合發(fā)酵豐富了體系中微生物和酶系種類，不僅利于原料的分解利用[3]，還能夠加快發(fā)酵速率，有助于提升產(chǎn)品的色澤、香氣和口感。

紅曲霉因具有較強的糖化力、酯化力和產(chǎn)紅色素能力，在酒類發(fā)酵中應(yīng)用比較廣泛，Zhao Chi等[4]利用紅曲霉發(fā)酵糯米酒，研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉在發(fā)酵早期占主導(dǎo)地位，并與酯類和醇類等風(fēng)味物質(zhì)具有較強的相關(guān)性，糯米酒顏色也得到明顯改善；同時，在酒類釀造前期加入紅曲對酒體品質(zhì)影響最顯著。除此之外，Li Meng等[5]在運用紅曲霉和米曲霉混合發(fā)酵苦蕎的研究中發(fā)現(xiàn)2-庚酮、3-甲基-1-丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇等主要揮發(fā)性香氣成分顯著增加。有學(xué)者在發(fā)酵醬油的研究中發(fā)現(xiàn)，相較于單菌發(fā)酵，先單菌制曲、再混合的成曲中各酶活力更佳，使發(fā)酵醬油中醇類、酚類以及雜環(huán)類風(fēng)味化合物含量得到顯著提升，并且在發(fā)酵后期通過加入紅曲米進行強化發(fā)酵，使特征風(fēng)味化合物含量增加1 倍[6]。Chen Zhiyao等[7]發(fā)現(xiàn)酯類、醛類、吡嗪類、含硫化合物等是紅曲霉混合強化發(fā)酵醬油中含量增加明顯的風(fēng)味化合物，且強化發(fā)酵后醬油的花香、焦香、果味和焦糖香得到顯著提升。

由此可見，通過紅曲霉強化發(fā)酵可以有效改善發(fā)酵豆制品的風(fēng)味品質(zhì)，可使主要特征香氣物質(zhì)含量得到顯著提升。但目前紅曲霉強化發(fā)酵工藝廣泛應(yīng)用于醬油和酒類等發(fā)酵制品中，在黃豆醬中應(yīng)用較少。因此，本研究通過改變黃豆醬發(fā)酵所用黃豆曲種類，利用紅曲霉制成黃豆曲與米曲霉黃豆曲進行混合強化發(fā)酵，探究紅曲霉強化發(fā)酵對黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為黃豆醬品質(zhì)優(yōu)化提供理論支撐和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

黃豆、面粉和食鹽均購自農(nóng)貿(mào)市場。米曲霉（郫釀M003）和紅曲霉（PM001）由四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院有限公司泡菜調(diào)味品與功能微生物研究中心進行篩選和鑒定，并均保藏于廣東微生物菌種保藏中心，保藏號分別為60927和60615。

1.1.2 曲精（郫釀M003）

將麩皮、豆粉和水按照一定比例均勻混合后，平鋪于培養(yǎng)篩上，放入自主研發(fā)的種曲機中，滅菌之后，接入種曲，進行擴大培養(yǎng)，經(jīng)干燥、真空上料、篩分和旋風(fēng)分離后得到曲精M003。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；無水乙醇、乳酸（均為分析純）成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8040三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 日本島津儀器公司；多功能自動進樣器 德國哲思泰公司；DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）美國安捷倫公司；15 mL頂空進樣瓶、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）裝置（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS萃取頭）美國Supelco公司；ESJ200-4A型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；臺式高速離心機 德國Sorval公司；VORTEX-2型旋渦混合器 美國Genentech公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉的活化

將紅曲霉接種于含10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇和2%乳酸的PDA平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，直到長出肉眼可見的紅色菌落。通過平板劃線將紅色菌落重新接種于含醇和酸的PDA平板上，重復(fù)劃線2 次，最后將紅曲霉單菌落接種于PDA斜面，30 ℃培養(yǎng)長出明顯紅色菌落后于4 ℃保存，供后續(xù)使用。

1.3.2 黃豆曲及黃豆醬的制作

1.3.2.1 紅曲霉黃豆曲的制作

稱取黃豆200 g置于70 ℃左右的溫水中浸泡4 h，瀝干后裝于2 L錐形瓶中，用8 層紗布封口后于121 ℃滅菌20 min；滅菌后將錐形瓶放入55～60 ℃烘箱中，將紗布烘干后取出，待黃豆溫度冷卻至常溫；向黃豆中加入15%的滅菌面粉（以黃豆干質(zhì)量計）；每個紅曲霉斜面中加入4 mL無菌水制成懸液，待面粉和黃豆均勻混合后加入紅曲霉懸液（每100 g黃豆加1 mL懸液），均勻混合，置于30 ℃培養(yǎng)箱制曲72 h后取出，置于無菌采樣袋中，于4 ℃短期保存，供后續(xù)使用。

1.3.2.2 米曲霉黃豆曲的制作

采用紅曲霉黃豆曲相同的前處理，將冷卻好的黃豆與15%的面粉和0.03%曲精M003均勻混合（以干黃豆質(zhì)量計，曲精與面粉提前混勻），平鋪于培養(yǎng)篩上，置于30 ℃培養(yǎng)箱制曲48 h后取出備用。

1.3.2.3 不同比例成曲黃豆醬的制作

分別稱取一定質(zhì)量黃豆曲，按照m（成曲）∶m（水）∶m（鹽）＝1∶1∶0.24均勻混合后，裝入發(fā)酵罐于40 ℃恒溫發(fā)酵40 d，每2 d攪拌1 次，并在0、2、4、6、8、10、20、40 d采樣，-20 ℃貯存，用于后續(xù)測定。樣品編號A0、A2、A4、A8、A10、A20、A40分別表示發(fā)酵0、2、4、6、8、10、20、40 d的黃豆醬A，其他黃豆醬編號以此類推。強化發(fā)酵黃豆醬質(zhì)量比例如表1所示。

表1 黃豆曲混合發(fā)酵條件Table 1 Conditions for pure and mixed culture fermentation of soybean koji

1.3.2.4 高通量測序

菌體富集：稱取30 g黃豆醬于200 mL燒杯中，用300 mL無菌水分批次稀釋黃豆醬，并用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，將水層倒入已滅菌?0 mL離心管中，2 500 r/min低速離心2 min，去除大分子雜質(zhì)，然后80 000 r/min離心10 min，倒掉水層，收集離心管底部菌體。

測序：將收集到的菌體送至上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司，提取總DNA后，使用引物338F（5’-3’：ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（5’-3’：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對細菌16S rRNA基因的V3～V4結(jié)構(gòu)區(qū)域進行擴增。真菌使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物ITS5（5’-3’：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS1（5’-3’：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴增。將擴增產(chǎn)物回收純化，進行熒光定量處理，使用Illumina MiSeq進行高通量測序。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.3.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量測定

參照李雄波[8]的方法進行測定。樣品前處理：精確稱取粉碎后的樣品2.000 g于固相萃取瓶中，加入2 mL飽和氯化鈉溶液，最后加入10 μL 0.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液（4-甲基-2-戊醇）并混勻。利用NIST 17數(shù)據(jù)庫（相似度大于80%）和人工圖譜共同對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行鑒定，采用內(nèi)標(biāo)進行半定量分析，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量按式（1）計算：

式中：A1為目標(biāo)物質(zhì)峰面積；ρ為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為內(nèi)標(biāo)添加體積/mL；A2為內(nèi)標(biāo)峰面積；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3.2 香氣活力值（odor activity value，OAV）

OAV參照秦炳偉等[9]的方法測定，按式（2）計算：

式中：Mi為i化合物的含量/（mg/kg）；Ci為i化合物在水中嗅覺閾值/（mg/kg）。

風(fēng)味閾值采用水相中風(fēng)味物質(zhì)的氣味閾值進行計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個樣品進行3 次重復(fù)實驗，在派森諾基因云平臺（https://www.genescloud.cn）完成對高通量數(shù)據(jù)的分析，運用Excel 2019、Origin 2021和SIMCA 14.1軟件對風(fēng)味數(shù)據(jù)進行處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉強化發(fā)酵對黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的影響

由圖1可知，單菌制曲發(fā)酵及混合強化發(fā)酵黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成和含量有明顯差異，黃豆醬A、B、C、D、E中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量分別為32.87、8.67、13.39、17.89、14.00 μg/g。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均低于其他4 種黃豆醬。

由表2可知，黃豆醬中包含35 種含量較高的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，主要包括芳香化合物1 種、醇類10 種、酚類2 種、醚類2 種、酸類3 種、醛酮類13 種、烯類1 種以及酯類3 種。紅曲霉單菌制曲發(fā)酵及其強化發(fā)酵的黃豆醬以醇類、芳香物質(zhì)、醛酮類為主，其中醇類物質(zhì)含量遠高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B，與張曉等[10]的研究結(jié)果相符。OAV表征某物質(zhì)對整體香氣的作用程度，一般認為OAV大于1，表示該物質(zhì)對香味有較大貢獻。由表3可知，黃豆醬中一共檢出39 種對香味具有重要作用的風(fēng)味化合物，主要為芳香族化合物、醇類、酚類、酸類、醛酮類以及酯類化合物。

表2 黃豆醬主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果Table 2 Content of major volatile flavor substances of soybean paste

表3 黃豆醬主要呈香揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 3 OAVs of main aromatic volatile flavor substances in soybean paste

醇類化合物是黃豆醬中含量較高的化合物，可賦予黃豆醬一定的花香和果香，同時也是酯化反應(yīng)的重要前體物質(zhì)[11]。1-辛烯-3-醇、芳樟醇、苯乙醇、異戊醇是主要醇類物質(zhì)，其中苯乙醇被鑒定為黃豆醬中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物[12]，而1-辛烯-3-醇為脂肪族不飽和醇，具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香，是一種天然香料[13]，使黃豆醬的口感更加柔和，兩者在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中含量較高，其次為混合強化發(fā)酵的黃豆醬D、E、C，在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中含量最低。

酸類物質(zhì)是黃豆醬風(fēng)味的重要組成成分，適宜的酸類物質(zhì)可以使黃豆醬香氣更協(xié)調(diào)，并且可通過酯化反應(yīng)促進酯類物質(zhì)的生成，但過多的酸類物質(zhì)則會使黃豆醬出現(xiàn)酸腐味，影響黃豆醬的品質(zhì)[14]?；旌蠌娀l(fā)酵黃豆醬C中酸類物質(zhì)含量最高（1.39 μg/g），米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中酸類化合物含量最低，僅為0.41 μg/g。乙酸、異丁酸和異戊酸是主要的酸類化合物，在混合強化發(fā)酵黃豆醬C中含量較高，分別為0.48、0.12、0.74 μg/g，與蒲靜等[15]的研究結(jié)果一致。通過分析OAV可知異戊酸和異丁酸對黃豆醬整體香氣有重要作用，因此混合強化發(fā)酵黃豆醬C風(fēng)味豐富度及協(xié)調(diào)性可能優(yōu)于其他黃豆醬。

醛酮類化合物賦予黃豆醬青草氣味、果實氣味、堅果氣味及脂肪氣味，香氣濃烈，對甜瓣子風(fēng)味有較大影響[16]。4-甲基-2-戊酮、二異丁基酮和異戊醛是黃豆醬中含量較高醛酮類物質(zhì)，紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E的醛酮類化合物含量均高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B，且對黃豆醬的整體香氣的構(gòu)成有一定作用。此外，3-辛酮、4-壬酮、壬醛等物質(zhì)對香氣組成作用明顯，但上述醛酮類化合物對米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B整體香氣的作用較小。

酯類化合物是形成黃豆醬風(fēng)味的重要組成成分，賦予黃豆醬獨特的酯香。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中酯類化合物含量最高（1.79 μg/g），而紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中酯類化合物含量較低，其中苯甲酸甲酯具有濃郁的冬青油香，對整體香氣具有重要作用，這與于茜雅等[17]的研究結(jié)果相符。由于酯類化合物可通過酯化反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)過程中會消耗酸類及醇類化合物，這可能是導(dǎo)致米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中醇類和酸類含量較低的原因之一。

黃豆醬中的芳香烴主要為對異丙基甲苯，雖然含量較低，但對黃豆醬香氣仍具有一定的貢獻。愈創(chuàng)木酚具有水果香、煙熏香，在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中含量較高，該物質(zhì)對發(fā)酵豆制品醬香的形成具有重要作用[18]。

綜上所述，米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的酯香較其他黃豆醬更濃郁，但其他風(fēng)味化合物含量較低，風(fēng)味特征不明顯。通過使用紅曲霉強化發(fā)酵，黃豆醬中芳香烴、醇類、醛酮類以及酸類物質(zhì)含量較米曲霉單菌制曲發(fā)酵（黃豆醬B）得到顯著提升。其中紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E含有較高的醇類、醛酮類和酸類物質(zhì)，但混合強化發(fā)酵黃豆醬C較其他強化發(fā)酵黃豆醬的酸類和酯類物質(zhì)含量更高，因此，混合強化發(fā)酵黃豆醬C可能風(fēng)味更協(xié)調(diào)，具有較好的風(fēng)味品質(zhì)。

2.2 黃豆醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析（principal component analysis，PCA）

為了進一步了解紅曲霉強化發(fā)酵對黃豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，對39 種主要呈香風(fēng)味化合物進行PCA，如圖2A所示。PC1和PC2累計貢獻率達到84.6%，可代表大部分風(fēng)味物質(zhì)的信息。黃豆醬A、B、C、D、E分布在4 個不同象限，說明5 種黃豆醬中風(fēng)味化合物存在較大差異。結(jié)合圖2B可知，異戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、2-乙基己醇、2-壬醇、苯酚、壬醛、檜烯等與PC1具有較高的正相關(guān)性，是紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中主要差異化合物；糠醇、3-甲硫基丙醇、2-甲基苯酚、辛醇以及2-辛烯-1-醇與PC1具有較高的負相關(guān)性，是混合強化發(fā)酵黃豆醬C中的主要差異化合物；而反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-酮、2-己酮和麥芽醇、苯甲酸甲酯異戊醛等分別為米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B和混合強化發(fā)酵黃豆醬D中的主要差異化合物。強化發(fā)酵黃豆醬E中的差異化合物主要為4-壬酮、2-壬酮。

圖2 PCA的得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 Score (A) and loading (B) plots of PCA

2.3 黃豆醬發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

Chao1和Shannon指數(shù)分別代表微生物物種的豐富度和多樣性，物種群落越豐富，Chao1指數(shù)越大；物種群落多樣性越高，Shannon指數(shù)越大。如表4所示，所有黃豆醬樣本中覆蓋率均在0.999以上，表明在此測序深度下所得的基因序列可基本覆蓋樣本中所有的微生物物種，所得數(shù)據(jù)可較為真實地反映樣本中微生物群落的組成情況。黃豆醬發(fā)酵過程中細菌的Chao1和Shannon指數(shù)分別分布在40.396～216.284和1.325 46～3.005 41；真菌的Chao1和Shannon指數(shù)分別分布在5.000～15.033和0.013 45～1.153 44。各發(fā)酵階段不同黃豆醬中細菌Chao1和Shannon指數(shù)均大于真菌，說明黃豆醬中細菌群落的豐富度和多樣性遠高于真菌群落，與任文博等[19]的研究結(jié)果一致。但不同黃豆醬在發(fā)酵過程中細菌群落的豐富度和多樣性有明顯區(qū)別，米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的Chao1指數(shù)高于其他黃豆醬，但Shannon指數(shù)低于紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A及混合強化發(fā)酵的黃豆醬，其中混合強化發(fā)酵黃豆醬C和D的Shannon指數(shù)最高，分別為2.783 61和3.005 41。說明米曲霉發(fā)酵黃豆醬在細菌豐富度上存在優(yōu)勢，但多樣性不及強化發(fā)酵的黃豆醬。米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B真菌豐富度高于強化發(fā)酵黃豆醬，而明顯低于強化發(fā)酵黃豆醬，其中混合強化發(fā)酵黃豆醬C中真菌Shannon指數(shù)達到1.153 44，高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B（1.052 64）。

表4 α多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity indexes

由此可見，相比于米曲霉制曲發(fā)酵，紅曲霉強化發(fā)酵黃豆醬在細菌和真菌多樣性方面具有較為明顯的優(yōu)勢。Mao Jingjing等[20]研究表明，發(fā)酵過程中細菌和真菌群落與多種風(fēng)味化合物之間存在著極顯著的正相關(guān)關(guān)系，強化發(fā)酵黃豆醬中相對較高的細菌和真菌多樣性可能會對豐富黃豆醬風(fēng)味物質(zhì)組成發(fā)揮一定的積極作用，這可能是導(dǎo)致米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B風(fēng)味物質(zhì)含量和種類不及強化發(fā)酵黃豆醬的原因之一，同時也說明紅曲霉對黃豆醬的菌群結(jié)構(gòu)有一定的影響。

2.4 黃豆醬發(fā)酵過程中細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

黃豆醬發(fā)酵過程中門水平細菌群落結(jié)構(gòu)組成如圖3A所示。厚壁菌門（Firmicutes）為黃豆醬發(fā)酵過程中絕對的優(yōu)勢菌門，其相對豐度在95.33%以上。在屬水平上，不同黃豆醬中細菌組成相似，芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）是主要優(yōu)勢菌屬，但在不同黃豆醬中菌群的相對豐度存在較大差異（圖3B）。在發(fā)酵初期，Bacillus是黃豆醬B發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢菌屬，其相對豐度在71.25%以上。Bacillus也是紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌屬；但隨著發(fā)酵的進行，Staphylococcus相對豐度逐漸上升，在發(fā)酵中后期成為優(yōu)勢菌屬，在發(fā)酵40 d的紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中其相對豐度達到93.08%。在傳統(tǒng)豆醬[21]和醬渣[22]中，Staphylococcus也是發(fā)酵后期的優(yōu)勢細菌屬。有研究發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus可以有效促進氨基酸代謝類風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，同時可以降低脂質(zhì)氧化類的形成速率[23]。紅曲霉單菌發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中存在較低相對豐度的Leuconostoc（0.90%～8.65%），且貫穿整個發(fā)酵過程。Wang Dahong等[24]發(fā)現(xiàn)Leuconostoc在豆制品發(fā)酵中有利于酯類、酮類以及酸類等風(fēng)味化合物的生成，對提升黃豆醬的風(fēng)味品質(zhì)有一定作用。但隨著Staphylococcus相對豐度的上升，Leuconostoc相對豐度逐漸下降，推測兩者之間可能存在競爭關(guān)系。由此可見，用紅曲霉制曲強化發(fā)酵對黃豆醬中的細菌多樣性及相對豐度有一定的影響，從而影響黃豆醬的品質(zhì)。

圖3 黃豆醬發(fā)酵過程中門水平（A）及屬水平（B）細菌菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Changes in bacterial floral structure at the phylum (A) and genus level (B) during the fermentation process of soybean paste

2.5 黃豆醬發(fā)酵過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，子囊菌門（Asomycota）為絕對的優(yōu)勢真菌菌門，相對豐度在99.78%以上。在屬水平上，不同黃豆醬中真菌組成相似，但相對豐度差異較大（圖4B）。紅曲屬（Monascus）、米勒酵母屬（Millerozyma）和曲霉屬（Aspergillus）是主要優(yōu)勢菌屬，其中Monascus出現(xiàn)在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A和混合強化發(fā)酵黃豆醬的發(fā)酵前期，Monascus在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A中相對豐度達到99.71%，在混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中其相對豐度分別為28.37%、48.58%和70.30%。發(fā)酵第2天，Monascus相對豐度開始下降，說明Monascus主要在發(fā)酵前期起作用。Monascus屬于好氧菌，對鹽不耐受，黃豆醬在含有12%鹽分的密閉條件下進行發(fā)酵，受氧氣含量[25]和鹽[26]的影響，Monascus的生長代謝減緩，導(dǎo)致相對豐度在發(fā)酵前期開始下降。Millerozyma在紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬A發(fā)酵2 d開始出現(xiàn)，到了發(fā)酵后期，Millerozyma取代Monascus成為優(yōu)勢菌屬，相對豐度為99.86%，混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中其相對豐度分別為41.40%、50.22%和39.78%，這與蔡琪琪等[27]的研究結(jié)果一致。同時，Millerozyma對黃豆醬發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有積極作用[28]，其相對豐度不同可能是導(dǎo)致不同黃豆醬中醇類物質(zhì)含量差異較大的主要原因之一。Millerozyma屬于兼性厭氧菌，能很好地適應(yīng)發(fā)酵罐中的缺氧條件，且有研究發(fā)現(xiàn)，Millerozyma在含鹽量為11%～14%的豆瓣醬中也是優(yōu)勢菌屬，說明Millerozyma具有一定的耐鹽性，這可能是Millerozyma在發(fā)酵中后期成為優(yōu)勢菌屬的主要原因。Aspergillus是米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B和混合強化發(fā)酵黃豆醬C、D、E中的優(yōu)勢菌屬之一，在發(fā)酵后期其相對豐度分別為53.21%、58.48%、49.74%和60.13%。研究表明，Aspergillus和Millerozyma共存時有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[29]。

圖4 黃豆醬發(fā)酵過程中門水平（A）及屬水平（B）真菌菌群結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Changes in the structure of fungal flora at the phylum (A) and genus level (B) during the fermentation process of soybean paste

2.6 微生物與風(fēng)味物質(zhì)生成的相關(guān)性分析

為了進一步了解黃豆醬發(fā)酵過程中微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系，通過對優(yōu)勢微生物和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)據(jù)進行同理化處理和相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示。Aspergillus和Bacillus是米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B中的主要優(yōu)勢菌屬，其中Bacillus與大多數(shù)醇類和酚類物質(zhì)呈顯著負相關(guān)（0.85＜|r|＜0.96），而與辛酸辛酯、γ-硬脂酸內(nèi)酯具有較強的正相關(guān)性（0.56＜r＜0.84），研究證明，在醬類食品的發(fā)酵過程中，Bacillus的代謝是影響豆醬發(fā)酵后期揮發(fā)性酯類含量的重要因素[29]。而Bacillus在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的發(fā)酵過程中相對豐度較高，這可能是導(dǎo)致其酯類化合物含量高于其他黃豆醬的原因。Aspergillus與4-甲基-2-庚酮、2-甲基-3-己酮和反-2-辛烯醛呈顯著或極顯著正相關(guān)（0.86＜|r|＜0.97）。Staphylococcus、Leuconostoc和Monascus是混合強化發(fā)酵組與米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B的主要差異微生物，其中Staphylococcus與黃豆醬中1-辛烯-3-醇、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、鄰苯二甲醚、3-羥基-2-丁酮及1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯呈顯著或極顯著正相關(guān)（r＞0.90），這與趙改名等[30]的研究結(jié)果一致。Leuconostoc與4-甲基-2-戊酮呈顯著正相關(guān)（r＞0.90），4-甲基-2-戊酮具有相對較低的風(fēng)味閾值和較為突出的草木味和果香味。Monascus則與1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、3-羥基-2-丁酮、鄰苯二甲醚、2,7-二甲基-4,5-辛二醇、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯等物質(zhì)呈顯著或極顯著正相關(guān)（r＞0.85），其在紅曲霉發(fā)酵的米酒中也有相似發(fā)現(xiàn)[31]，具有青草味、花香味、玫瑰味、草木香等氣味，這表明Monascus對黃豆醬中花草香氣的形成具有貢獻作用。由此可以看出，由差異微生物代謝產(chǎn)生的化合物對黃豆醬整體風(fēng)味具有較大的作用，而這些化合物可能是區(qū)別于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B風(fēng)味的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。Millerozyma主要與異戊醇呈顯著正相關(guān)（r＝0.92），與2.5節(jié)分析結(jié)果一致，雖然Millerozyma在米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬B發(fā)酵后期具有較高的相對豐度，但在發(fā)酵過程中產(chǎn)生以異戊醇為主的醇類化合物較少，因此，混合強化發(fā)酵的黃豆醬和米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬B在醇類風(fēng)味上有較大的區(qū)別。Faecalibaculum則主要與1-辛烯-3-醇、(2R,3R)-2,3-丁二醇、芳樟醇、苯乙醇、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二甲醚等物質(zhì)呈顯著負相關(guān)（0.85＜|r|＜0.95），說明Bacillus和Faecalibaculum不利于黃豆醬中花草香氣的形成。

圖5 微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between microorganisms and volatile flavor substances

3 結(jié)論

本研究將米曲霉和紅曲霉分別制成黃豆曲，以米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬作為對照，將兩種黃豆曲混合進行強化發(fā)酵黃豆醬，研究紅曲霉強化發(fā)酵對黃豆醬風(fēng)味化合物以及菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，紅曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬和混合強化發(fā)酵的黃豆醬中醇類、芳香類、醛酮類以及酸類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量遠高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬?；旌蠌娀l(fā)酵黃豆醬微生物多樣性遠高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬。混合強化發(fā)酵黃豆醬中Monascus、Millerozyma、Staphylococcus和Leuconostoc相對豐度顯著高于米曲霉單菌制曲發(fā)酵的黃豆醬，且這些差異微生物與醇類、芳香類、醛酮類風(fēng)味物質(zhì)具有較強的正相關(guān)性。綜上所述，紅曲霉混合強化發(fā)酵通過影響菌群結(jié)構(gòu)進一步影響風(fēng)味化合物的形成，使風(fēng)味化合物的種類及含量相較于米曲霉單菌制曲發(fā)酵黃豆醬更加豐富，其中米曲霉黃豆曲和紅曲霉黃豆曲按照3∶1質(zhì)量比混合強化發(fā)酵黃豆醬風(fēng)味更協(xié)調(diào)，具有更好的風(fēng)味品質(zhì)。因此，在黃豆醬的實際生產(chǎn)中，可以通過加入紅曲霉強化發(fā)酵提升黃豆醬的風(fēng)味品質(zhì)，達到改善黃豆醬品質(zhì)的目的。