長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種利用母乳低聚糖的分子機(jī)制及益生作用研究進(jìn)展

陳禹含，李巧慧，李 巖，蘇 倩，郭歡新，段勃帆，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

母乳能為嬰兒提供早期成長(zhǎng)所需的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及有助于嬰兒健康的許多生物活性物質(zhì)，如母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）、生物活性肽、免疫球蛋白、細(xì)胞因子、核苷酸、脂肪酸和活細(xì)胞等[1-3]。一些生物活性分子由乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，一些則由母乳中的細(xì)胞產(chǎn)生，而另一些則來(lái)自母體血清[4]。研究表明，母乳微生物群、免疫因子（如分泌型免疫球蛋白A、抗菌肽和蛋白質(zhì)）和HMOs可以塑造嬰兒腸道菌群，促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育，增強(qiáng)腸道屏障，維持小腸和大腸中超過(guò)百萬(wàn)億細(xì)菌的定植[5-6]。

HMOs在乳腺中合成，是母乳中最豐富的生物活性分子，也是母乳中第三大固體成分[7]。在初乳中HMOs的質(zhì)量濃度約為20～25 g/L，在成熟乳中約為5～20 g/L。目前已知母乳中含有超過(guò)200 種的HMOs，其他哺乳動(dòng)物的乳汁均達(dá)不到與母乳相同的HMOs豐度[8]。由于大多數(shù)HMOs對(duì)嬰兒胃腸道中的胃酸和消化酶有抗性，所以HMOs可以直接到達(dá)嬰兒結(jié)腸，影響嬰兒腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞反應(yīng)，也可以通過(guò)改變宿主腸道菌群組成和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物間接地調(diào)節(jié)嬰兒的免疫系統(tǒng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒因缺乏HMOs而比母乳喂養(yǎng)的嬰兒更容易患有一些兒童疾病，包括壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）、腸易激綜合癥、肥胖、過(guò)敏和濕疹[9-10]。近年來(lái)，在配方奶粉中添加HMOs成為熱點(diǎn)。一些母乳中大量存在的HMOs已被廣泛研究并可以通過(guò)基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

低物種多樣性和高變異性是嬰兒腸道菌群的主要特征。在出生后的前6 個(gè)月，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)單一、種類少。屬于放線菌門的厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌——雙歧桿菌，是利用HMOs的主要微生物，除此之外只有少數(shù)擬桿菌和乳桿菌可利用HMOs。嬰兒腸道內(nèi)的雙歧桿菌已進(jìn)化出一系列復(fù)雜的代謝途徑利用HMOs，要完全降解具有不同分子結(jié)構(gòu)的HMOs，需要一系列的糖苷酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)吸收、代謝和利用HMOs至關(guān)重要。代謝HMOs的相關(guān)基因幾乎只存在于嬰兒腸道相關(guān)的細(xì)菌基因組中，而在其他環(huán)境的菌群基因組中幾乎檢測(cè)不到[11]。

雙歧桿菌占母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道菌群的90%[11]，在母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群中占主導(dǎo)地位，雖然HMOs主要被雙歧桿菌利用，但這種能力并不是所有雙歧桿菌都具有。兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種（B.longumsubsp.infantis）是利用HMOs種類最多的兩個(gè)菌種，這兩個(gè)（亞）菌種可以利用由不同基團(tuán)修飾的不同結(jié)構(gòu)的HMOs[12]。而長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種（B.longumsubsp.longum）和短雙歧桿菌（B.breve）只能利用乳糖-N-四糖（lacto-N-tetraose，LNT）、乳糖-N-二糖（lacto-N-biose，LNB）和乳糖-N-新四糖（lacto-N-neotetraose，LNnT），無(wú)法利用被巖藻糖或唾液酸修飾的HMOs[13]。研究表明，B.longumsubsp.infantis是HMOs的最活躍利用者，能夠消耗總HMOs的64%，而其他菌種的利用率只在23%～43%[14]。并且B.longumsubsp.infantis優(yōu)先消耗HMOs而不是其他碳水化合物[15]，能夠在以HMOs為唯一碳源的培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)。本文針對(duì)B.longumsubsp.infantis能夠廣泛利用HMOs這一優(yōu)勢(shì)，綜述其代謝HMOs所需的糖苷酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體，根據(jù)其作用位點(diǎn)關(guān)聯(lián)相應(yīng)結(jié)構(gòu)的HMOs，描述B.longumsubsp.infantis對(duì)HMOs的利用方式，并總結(jié)B.longumsubsp.infantis代謝HMOs對(duì)嬰兒產(chǎn)生的益生作用，以期為探究HMOs與腸道菌群的互作機(jī)制以及該機(jī)制對(duì)嬰兒腸道發(fā)育和成熟的作用奠定基礎(chǔ)。

1 HMOs的組成和結(jié)構(gòu)

HMOs的組分及豐度受母體影響極大，不同地域、不同個(gè)體以及同一個(gè)體的不同哺乳期之間都有差異[7]。HMOs分子結(jié)構(gòu)和豐度取決于乳腺細(xì)胞中α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,2-fucosyltransferase，F(xiàn)UT2）和α-1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3/4-fucosyltransferase，F(xiàn)UT3）的表達(dá)[16]。FUT2負(fù)責(zé)通過(guò)α-1,2鍵連接L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）和D-半乳糖（D-galactose，Gal）末端，形成H-抗原雙糖結(jié)構(gòu)（fucal-2Galβ1-4GlcNAc-R）結(jié)構(gòu)或H-抗原結(jié)構(gòu)[17]。FUT3通過(guò)1型鏈上的α-1,4鍵連接Fuc和N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosaminide，GlcNAc）。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)由分泌基因（Secretor，Se）和路易斯（Lewis，Le）血型特征決定[18]。FUT2和FUT3分別由Se基因和Le基因編碼。根據(jù)Se和Le基因的表達(dá)，母乳分泌可分為4 種類型：FUT2與FUT3均活躍（Se+Le+）、FUT2活躍但FUT3不活躍（Se+Le-）、FUT3活躍但FUT2不活躍（Se-Le+）以及FUT2與FUT3均不活躍（Se-Le-）。因此，Se陽(yáng)性的母親乳汁中2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）含量豐富。相反，Se陰性母親的乳汁不含有α-1,2-巖藻糖基化的HMOs；Le陰性的女性不分泌含有α-1,4巖藻糖基化的HMOs，如乳糖-N-巖藻五糖II（lacto-N-fucopentaose II，LNFP II）。

HMOs一般由5 種糖基組成，分別為D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、Gal、GlcNAc、Fuc以及唾液酸（N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，NeuAc/Neu5Ac））（圖1A），聚合度（degree of polymerization，DP）在3～32之間[1]。HMOs的核心結(jié)構(gòu)由Gal和Glc組成（即乳糖結(jié)構(gòu)），常被Fuc、GlcNAc和NeuAc修飾[19]。如果HMOs的結(jié)構(gòu)中含有NeuAc，則被定義為酸性低聚糖。HMOs的主鏈可以被唾液酸化或巖藻糖基化，形成三糖結(jié)構(gòu)，如2’-FL，3-巖藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL），3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）和6’-唾液酸乳糖（6’-sialyllactose，6’-SL）（圖1B、C）。HMOs的還原末端乳糖基可通過(guò)由β-1,3或β-1,6鍵連接的乳糖-N-二糖（Galβ1-3GlcNAc-，LNB，I型鏈）或N-乙酰乳糖胺（N-acetyl-D-lactosamine，Galβ1-4GlcNAc-，LacNAc，II型鏈）進(jìn)行延伸。含II型鏈HMOs的含量比I型鏈少。I型或II型鏈可以通過(guò)β-1,4糖苷鍵進(jìn)行組合，形成LNT和LNnT，或是在不同環(huán)節(jié)中通過(guò)α-1,2、α-1,3或α-1,4鍵被巖藻糖基化，進(jìn)而通過(guò)α-2,3或α-2,6鍵唾液酸化，從而形成各種結(jié)構(gòu)的異構(gòu)體[20]，如乳糖-N-巖藻五糖（lacto-Nfucopentaose，LNFP）I、LNFP II、LNFP III、乳糖-N-二巖藻六糖（lacto-N-difucohexaoses，LNDFH）I、LNDFH II、唾液酸乳糖-N-四糖（LS-tetrasaccharide，LST）a、LST b和二唾液酸乳糖-N-四糖（disialyllacto-Ntetraose，DSLNT）（圖1D）。乳糖還可以通過(guò)β-1,3、β-1,4和β-1,6鍵連接半乳糖殘基，形成半乳糖基乳糖（galactosyllactose，GL），如3’-半乳糖基乳糖（3’-GL）、4’-半乳糖基乳糖（4’-GL）和6’-半乳糖基乳糖（6’-GL）（圖1E）。GL通常存在于人類初乳中，成熟乳中含量很低。通過(guò)β-1,6鍵連接形成有分支結(jié)構(gòu)的HMOs被稱為iso-HMO，沒有分支的線性結(jié)構(gòu)HMOs被稱為para-HMO[20]（圖1G）。僅含Glc、Gal和GlcNAc的中性核心結(jié)構(gòu)HMOs占總HMOs的42%～55%，中性巖藻糖基化HMOs占總HMOs的35%～50%，唾液酸化HMOs占總HMOs的12%～14%[21-22]。

圖1 HMOs的組成和結(jié)構(gòu)[1,11]Fig.1 Composition and structure of HMOs[1,11]

目前，仍有許多種結(jié)構(gòu)未知的HMOs，開發(fā)利用更先進(jìn)的新型分析技術(shù)，如基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜和多維核磁共振光譜等，將更有助于HMOs結(jié)構(gòu)的分析和測(cè)定[23-24]。糖基的連接方式擴(kuò)展了HMOs的多樣性，也造成了利用HMOs難度增加，僅有能夠表達(dá)相關(guān)糖苷酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)菌才能代謝HMOs。

2 B.infantis對(duì)HMOs的利用方式

雙歧桿菌是嬰兒腸道菌群中代謝HMOs最活躍的物種之一。經(jīng)鑒定，該屬菌株中存在許多能夠表達(dá)與代謝HMOs相關(guān)糖苷酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。雙歧桿菌已經(jīng)進(jìn)化出兩種利用HMOs的方式：一種依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（細(xì)胞內(nèi)消化）；另一種依賴胞外糖苷酶（細(xì)胞外消化）[11]。B.bifidum和一些B.longumsubsp.longum菌株缺乏完整的HMOs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此利用胞外糖苷酶在細(xì)胞外分解HMOs獲取單糖或雙糖，其余HMOs降解物被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步降解，而B.longumsubsp.infantis會(huì)通過(guò)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將完整的HMOs運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)降解[11,25-29]（表1）。2008年，隨著B.longumsubsp.infantis標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 15697完整基因組序列的公開，在該菌株中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)能夠反映B.longumsubsp.infantis對(duì)嬰兒宿主潛在適應(yīng)性的基因，包括與HMOs分解代謝相關(guān)的基因簇、細(xì)胞外溶質(zhì)結(jié)合蛋白和預(yù)測(cè)對(duì)HMOs有活性的滲透酶[30]。表2列舉了B.longumsubsp.infantis含有的利用HMOs的糖苷酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因。

表1 不同雙歧桿菌利用HMOs的方式Table 1 Ways of different bifidobacteria to utilize HMOs

表2 與B.longum subsp.longum代謝HMOs相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Table 2 Enzymes and transporters related to HMO metabolism in B.longum subsp.longum

2.1 參與利用HMOs的酶

為驅(qū)動(dòng)雙歧支路，雙歧桿菌進(jìn)化出了幾種對(duì)HMOs具有高特異性的糖苷酶和磷酸化酶。研究人員通過(guò)對(duì)所有已公開的B.longumsubsp.infantis全基因組序列進(jìn)行分析，挖掘出了多種參與利用HMOs的糖苷酶基因，這些與HMOs代謝有關(guān)的基因家族高度保守，涵蓋了水解HMOs結(jié)構(gòu)上幾乎全部連接鍵的功能[31]。

2.1.1 巖藻糖苷酶

負(fù)責(zé)去除HMOs中巖藻糖的酶被命名為巖藻糖苷酶，共有兩種：1,2-α-L-巖藻糖苷酶和1,3/4-α-L-巖藻糖苷酶。1,2-α-L-巖藻糖苷酶對(duì)Fucα1-2Gal-O-R高度敏感[33]，因此能靈敏識(shí)別2′-FL和LNFP I。此外，該酶還對(duì)LDFT、LNDFH I和3-FL也有一定的活性[34]。1,3/4-α-L-巖藻糖苷酶的獨(dú)特之處是它需要一個(gè)支鏈半乳糖殘基水解巖藻糖苷鍵。該酶采用了由半乳糖殘基與活性位點(diǎn)結(jié)合而觸發(fā)的誘導(dǎo)擬合催化機(jī)制[11]，可作用于LNFP II和LNFP III。

2.1.2 唾液酸酶（neuraminate exonuclease，NanH2）

NanH2是將NeuAc從核心結(jié)構(gòu)中分離出來(lái)的酶。NanH2作用于唾液酸化HMOs中的α-2,3和α-2,6糖苷鍵。B.longumsubsp.infantis產(chǎn)生的NanH2對(duì)這兩種鍵的水解能力幾乎相同[26]。研究表明，B.longumsubsp.infantis可以進(jìn)一步代謝酶解產(chǎn)生的Fuc和NeuAC[35]。

2.1.3β-半乳糖苷酶

經(jīng)巖藻糖苷酶和NanH2去除修飾物后，可以水解HMOs的核心結(jié)構(gòu)。對(duì)Gal起作用的酶有兩種。通過(guò)搜索雙歧桿菌的基因組，Yoshida等[27]發(fā)現(xiàn)了LNTβ-1,3-半乳糖苷酶，它可以特異性地將LNT水解為Gal和LNTri II，對(duì)LNT活性最強(qiáng)，其次是Lac、LNB和LNnT。此外，B.longumsubsp.infantis還能產(chǎn)生β-1,4-半乳糖苷酶[36]，HMOs中的Lac和II型鏈（Galβ1-4GlcNAc-O-R）是β-1,4-半乳糖苷酶的敏感靶點(diǎn)。

2.1.4β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

B.longumsubsp.infantisATCC 15697產(chǎn)生的3 種β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（Blon_0459、Blon_0732和Blon_2355）對(duì)LNTri II的水解能力很強(qiáng)。研究證明Blon_0459和Blon_0732可以利用去掉末端Gal殘基后的LNH，且對(duì)LNH中β-1,6鍵連接的GlcNAc殘基也有活性[28]。

2.1.5 GNB/LNB磷酸化酶

GNB/LNB 磷酸化酶是一種胞內(nèi)酶，能夠可逆地磷酸化GNB/LNB，生成α-半乳糖1-磷酸（α-Dgalactose1-phosphate，Gal1P）和N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）/GlcNAc[11]。在相同底物的GNB/LNB代謝過(guò)程中，磷酸化生成的Gal1P無(wú)需消耗ATP就可以轉(zhuǎn)化為果糖6-磷酸，這可以節(jié)省ATP的消耗[37]。Sakanaka等[11]對(duì)嬰兒腸道相關(guān)雙歧桿菌基因組進(jìn)行tblastn分析，發(fā)現(xiàn)在B.longumsubsp.infantis中編碼GNB/LNB磷酸化酶的基因流行率大于75%。

2.2 相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體

僅有糖降解基因的存在，并不能保證雙歧桿菌在HMOs存在時(shí)的生長(zhǎng)能力。如，干酪乳桿菌BL23（LactobacilluscaseiBL23）含有1 種可以水解2′-FL的α-巖藻糖苷酶基因，但它不能在2′-FL上生長(zhǎng)[38]，原因可能是L.caseiBL23缺乏2′-FL跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[15]。

B.longumsubsp.infantis通過(guò)幾種SBPs的介導(dǎo)，可以將完整的HMOs分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。B.longumsubsp.infantisATCC 15697是一個(gè)具有強(qiáng)大HMOs利用能力的典型菌株，該菌株具有編碼幾種細(xì)胞內(nèi)HMOs相關(guān)糖苷酶和用于腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）的SBPs的基因簇。Ward等[39]采用聚糖陣列通過(guò)對(duì)B.longumsubsp.infantisATCC 15697基因組SBPs的特異性分析，揭示了該菌株利用HMOs的轉(zhuǎn)運(yùn)方式。當(dāng)環(huán)境中有HMOs存在時(shí)，菌株相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因表達(dá)水平提高了數(shù)倍[40]。但相比于對(duì)糖苷酶的了解，目前對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的探究較為缺乏，只有LNB、FL和LNnT的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白得到了表征。

2.2.1 GNB/LNB轉(zhuǎn)運(yùn)體

GNB/LNB轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)由乳酸-N-生物酶在細(xì)胞外釋放出來(lái)的LNB和由α-N-乙酰半乳糖氨酶從黏蛋白O-聚糖釋放出來(lái)的GNB[41-42]。目前，對(duì)該轉(zhuǎn)運(yùn)體在B.longumsubsp.infantis中發(fā)揮作用的方式還有待研究。但Sakanaka等[11]進(jìn)行的tblastn分析結(jié)果表明，B.longumsubsp.infantis中編碼FL2-BP和GNB/LNB-BP的基因存在率高于FL1-BP和NahS。不同于全基因組測(cè)序只能在菌株中找到已知利用HMOs的基因的同源性，基因組文庫(kù)篩選和轉(zhuǎn)錄組分析不依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的特征基因，可以發(fā)現(xiàn)和表征隱含的利用HMOs的基因[13,43]。

2.2.2 FL轉(zhuǎn)運(yùn)體

FL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最早由Garrido[43]和Matsuki[44]等發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)運(yùn)體可以將2’-FL、3-FL、LDFT和LNFP I轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部。B.longumsubsp.infantisATCC 15697擁有兩個(gè)同源的FL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其SBPs具有60%的一致性。通過(guò)生化和結(jié)構(gòu)分析，明確了這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能重合，但又不完全相同[29]。Sakanaka等[11]從B.longumsubsp.infantisATCC 15697中鑒定出這兩種巖藻乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（FL transporter-1和FL transporter-2），發(fā)現(xiàn)FT-transporter-2可以導(dǎo)入復(fù)雜的HMOs（2’-FL、3-FL、LDFT和LNFP I），而FT-transporter-1負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)簡(jiǎn)單巖藻糖基化的HMOs（2’-FL和3-FL）。

2.2.3 LNnT轉(zhuǎn)運(yùn)體

James等[36]通過(guò)對(duì)在HMOs上生長(zhǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)行一系列靶向基因敲除，然后在添加了幾種HMOs的培養(yǎng)基中監(jiān)測(cè)突變體的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示NahS（LNnT-BP）是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)LNnT的SBP。

2.3 B.longum subsp.infantis對(duì)HMOs的代謝途徑

如圖2所示，B.longumsubsp.infantis將整個(gè)HMOs分子通過(guò)SBPs運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞內(nèi)糖苷酶及磷酸化酶參與HMOs的酶解過(guò)程，在細(xì)胞內(nèi)釋放出單糖[25]。對(duì)B.longumsubsp.infantis的蛋白組學(xué)分析表明，這些被降解后形成的單糖通過(guò)雙歧支路進(jìn)入到嬰兒腸道的中樞代謝途徑，最終產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）等代謝產(chǎn)物[45]。

圖2 已知B.longum subsp.infantis對(duì)HMOs的利用途徑[11]Fig.2 Utilization pathways of HMOs by B.longum subsp.infantis[11]

由于與HMOs代謝相關(guān)的基因簇存在明顯差異，通常HMOs的利用方式和代謝途徑高度依賴于特定的雙歧桿菌種類或菌株，雙歧桿菌的特定種或菌株對(duì)特定類型的HMOs利用能力也各不相同[46]。如B.longumsubsp.infantisJCM 1260因利用HMOs的基因簇缺失，所以在HMOs中生長(zhǎng)能力較弱[14]。消化結(jié)構(gòu)復(fù)雜的HMOs往往涉及多個(gè)基因簇的表達(dá)，高度相似的同源序列之間的微小差異也會(huì)導(dǎo)致相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的差異表達(dá)[1]。然而，到目前為止，并不是所有參與HMOs降解的基因都已被確認(rèn)[13]。Lawson等[46]分離出的雙歧桿菌菌株能夠在HMOs上生長(zhǎng)，但缺乏利用HMOs的已知基因簇，這表明存在未定性的代謝HMOs的基因。B.longumsubsp.infantis利用HMOs的途徑仍有待探索。

3 B.longum subsp.infantis代謝HMOs產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物

細(xì)菌代謝產(chǎn)物與宿主之間的互作是腸道菌群發(fā)揮益生作用的機(jī)制之一。HMOs經(jīng)腸道菌群發(fā)酵可以產(chǎn)生一些潛在的有益代謝產(chǎn)物。當(dāng)HMOs被腸道菌群分解代謝時(shí)，核心結(jié)構(gòu)乳糖會(huì)隨著修飾基團(tuán)的水解而釋放，經(jīng)雙歧支路及Leloir半乳糖代謝途徑產(chǎn)生能量并用于生命活動(dòng)[47]。同時(shí)，乳糖經(jīng)雙歧支路還會(huì)產(chǎn)生包括SCFAs在內(nèi)的多種有益代謝產(chǎn)物，能夠促進(jìn)嬰兒健康。被水解下來(lái)的各種糖基在胞代謝的途徑至今仍處于推測(cè)階段，研究十分有限。

3.1 SCFAs

B.longumsubsp.infantis可發(fā)酵HMOs產(chǎn)生SCFAs等，使腸道處于低pH值環(huán)境，有利于益生菌的生長(zhǎng)，抑制潛在的病原體[48]。SCFAs是研究最透徹的代謝產(chǎn)物之一，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。它們通常以高濃度存在于結(jié)腸中，并被腸上皮細(xì)胞吸收[1]。SCFAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)、分化、增殖和凋亡等過(guò)程改變細(xì)胞功能，激活G蛋白偶聯(lián)受體，抑制組蛋白去乙?；富钚砸约捌渌c缺氧誘導(dǎo)因子穩(wěn)定相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[1]。SCFAs還可以通過(guò)增加黏液蛋白的產(chǎn)生和增強(qiáng)腸道細(xì)胞水平的屏障功能直接影響腸道健康，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的腸道相關(guān)淋巴組織群體以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[48-49]。乙酸和丙酸都被認(rèn)為可以降低嬰兒哮喘的發(fā)生[50]，丁酸可以通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏蛋白及改善緊密連接的完整性，進(jìn)一步維持腸道屏障功能[51]。研究表明，SL和2’-FL在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的SCFAs譜，但SCFAs的總體濃度均有所提高[1]。B.longumsubsp.infantis代謝藻糖基化HMOs產(chǎn)生了甲酸[52]。Perdijk等[53]建立了體外發(fā)酵模型，發(fā)現(xiàn)SL與GOS相比可以大大提高丙酸的濃度。Frese等[54]的研究顯示，補(bǔ)充了B.longumsubsp.infantis的母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中，乳酸、乙酸、丁酸和甲酸的數(shù)量增加。

3.2 芳香氨基酸衍生物

B.longumsubsp.infantis通過(guò)芳香乳酸脫氫酶的作用，在嬰兒腸道中產(chǎn)生大量芳香乳酸，如色氨酸衍生的吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）[55]。色氨酸是人體必需氨基酸，一般由膳食蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生，小腸可以吸收大部分膳食來(lái)源的色氨酸，一小部分可到達(dá)結(jié)腸并被腸道菌群分解代謝轉(zhuǎn)化為各種分解代謝物[56]。體外分析證實(shí)，與乳糖相比，B.longumsubsp.infantis在HMOs上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的ILA數(shù)量明顯更多[57]。ILA是一種抗炎分子，可結(jié)合芳香烴受體和羧酸受體，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)，并阻斷炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-8的轉(zhuǎn)錄[55]。ILA途徑可以維持新生兒免疫的炎癥/抗炎平衡，阻止炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥損傷[58]。這些發(fā)現(xiàn)表明B.longumsubsp.infantis介導(dǎo)的氨基酸代謝途徑對(duì)早期免疫發(fā)育至關(guān)重要。

3.3 1,2-丙二醇（1,2-propanediol，1,2-PD）

巖藻糖基化的HMOs被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)B.longumsubsp.infantis細(xì)胞后分解為L(zhǎng)-巖藻糖，隨后經(jīng)一系列酶的作用，被轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮和乳醛，磷酸二羥丙酮隨后可以通過(guò)雙歧支路進(jìn)入中樞糖酵解途徑，而乳醛在厭氧條件下通過(guò)氧化還原酶轉(zhuǎn)化為1,2-PD[59]。研究認(rèn)為，1,2-PD或許可以作為B.longumsubsp.infantis代謝巖藻糖基化HMOs的標(biāo)志物，并且1,2-PD可以通過(guò)B細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)通路促進(jìn)B細(xì)胞的活化[59]。

4 B.longum subsp.infantis代謝HMOs產(chǎn)生的益生作用

由于母乳喂養(yǎng)不足，嬰兒早期腸道菌群容易失調(diào)，從而導(dǎo)致一些免疫介導(dǎo)的疾病發(fā)生。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，給母乳喂養(yǎng)的嬰兒補(bǔ)充B.longumsubsp.infantis可以促進(jìn)腸道的健康發(fā)育[54,60]，B.longumsubsp.infantis可以通過(guò)多種方式影響嬰兒腸道。但目前對(duì)HMOs介導(dǎo)的腸道菌群與嬰兒腸道互作知之甚少。

4.1 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)

由于缺乏必要的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)載體，大部分腸道細(xì)菌無(wú)法消化HMOs，這為專門消耗HMOs的有益細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了選擇性的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。作為代謝HMOs的主要微生物，B.longumsubsp.infantis已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的代謝HMOs途徑，在定植能力上比其他腸道細(xì)菌更具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。例如，與未補(bǔ)充B.longumsubsp.infantis母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便相比，補(bǔ)充了B.longumsubsp.infantisEVC001組糞便樣品表現(xiàn)出革蘭氏陰性菌和擬桿菌豐度降低的趨勢(shì)，并且內(nèi)毒素水平降低了4 倍[54]。這表明B.longumsubsp.infantis通過(guò)占據(jù)腸道生態(tài)位點(diǎn)及防止病原體侵入腸道，在腸道免疫功能中起到關(guān)鍵作用[59]。此外，B.longumsubsp.infantis代謝HMOs產(chǎn)生的如SCFAs等代謝產(chǎn)物，可以通過(guò)交叉喂養(yǎng)作用間接刺激其他有益菌的生長(zhǎng)，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

4.2 緩解免疫介導(dǎo)性疾病

腸道菌群及其代謝產(chǎn)物通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，對(duì)宿主的免疫穩(wěn)態(tài)起重要作用[61]。通常情況下腸道菌群介導(dǎo)的免疫平衡狀態(tài)既能抵抗外來(lái)細(xì)菌又能保持自身耐受性，當(dāng)腸道菌群發(fā)生改變時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而引起自身免疫性疾病。一項(xiàng)研究表明，在HMOs中生長(zhǎng)的B.longumsubsp.infantis可以通過(guò)T細(xì)胞刺激腸道上皮細(xì)胞的活性，促進(jìn)Caco-2細(xì)胞中抗炎細(xì)胞因子IL-10以及Caco-2細(xì)胞和HT-29細(xì)胞中黏附分子和緊密連接蛋白的表達(dá)[62]。與在葡萄糖和乳糖上生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，HMOs 3-FL促進(jìn)了B.longumsubsp.infantisATCC 15697在HT-29和Caco-2細(xì)胞系上的黏附[63]。具有較強(qiáng)的黏附性是菌株在腸道內(nèi)定植并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要前提。B.longumsubsp.infantis通過(guò)利用HMOs產(chǎn)生代謝物，在宿主體內(nèi)傳遞信號(hào)至免疫細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞等，對(duì)宿主免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[64]。這對(duì)免疫介導(dǎo)性疾病起到關(guān)鍵作用。

Huda等[65]的研究表明B.longumsubsp.infantis可能通過(guò)增強(qiáng)免疫記憶提高對(duì)病毒疫苗的保護(hù)作用，也有研究顯示LNT增加了新生兒輪狀病毒菌株的感染性[66]。Masi等[67]發(fā)現(xiàn)DSLNT與降低未滿月嬰兒患?jí)乃佬孕∧c炎的幾率有關(guān)。B.longumsubsp.infantis可以對(duì)炎癥因子和抗菌物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并通過(guò)降低腸道屏障通透性及提高緊密連接蛋白的表達(dá)以降低NEC的發(fā)病率[68]。Seppo等[69]的研究表明，在腸道菌群中含高水平B.longumsubsp.infantis的嬰兒患特應(yīng)性疾病的概率更低。Henrick等[70]發(fā)現(xiàn)B.longumsubsp.infantisEVC001能夠通過(guò)上調(diào)免疫調(diào)節(jié)因子——半乳糖凝集素-1以減少腸道中由輔助型T細(xì)胞（T helper cell，Th）2和Th17分泌的細(xì)胞因子，從而緩解母乳喂養(yǎng)嬰兒全身性炎癥和免疫失衡。

5 結(jié)語(yǔ)

HMOs的組成遠(yuǎn)比其他哺乳動(dòng)物乳汁中的低聚糖種類更豐富、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。B.longumsubsp.infantis已進(jìn)化出利用不同HMOs的獨(dú)特方式維持腸道微生物群的平衡。已知其通過(guò)多種特異性糖苷酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體將HMOs轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)水解，并通過(guò)雙歧支路將水解后的單糖運(yùn)送至中樞代謝途徑，但仍有許多與代謝HMOs相關(guān)的功能性基因沒有被發(fā)掘。B.longumsubsp.infantis通過(guò)利用HMOs產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)以及介導(dǎo)免疫性疾病，從而促進(jìn)嬰兒腸道發(fā)育、維持腸道健康。然而，對(duì)代謝物的研究大多聚焦在SCFAs，并未闡明B.longumsubsp.infantis代謝不同HMOs的潛在標(biāo)志物及代謝物中如氨基酸衍生物等其他發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的特定分子。

由于母乳資源的特殊性，提取具有特定分子結(jié)構(gòu)的HMOs并將其應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉始終是一個(gè)難題。近年來(lái)，通過(guò)細(xì)胞工程、化學(xué)酶法和化學(xué)合成等方法，2’-FL、3’-SL、6’-SL、LNT、LNnT和雙巖藻糖基乳糖的工業(yè)化生產(chǎn)取得了重大技術(shù)突破。在嬰兒食品中補(bǔ)充天然提取或人工合成的HMOs化合物已經(jīng)得到美國(guó)、歐盟、澳大利亞和其他地區(qū)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)[71]。隨著技術(shù)的提高，更多的HMOs將可能被用于工業(yè)化生產(chǎn)?；蚪M篩選技術(shù)的快速進(jìn)步擴(kuò)大了篩選利用HMOs基因的范圍，更有助于全面認(rèn)識(shí)HMOs的代謝過(guò)程。目前，已開展將HMOs作為益生元加入到嬰兒配方奶粉或?qū)㈦p歧桿菌與HMOs作為合生元一起加入到各種飲料中的研究。未來(lái)，仍需深入挖掘利用HMOs的基因，綜合評(píng)估嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌的益生特性，通過(guò)基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)等多種技術(shù)進(jìn)一步研究雙歧桿菌代謝HMOs的分子機(jī)制，探究嬰兒腸道菌群與HMOs的互作機(jī)制，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。