胡文朝　劉雪薇　鄭雄　姚佩　史單華　劉群龍　張小軍

摘 要：【目的】探究單寧酶處理對核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)含量的影響，為合理開發(fā)和利用核桃內(nèi)種皮提供科學依據(jù)?！痉椒ā恳浴S核桃內(nèi)種皮為試驗材料，進行單寧酶體外酶解試驗，測定分析不同酶解時間、底物濃度、酶添加量下內(nèi)種皮酚酸、黃酮類等酚類物質(zhì)含量變化?！窘Y(jié)果】添加單寧酶能有效分解內(nèi)種皮酯型兒茶素ECG，增加非酯型兒茶素EGC、EC含量與沒食子酸含量；單寧酶處理能明顯降解澀味物質(zhì)鞣花酸，同時顯著提高綠原酸含量?！窘Y(jié)論】分解酯型兒茶素、增加非酯型兒茶素與沒食子酸的最優(yōu)工藝為酶解時間5 h、底物濃度20 mg/mL、酶添加量1.2 mg/mL；提取綠原酸與降解鞣花酸的最優(yōu)工藝為酶解時間1 h、酶添加量1.2 mg/mL、底物濃度10 mg/mL。

關鍵詞：核桃內(nèi)種皮；單寧酶；黃酮類；綠原酸；鞣花酸

文章編號：2096-8108（2024）03-0036-06 中圖分類號：S664.1中圖分類號 文獻標識碼：A文獻標志碼

The Effect of Tannase on the Content of Phenolic Substances in Walnut Kernel Pellicle

HU? Wenzhao，LIU? Xuewei，ZHENG? Xiong，YAO? Pei，SHI? Danhua，LIU? Qunlong，ZHANG? Xiaojun*

（College of Horticulture， Shanxi Agricultural University， Taigu Shanxi 030801， China）

Abstract： 【Objective】To explore the effect of tannase treatment on the content of phenolic substances in walnut kernel pellicle and to provide scientific basis for rational development and utilization of walnut kernel parnel.【Methods】In this study， the kernel pellicle of ‘Hanfeng walnut was used as experimental material to conduct in vitro tannaseenzymolysis test， and the contents of phenolic substances such as phenolic acid and flavonoid were determined and analyzed under different enzymolysis time， substrate concentration and enzyme addition amount. 【Results】The addition of tannase could effectively decompose the ester-type catechin ECG of endotesta， increase the content of non-ester-type catechin EGC， EC and gallic acid. Tannase treatment could significantly degrade ellagic acid and increase the content of chlorogenic acid.【Conclusion】The optimal process for the decomposition of ester catechins and the increase of non-ester catechins and gallic acid are enzymatic hydrolysis time of 5 h， substrate concentration of 20 mg/mL， and enzyme addition of 1.2 mg/mL. The optimal process for extractionof chlorogenic acid and degrading of ellagic acid are enzymatic hydrolysis time of 1 h， enzyme addition of 1.2 mg/mL， and substrate concentration of 10 mg/mL.

Keywords：walnut kernel pellicle; tannase; flavonoids; chlorogenic acid; ellagic acid

核桃為胡桃科胡桃屬植物，又名胡桃、羌桃，是世界著名的“四大干果”之一［1］。核桃仁營養(yǎng)豐富，含有脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)［2］。核桃內(nèi)種皮中的酚類物質(zhì)含量較核桃仁更為豐富，主要包括類黃酮、苯醌、酚酸等活性成分，具有良好的抗氧化活性，有延緩人體衰老、健腦益智、降血糖、抗癌、抑菌等多方面功效［3-4］。

單寧酶又稱單寧酯酰水解酶或鞣酸酶，是由微生物在單寧酸存在的條件下誘導合成的一種細胞膜結(jié)合酶，可催化沒食子單寧、復合單寧與沒食子酸酯等化合物中酯鍵的水解，釋放沒食子酸［5-6］。單寧酶作為安全產(chǎn)品，多被用于脫除果實、茶飲品等中因單寧物質(zhì)產(chǎn)生的苦澀味，也可作為澄清劑改善飲料的外觀色澤與儲藏過程中產(chǎn)生的渾濁問題［7-9］。同時，單寧酶還會影響綠茶、花生種衣等水解物中酚類物質(zhì)含量，提高其抗氧化活性［8，10］。黃玉鳳等［10］研究發(fā)現(xiàn)在綠茶水浸出物中添加單寧酶，可有效分解其酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG），并顯著提高浸出物對DPPH、ABTS自由基的清除能力。王君等［11］將單寧酶作用于新鮮牛蒡，發(fā)現(xiàn)牛蒡提取物中多酚含量及其抗氧化活性均顯著提高。但目前未見有利用單寧酶處理核桃內(nèi)種皮提取液的研究。本研究以‘寒豐核桃成熟果實內(nèi)種皮為試驗材料，通過酶解時間、底物濃度、酶添加量等單因素試驗，研究單寧酶對核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)含量的影響，為合理開發(fā)和利用核桃內(nèi)種皮提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘寒豐核桃成熟果實內(nèi)種皮，試驗植株栽植于山西農(nóng)業(yè)大學核桃種質(zhì)資源圃。于2022年9月從生長健壯、長勢一致的植株樹冠外圍采摘發(fā)育成熟、無病蟲害的果實500個。將采回的鮮核桃迅速剝?nèi)デ嗥ず陀矚ぃ描囎尤∠潞颂胰释獾谋∧?，冷凍干燥后于?0℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

將冷凍干燥后的核桃內(nèi)種皮粉碎，稱取不同量的內(nèi)種皮粉末置于50mL離心管中，加入25mL超純水，超聲浸提30min后，根據(jù)內(nèi)種皮與酶制劑的比例要求加入不同量的單寧酶；對照不加單寧酶，其他條件相同。設3次重復。酶解后95℃水浴5min滅活單寧酶，待溫度降低到室溫后，10 000 r· min-1離心 10 min，取上清液，定容，待HPLC測定。試驗采用單因素試驗設計。

1.2.1 單因素試驗

1）酶解時間：稱取0.5g內(nèi)種皮加25mL超純水，超聲浸提30min后，加入0.05g單寧酶，在50℃水浴鍋中反應1、2、3、4、5h，測定內(nèi)種皮中酚類物質(zhì)（酚酸、黃酮類）的含量。對照為不添加單寧酶，其他條件相同。

2）底物濃度：稱取0.25、0.5、1、1.5g內(nèi)種皮加25mL超純水，底物濃度分別為10、20、40、60mg/mL，超聲浸提30min后，加入0.05g單寧酶，在50℃水浴鍋中反應5h，測定內(nèi)種皮中酚類物質(zhì)（酚酸、黃酮類）的含量。對照為不添加單寧酶，其他條件相同。

3）酶添加量：稱取0.5g內(nèi)種皮加25mL超純水，超聲浸提30min后，加入0.03、0.05、0.1、0.15g單寧酶，在50℃水浴鍋中反應5h，測定內(nèi)種皮中酚類物質(zhì)（酚酸、黃酮類）的含量。對照為不添加單寧酶，其他條件相同。

1.2.2 酚類物質(zhì)含量的測定

參照課題組劉雨霞等［13］的方法，利用液相色譜儀測定核桃內(nèi)種皮酚酸類與黃酮類等酚類物質(zhì)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0軟件進行顯著性分析；采用Origin 2021軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時間對核桃內(nèi)種皮酚酸類物質(zhì)含量的影響

由圖1-A可知，對照組核桃內(nèi)種皮中綠原酸含量隨著酶解時間的增加呈降低趨勢，單寧酶處理組呈先升高后降低趨勢，在1h時含量達到最高181.31mg/mL，之后逐漸下降。單寧酶處理組內(nèi)種皮綠原酸含量均顯著高于對照組（P<0.05）。由圖1-B可看出，單寧酶處理組與對照組鞣花酸含量均呈先降低后升高趨勢，在1h處理時鞣花酸含量最低為1194.97mg/mL，之后逐漸升高。不同酶解時間單寧酶處理組內(nèi)種皮鞣花酸含量均顯著低于對照組（P<0.05）。結(jié)果表明，單寧酶酶解可以促進綠原酸積累和鞣花酸降解。酶解1h時綠原酸含量與鞣花酸含量分別達到最高與最低值。

2.2 酶解時間對核桃內(nèi)種皮黃酮類物質(zhì)含量的影響

由圖2-A、圖2-C、圖2-D可知，對照組沒食子酸、EC含量隨著酶解時間增加逐漸降低，而處理組沒食子酸、EC含量顯著升高（P<0.05）。對照組與處理組EGC含量隨著酶解時間的增加均呈先升高后降低趨勢。不同時間處理下，單寧酶組沒食子酸、EGC、EC含量均顯著高于對照組（P<0.05），其中5h處理時沒食子酸含量增長倍數(shù)最大為3.83；3h處理時EGC增幅最大（21.97%），其次為5h處理（21.93%）；5h處理時EC增幅最大（70.95%），其次為4h處理（56.48%）。由圖2-B可知，對照組與單寧酶處理組ECG含量隨著酶解時間的增加均呈降低趨勢，且在5h時達到最大降幅72.38%。在不同時間處理下單寧酶組ECG含量均顯著低于對照組（P<0.05）。結(jié)果表明，單寧酶處理5h時能有效降低ECG含量，同時提高EGC、EC與沒食子酸含量。

2.3 底物濃度對核桃內(nèi)種皮酚酸類物質(zhì)含量的影響

由圖3可知，對照組與單寧酶處理組核桃內(nèi)種皮綠原酸、鞣花酸含量隨著酶解時間的增加均呈升高趨勢。在不同底物濃度處理下，單寧酶處理組綠原酸含量均顯著高于對照組（P<0.05），而鞣花酸含量均顯著低于對照組（P<0.05）。其中，綠原酸在底物濃度為10mg/mL時達最大增長倍數(shù)2.42，鞣花酸在底物濃度為10mg/mL時達到最大降幅32.38%。結(jié)果表明，單寧酶處理的底物濃度為10mg/mL時最有利于綠原酸積累與鞣花酸的降解。

2.4 底物濃度對核桃內(nèi)種皮黃酮類物質(zhì)含量的影響

由圖4可知，對照組與單寧酶處理組核桃內(nèi)種皮中沒食子酸、ECG、EGC、EC含量隨著底物濃度的增加均呈升高趨勢。其中，ECG含量較對照組顯著降低（P<0.05），且底物濃度為20mg/mL處理時ECG降幅最大（77.69%），其次為40mg/mL處理（72.64%）。同時，單寧酶處理組沒食子酸、EGC、EC含量較對照組顯著升高（P<0.05），且底物濃度為10mg/mL時沒食子酸增長倍數(shù)最大為4.36，其次為20mg/mL處理（3.52）；10mg/mL處理時EGC增幅最大（23.25%），其次為20mg/mL處理（13.90%）；40mg/mL處理時EC增幅最大（95.91%），其次為20mg/mL處理（95.34%）。結(jié)果表明，單寧酶處理的底物濃度為20mg/mL時能有效降低ECG含量，同時提高沒食子酸、EGC與EC含量。

2.5 酶添加量對核桃內(nèi)種皮酚酸類物質(zhì)含量的影響

由圖5可知，單寧酶處理組核桃內(nèi)種皮綠原酸含量較對照組顯著提高，而鞣花酸含量較對照組顯著降低（P<0.05）。酶添加量對核桃內(nèi)種皮綠原酸、鞣花酸含量的影響不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，單寧酶處理會顯著影響核桃內(nèi)種皮酚酸類物質(zhì)的含量，而酶添加量的增加對物質(zhì)含量影響較小，因此選擇1.20mg/mL作為酶添加量較為適宜，可節(jié)約成本。

2.6 酶添加量對核桃內(nèi)種皮黃酮類物質(zhì)含量的影響

由圖6可知，單寧酶處理組沒食子酸、EGC、EC含量較對照組顯著升高，而ECG含量較對照組顯著降低（P<0.05）。單寧酶處理組EGC含量隨著酶添加量的增加呈先升高后降低趨勢，且在酶添加量為4mg/mL時含量達到最高為8545.97mg/mL。同時，沒食子酸、EC含量隨著酶添加量的增加逐漸 升高，均在酶添加量為6mg/mL時含量達到最高2352.97mg/mL、190.29mg/mL。而酶添加量對核桃內(nèi)種皮ECG含量的影響不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，單寧酶處理會顯著影響核桃內(nèi)種皮黃酮類物質(zhì)的含量，然而酶添加量的增加對物質(zhì)含量的影響不大，考慮到試驗成本問題，1.2mg/mL的酶添加量為適宜選擇。

3 討論與結(jié)論

單寧酶作為一種廣泛存在于動物、產(chǎn)單寧植物及微生物中的水解酶，多被用于脫除果實、茶飲品等因單寧物質(zhì)產(chǎn)生的苦澀味或作為澄清劑改善飲料儲藏過程中產(chǎn)生的渾濁問題。有研究表明，單寧酶會影響其水解物的酚類物質(zhì)含量，提高其抗氧化活性［10-12］。為探究單寧酶對核桃內(nèi)種皮酚類物質(zhì)含量的影響。本研究通過單因素試驗，探究不同酶解時間、底物濃度、酶添加量下單寧酶對核桃內(nèi)種皮酚酸、黃酮類等酚類物質(zhì)含量的影響。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核桃內(nèi)種皮中添加單寧酶，可有效分解其酯型兒茶素ECG，進而增加非酯型兒茶素EGC、EC含量與沒食子酸含量，這與黃玉鳳等［10］在綠茶上的研究結(jié)果較一致。植物兒茶素分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素，酯型兒茶素具有較強的苦澀味，是引起苦澀味的主要因素，非酯型兒茶素澀味不重，收斂性弱［14］。本試驗中，分解酯型兒茶素、增加非酯型兒茶素與沒食子酸的最優(yōu)工藝為：酶解時間5h、底物濃度20mg/mL、酶添加量1.2mg/mL。本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)單寧酶處理后，核桃內(nèi)種皮中的綠原酸含量顯著升高，鞣花酸含量顯著降低。提取綠原酸并降解鞣花酸的最佳工藝為：酶解時間1h、底物濃度10mg/mL、酶添加量1.2mg/mL。劉雨霞等［13］人研究表明，鞣花酸是引起核桃內(nèi)種皮苦澀味的主要物質(zhì)之一。上述研究結(jié)果表明單寧酶處理可有效降低核桃內(nèi)種皮澀味關鍵物質(zhì)酯型兒茶素和鞣花酸的含量，當單寧酶降澀的生理機制需后續(xù)進一步研究。此外，綠原酸有“植物黃金”之美譽，具有天然的抗氧化、抗炎、抑菌、抗病毒及抗癌等多種生理功能［15-16］。大量細胞和動物試驗研究表明，綠原酸能有效抑制腸道炎癥，具有促進動物生長、增強機體免疫功能的作用［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)單寧酶酶解核桃內(nèi)種皮可有效提高綠原酸含量，這為進一步利用核桃內(nèi)種皮生產(chǎn)綠原酸奠定基礎。

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收稿日期：2024-01-20

基金項目：山西省科技重大專項計劃（202201140601027）;晉中市科技重點研發(fā)計劃（Y212013）;山西省普通高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（20220167）

第一作者簡介：胡文朝（2002-），男，大學本科，主要從事果實品質(zhì)形成與調(diào)控研究。

*通信作者：張小軍（1982-），男，博士，副教授，主要從事果實品質(zhì)形成與調(diào)控研究。E-mail：zhangxj0906@126.com