周子桐 董雪 張雅倩 申文鳳 牛子陽 李信心 李偉娜

摘要?目的：分析珍珠粉、茯苓、絞股藍及其復合物改善小鼠睡眠作用的影響。方法：通過直接睡眠試驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗評價其對小鼠睡眠情況的影響，通過急性毒性試驗評價珍珠粉茯苓絞股藍復合物的安全性。結(jié)果：珍珠粉、茯苓、絞股藍及其復合物各劑量組對正常小鼠均無直接睡眠作用，但是復合物各劑量組均可以延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間，有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.001），增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)（P<0.01），能夠顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期，有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。此外，復合物高劑量組小鼠下丘腦及血清中的5-羥色胺（5-HT）及γ-氨基丁酸（GABA）含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.001）。與珍珠粉、茯苓、絞股藍比較，復合物在延長戊巴比妥鈉睡眠時間、增加小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠只數(shù)、縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期方面效果顯著優(yōu)于各單藥組；急性毒性試驗表明珍珠粉茯苓絞股藍復合物對受試小鼠未出現(xiàn)不良反應。結(jié)論：以上結(jié)果表明，珍珠粉、茯苓、絞股藍及復合物均可在一定程度上改善小鼠的睡眠，并且珍珠粉、茯苓、絞股藍組成的復合物具有協(xié)同增效的作用，安全性良好。

關(guān)鍵詞?珍珠粉；茯苓；絞股藍；睡眠；戊巴比妥鈉；巴比妥鈉

Analyzing the Effects of Pearl Powder，Poria Cocos，Gynostemma Pentaphyllum and Their Complexes on Improving Sleep in MiceZHOU Zitong1，2，DONG Xue1，2，ZHANG Yaqian1，2，SHEN Wenfeng1，2，NIU Ziyang1，2，LI Xinxin1，2，LI Weina1，2

（1 School of Chemical Engineering，Northwestern University，Xi′an 710069，China; 2 Shaanxi Biomaterials and Fermentation Engineering Technology Research Center，Xi′an 710069，China）

Abstract?Objective：To analyze the effects of pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes on improving sleep in mice.Methods：The effects of direct sleep test，prolonged pentobarbital sodium sleep time test，pentobarbital sodium subthreshold dose hypnosis test，and pentobarbital sodium sleep latency test on mouse sleep were evaluated，and the safety of pearl powder Poria cocos pentaphyllum complex was evaluated through acute toxicity test.Results：Pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes did not have a direct sleep effect on normal mice，but each dose group of the complex could prolong the sleep time induced by pentobarbital sodium，with statistical significance（P<0.01 or P<0.001）.The number of sleeping mice was increased with the subliminal hypnotic dose of pentobarbital sodium（P<0.01） could significantly shorten the sleep latency of mice，with statistical significance（P<0.001）.In addition，the levels of 5-hydroxytryptamine（5-HT） in the hypothalamus and serum of mice in the high-dose complex group were also measured γ-The content of aminobutyric acid（GABA） was significantly higher than that of the control group，and the difference was statistically significant（P<0.01 or P<0.001）.Compared with pearl powder，Poria cocos，and Gynostemma pentaphyllum，the complex showed significantly better effects in prolonging pentobarbital sodium sleep time，increasing the number of mice hypnotized by pentobarbital sodium subthreshold dose，and shortening the sleep latency of pentobarbital sodium compared to other single drug groups; the acute toxicity test showed that the pearl powder Poria cocos and Gynostemma pentaphyllum complex did not exhibit any adverse reactions in the tested mice.Conclusion：The above results indicate that pearl powder，Poria cocos，Gynostemma pentaphyllum and their complexes can all improve the sleep of mice to a certain extent，and the complex composed of pearl powder，Poria cocos，and Gynostemma pentaphyllum has a synergistic effect and good safety.

Keywords?Pearl powder; Poria cocos; Gynostemma pentaphyllum; Sleep; Pentobarbital sodium; Barbital sodium

中圖分類號：R338.63文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2024.02.064

隨著社會的發(fā)展進步以及人們生活節(jié)奏的不斷加快，睡眠障礙疾病的發(fā)生率大大提高［1］，全球因失眠導致的患病率為25%左右，平均每4個人就會有1個人患病，甚至每天約有2 800人因睡眠障礙死亡［2-3］。睡眠障礙的主要特征為難以入睡，睡眠時間短，睡眠質(zhì)量差等［4-5］。

現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，改善睡眠的機制主要與調(diào)節(jié)血清素（5-羥色胺，5-hydroxytryptamine，5-HT）系統(tǒng)、γ-氨基丁酸（γ-aminobu-tyric Acid，GABA）多巴胺（DA）的平衡有關(guān)［6］。目前治療睡眠障礙的藥物種類繁多，常以苯二氮艸卓等鎮(zhèn)靜催眠類藥物治療，但連續(xù)用藥會出現(xiàn)敏感性降低、藥效減弱甚至久用成癮等問題［7］。面對這些局限，人們傾向于尋求天然藥物來治療或緩解失眠癥狀。歷代醫(yī)書記載了大量具有改善睡眠功效的中藥單味方藥，為治療失眠提供了可借鑒的經(jīng)驗［8］?！吨腥A人民共和國藥典》記載，珍珠具有安神定驚作用，且能抑制動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)［9-10］。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核［9］，是藥食兩用、臨床運用的大宗中藥材之一。絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）具有降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和對心肌缺血及缺血再灌注損傷具有保護等多種藥理作用［11］。目前關(guān)于茯苓、絞股藍單獨改善睡眠的研究較多［12-13］，而珍珠粉的研究則多集中于美容保?。?4］，具體的生藥起效劑量及對應的人體用量研究相對較少。同時珍珠粉、茯苓、絞股藍3種中藥材的聯(lián)合助眠作用及其起效劑量的研究也未見詳細報道。因此，本試驗以小鼠為研究對象，對珍珠粉、茯苓、絞股藍及其復合物進行改善睡眠功能試驗，評價不同配方對失眠小鼠的改善作用，為3種原料及其復合物的實際應用提供理論數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?藥物?珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物均購自陜西嘉禾生物科技股份有限公司，其中茯苓水提物提取得率為5%，絞股藍水提物提取得率為18%。復合物為珍珠粉、茯苓提取物、絞股藍提取物混合物（珍珠粉∶茯苓∶絞股藍=2∶5∶15）。

1.2?動物?SPF級昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，由陜西省西安市西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供［許可證號：SCXK（陜）2020-001］。動物飼養(yǎng)于屏障級動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h照明和12 h黑暗交替，動物自由攝食和飲水。

1.3?儀器與試劑?計時器、玻璃勻漿器、ME104E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；BioTek全波長酶標儀，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；TGL-20臺式高速離心機，山東百歐醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品。生理鹽水、戊巴比妥鈉，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司產(chǎn)品；巴比妥鈉，中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W試劑公司產(chǎn)品；五羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）和多巴胺（DA）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELSIA）試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.4?治療方法

1.4.1?動物分組與給藥?將100只小鼠按照體質(zhì)量隨機分為10個組，即9個觀察組和1個空白對照組，每組10只。以灌胃方式給予受試藥物，灌胃量為10 mL/（kg·bw），1次/d，空白對照組給予等量的蒸餾水。設置珍珠粉低、高劑量組，分別按16、32 mg/（kg·bw）給藥；茯苓水提物低、高劑量組，分別按40、80 mg/（kg·bw）給藥；絞股藍水提物低、高劑量組，分別按120、240 mg/（kg·bw）給藥；復合物低、高劑量組，分別按176、252 mg/（kg·bw）給藥。試驗期間動物自由攝食飲水，每天觀察小鼠的活動及生長情況。灌胃30 d后，對各組小鼠進行相關(guān)指標的檢測。

1.4.2?直接睡眠試驗?末次灌胃15 min后觀察小鼠睡眠情況，睡眠以翻正反射消失為指標，即當小鼠置于背臥位時，能夠立即翻正身位，如果超過60 s小鼠不能翻正，說明翻正反射消失，小鼠進入睡眠，從翻正反射消失到其恢復的時間為小鼠的睡眠時間。分別觀察并計算各組小鼠的入睡只數(shù)及睡眠時間。

1.4.3?延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗?末次灌胃15 min后，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/（kg·bw），以翻正反射消失為動物入睡指標，分別記錄各組動物的平均睡眠時間。

1.4.4?戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗?末次灌胃15 min后，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉27 mg/（kg·bw），以翻正反射消失為動物入睡指標，分別記錄各組30 min內(nèi)入睡動物只數(shù)。

1.4.5?巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗?末次灌胃15 min后，各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉230 mg/（kg·bw），以翻正反射消失為依據(jù)，觀察受試物能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期。

1.4.6?腦組織5-HT、GABA、DA含量的檢測?各組小鼠連續(xù)灌胃30 d后，禁食12 h，處死小鼠，取出腦組織，用生理鹽水沖洗后稱其質(zhì)量，用勻漿器制備10%的腦組織勻漿，4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書采用ELISA測定各組小鼠腦組織中5-HT、GABA、DA的含量。

1.4.7?小鼠急性毒性試驗?雌、雄小鼠各20只，18～22 g。采用最大耐受劑量法，受試物一次性灌胃給予，染毒劑量為15 g/（kg·bw），以10 mL/（kg·bw）的灌胃容量給予小鼠灌胃。試驗前動物禁食（不禁飲水）16 h，記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14天。

1.5?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗；計數(shù)資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?直接睡眠試驗?空白對照組（蒸餾水）、珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物、復合物各劑量組的小鼠均未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象（沒有翻正反射消失小鼠），各組均無直接睡眠效果，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2?延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗?與空白對照組比較，復合物低、高劑量組小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間均顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01或P<0.001），說明復合物可顯著延長小鼠睡眠時間。同時，與空白對照組比較，珍珠粉高劑量組、茯苓水提物高劑量組以及絞股藍水提物高劑量組小鼠的戊巴比妥鈉睡眠時間與空白對照組比較顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。與復合物比較，珍珠粉低、高劑量組、茯苓高劑量組、絞股藍高劑量組睡眠時間存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明復合物各劑量組均可以對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間起到延長作用，且對小鼠睡眠時間的延長作用優(yōu)于珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物單藥組。見表2。

2.3?戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗?與空白對照組比較，復合物各劑量組均能顯著增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），茯苓水提物、絞股藍水提物高劑量組能顯著增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與復合物低劑量組比較，珍珠粉低劑量組、茯苓水提物低劑量組、絞股藍水提物低劑量組入睡小鼠只數(shù)存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明，相較于珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物，復合物可以顯著增加戊巴比妥鈉閾下催眠劑量入睡小鼠只數(shù)。見表3。

2.4?巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗?與空白對照組比較復合物各劑量組均能顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），說明復合物具有縮短巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠潛伏期的作用。同時，與空白對照組比較，珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物高劑量組小鼠的睡眠潛伏期均顯著縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與復合物低劑量組比較，珍珠粉低劑量組、茯苓水提物低劑量組、絞股藍水提物低劑量組睡眠潛伏期存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果表明，相較于珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物單藥組，復合物可以顯著縮短小鼠的睡眠潛伏期，對小鼠的睡眠起到一定的改善作用。見表4。

2.5?絞股藍珍珠粉膠囊對失眠小鼠腦組織5-HT、GABA、DA含量的影響?與空白對照組比較，珍珠粉高劑量組5-HT、GABA顯著升高，DA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；茯苓水提物高劑量組5-HT、GABA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），DA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；絞股藍水提物高劑量組5-HT、GABA含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），DA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；復合物各劑量組小鼠腦組織中5-HT、GABA含量表現(xiàn)不同程度的增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01或P<0.001），DA含量不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），與復合物高劑量組比較，珍珠粉高劑量組小鼠腦組織中5-HT含量存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與復合物高劑量組比較，珍珠粉低劑量組、茯苓水提物低劑量組、絞股藍水提物高劑量組小鼠腦組織中GABA含量存在顯著差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各指標表現(xiàn)出一定的劑量依賴性關(guān)系，且作用效果優(yōu)于珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物單藥組。由上可知，復合物對小鼠的改善睡眠作用可能是通過調(diào)節(jié)小鼠腦組織中的5-HT、GABA、DA的含量實現(xiàn)的。見表5。

2.6?小鼠的急性毒性試驗?各劑量組小鼠在急性毒性試驗期間未出現(xiàn)驚厥不安、便秘腹瀉或者是豎毛等不良反應，試驗過程中無動物死亡，試驗前后各組小鼠的體質(zhì)量。見表6。給藥前后各時間段動物的體質(zhì)量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試驗結(jié)束后，小鼠各臟器并未發(fā)現(xiàn)肉眼可見異常，說明珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物及其復合物的安全性良好。小鼠的急性毒性試驗經(jīng)口耐受劑量（MTD）＞15 g/（kg·bw），珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物及其復合物急性毒性屬實際無毒級。

3?討論

本研究為探討珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物復合物對小鼠的改善睡眠作用及其可能作用機制，通過延長戊巴比妥鈉睡眠時間、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗觀察了珍珠粉、茯苓水提物、絞股藍水提物及復合物對小鼠睡眠的作用并對小鼠腦組織中的5-HT、GABA、DA含量進行了測定，結(jié)果顯示復合物176 mg/kg、252 mg/kg劑量下對小鼠的改善睡眠作用明顯，此時小鼠腦組織的5-HT、GABA含量與空白對照組相比顯著升高（P<0.05或P<0.01或P<0.001），DA水平也顯著低于空白對照組（P<0.05或P<0.01）。說明珍珠粉茯苓絞股藍復合物對小鼠的改善睡眠作用可能是通過5-HT、GABA、DA等多種神經(jīng)遞質(zhì)的共同調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。復合物小鼠的急性毒性試驗經(jīng)口耐受劑量MTD＞15 g/（kg·bw），試驗中雌、雄大鼠各劑量組的體質(zhì)理與對照組比較均無統(tǒng)計學差異，未見毒性。說明該復合物配方在此劑量范圍內(nèi)是安全的。

珍珠作為一種名貴的中藥材，在我國的應用已有幾千年的歷史。王麗云［15］按保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范要求，觀察超細珍珠粉對小鼠改善睡眠作用，結(jié)果表明超細珍珠粉與閾下劑量的戊巴比妥鈉有協(xié)同作用，一定劑量時可縮短小鼠巴比妥鈉的入睡潛伏期。潘建新等［10］研究了珍珠對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用，指出珍珠粉可以使小鼠5-HT水平升高，發(fā)揮改善睡眠的作用。茯苓的主要成分為茯苓多糖，孫夢娜等［12］研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能不同程度地改善小鼠睡眠情況；李明玉等［16］證明茯苓多糖具有協(xié)同戊巴比妥的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用，起到催眠、安神功效。絞股藍皂苷作為絞股藍的主要成分，可以降低正常小鼠的自發(fā)活動，還可以加強戊巴比妥鈉對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用［17］。這與本試驗單方的結(jié)果一致，且本試驗證明復合物改善睡眠的效果顯著優(yōu)于單方。但本試驗對復合物設置濃度梯度較少，不能得出具體最低見效劑量，還需進一步深入探究，以便進一步揭示珍珠粉、茯苓、絞股藍復合物改善小鼠睡眠的作用機制及作用與劑量的關(guān)系。

利益沖突聲明：無。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFC2101500；2019YFA0905200）作者簡介：周子桐（2000—），男，碩士研究生，研究方向：制藥工程，E-mail：zztbrilliant@163.com通信作者：李偉娜（1987—），女，副教授，E-mail：zhencheng874125@163.com