張紫涵，陳明明，劉 君，桑圣剛，張榮光，

（1.海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全健康國(guó)際學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570102）

胃癌細(xì)胞起源于消化道上皮細(xì)胞，患病率高且患病年齡年輕化，由于初期表現(xiàn)不明顯確診難度較大［1］。最新研究表明，2020 年全球范圍內(nèi)新增的胃癌病例已超百萬(wàn)，且發(fā)病率已經(jīng)超越肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌［2］。每年約76.9 萬(wàn)人死于胃癌，死亡率位于癌癥的前列［3，4］。目前綜合治療方案主要為手術(shù)、化學(xué)療法和免疫治療，這些方法雖有助于提高患者的生存率和生活質(zhì)量，但中晚期胃癌的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)常導(dǎo)致治療失?。?-7］。因此深入了解胃癌的分子機(jī)制和生物學(xué)特性，尋找早期生物標(biāo)記，并開發(fā)精準(zhǔn)的治療手段，可提高早期胃癌患者的治療效果，減少中晚期胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而為患者爭(zhēng)取更好的生存和生活質(zhì)量。GEPAI數(shù)據(jù)庫(kù)具有基因表達(dá)分析和自定義數(shù)據(jù)分析的功能，能提供預(yù)后分析、腫瘤及正常組織差異表達(dá)分析、基因相關(guān)分析等數(shù)據(jù)，可以對(duì)各種癌癥和正常組織的基因表達(dá)差異及整體生存率等進(jìn)行分析。本研究通過(guò)GEPIA 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出胃癌與正常組織表達(dá)具有差異的前10 個(gè)基因，并對(duì)篩選的差異基因進(jìn)行生存預(yù)后分析，討論其在胃癌發(fā)生、發(fā)展以及疾病進(jìn)展中的作用，為胃癌的診斷治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 差異基因的獲得

訪問(wèn)GEPAI 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia.cancer.pku.cn/），點(diǎn)擊“Differential Genes”（差異基因）功能按鈕，定義篩選條件為“Dataste”（數(shù)據(jù)集），疾病類型設(shè) 為“STAD”［胃 癌（Stomach adenocarcinoma，STAD）］，調(diào)整|log2FC|和q-value 的cut off 值，分別為1.0 和0.01，最后，在“Differential Methods”（差異方式）部分選擇“ANOVA”作為方法，并在“Chromosomal Distribution”（染色體分布）下拉菜單中選擇“over-expressed”（過(guò)表達(dá)），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.2 對(duì)篩選基因進(jìn)行生存分析

進(jìn)入GEPAI 數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)選擇“Surval”（生存）與“Surval Plots”（生存圖）選項(xiàng)，在Gene 框中依次輸入腫瘤組織和正常組織中表達(dá)差異較大的基因。然 后 從“Methods” （方 法）中 選 取“Overall Survival and Disease Free Survival” （總體生存期和無(wú)病生存期），設(shè)定Group cut off（截?cái)嘀担?“Median” （中位數(shù)），同時(shí)設(shè)置cut off-High（%）（最高截?cái)啵┖蚦ut off-Low（%）（最低截?cái)啵┓謩e為“50”，對(duì)于“Hazards Ratio” （風(fēng) 險(xiǎn) 比 率）和 “95% Confidence Interval”（95%置信區(qū)間）分別勾選“Yes” ，確定“Axis Units”（橫 軸 的 單 位）為“Months” （月），“Datasets Selection” （數(shù)據(jù)集選擇）選擇“STAD”，最后點(diǎn)擊“Plot”繪制在腫瘤和正常組織中差異表達(dá)基因的生存曲線和無(wú)病生存期（RFS）曲線。

2 結(jié)果

2.1 在胃癌組織和正常組織中基因的表達(dá)存在差異

在GEPAI 數(shù)據(jù)集中篩選了符合TCGA（癌癥基因組圖譜）、正常組織和GTEx（基因型和基因表達(dá)量數(shù)據(jù)庫(kù)）一致性的樣本619 例，其中包括408 例胃癌組織樣本和211 例正常組織樣本。篩選出了4 644 個(gè)胃癌組織與正常組織存在差異的基因。前10 名基因依次為：PRR11、CLDN7、TPX2、GNL3L、SKA3、ADHFE1、MTDH、CEP55、KIF11、KIF20B。對(duì)408 例胃癌組織和211 例正常胃組織樣本進(jìn)行基因表達(dá)差異分析。與正常胃組織相比，胃癌組織中PRR11、CLDN7、TPX2、GNL3L、SKA3、MTDH、CEP55、KIF11、KIF20BmRNA 表達(dá)水平升高，見圖1～10，ADHFE1mRNA 表達(dá)水平降低，見圖6。圖1～10 中紅色模塊代表胃癌組織，灰色模塊代表正常組織。

圖1 PRR11 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 1 Expression of PRR11 gene in gastric cancer and normal tissue

圖2 CLDN7 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 2 Expression of CLDN7 gene in gastric cancer and normal tissue

圖3 TPX2 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 3 Expression of TPX2 gene in gastric cancer and normal tissue

圖4 GNL3L 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 4 Expression of GNL3L gene in gastric cancer and normal tissue

圖5 SKA3 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 5 Expression of SKA3 gene in gastric cancer and normal tissue

圖6 ADHFE1 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 6 Expression of ADHFE1 gene in gastric cancer and normal tissue

圖7 MTDH 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 7 Expression of MTDH gene in gastric cancer and normal tissue

圖8 CEP55 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 8 Expression of CEP55 gene in gastric cancer and normal tissue

圖9 KIF11 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 9 Expression of KIF11 gene in gastric cancer and normal tissue

圖10 KIF20B 基因在胃癌和正常組織的表達(dá)Fig 10 Expression of KIF20B gene in gastric cancer and normal tissue

2.2 基因差異表達(dá)對(duì)腫瘤患者生存期的影響

通過(guò)GEPIA 分析差異基因表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，對(duì)胃癌患者進(jìn)行生存預(yù)后分析，得到生存曲線和RFS 曲線，結(jié)果顯示：胃癌患者中PRR11、CLDN7、TPX2、GNL3L、SKA3、MTDH、KIF11、KIF20B高表達(dá)組與低表達(dá)組生存分析（見圖11～20A）和RFS 分析（見圖11～20B）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胃癌患者中ADHFE1高表達(dá)組生存時(shí)間（HR=1.4，LogrankP=0.047，見圖16A）以及RFS（HR=1.7，LogrankP=0.0082，見圖16B）均低于低表達(dá)組，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。胃癌患者中CEP55高表達(dá)組生存時(shí)間高于低表達(dá)組，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異（HR=0.69，LogrankP=0.021，見 圖18A），CEP55高表達(dá)組與低表達(dá)組RFS 分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖18B）。

圖11 基于PRR11 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 11 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with PRR11 gene expression

圖12 基于CLDN7 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 12 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with CLDN7 gene expression

圖13 基于TPX2 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 13 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with TPX2 gene expression

圖14 基于GNL3L 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 14 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with GNL3L gene expression

圖15 基于SKA3 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 15 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with SKA3 gene expression

圖16 基于ADHFE1 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 16 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with ADHFE1 gene expression

圖17 基于MTDH 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 17 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with MTDH gene expression

圖18 基于CEP55 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 18 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with CEP55 gene expression

圖19 基于KIF11 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 19 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with KIF11 gene expression

圖20 基于KIF20B 基因表達(dá)的胃癌患者生存分析（A）和RFS 分析（B）Fig 20 Survival analysis （A） and RFS analysis （B） of gastric cancer patients with KIF20B gene expression

3 討論

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率較高［8］。盡管近些年對(duì)該病的診療技術(shù)有所發(fā)展，然而在中國(guó)，由于胃癌早期無(wú)顯著征兆，多數(shù)病例病情惡化后才被救治，病死率高［9，10］。尋找能夠預(yù)測(cè)其生存時(shí)間的指標(biāo)具有重要意義［11］。在胃癌疾病發(fā)展過(guò)程中，某些基因的異常表達(dá)會(huì)改變腫瘤組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，這些差異表達(dá)的基因可能對(duì)早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要價(jià)值。

本研究利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出正常組織和胃癌組織的差異基因，差異排名前10 位的基因?yàn)镻RR11、CLDN7、TPX2、GNL3L、SKA3、ADHFE1、MTDH、CEP55、KIF11、KIF20B。通過(guò)分析這些基因，發(fā)現(xiàn)與胃癌患者生存時(shí)間密切相關(guān)的基因?yàn)锳DHFE1和CEP55基因。對(duì)上述基因進(jìn)行RFS 曲線分析，發(fā)現(xiàn)ADHFE1基因表達(dá)與患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。這些基因有可能成為胃癌診斷和預(yù)后分析的重要生物標(biāo)志。

ADHFE1（ Alcohol dehydrogenase 1 containing iron）基因編碼的含鐵的醇脫氫酶1 是鐵活化醇脫氫酶家族的成員，在多種生理過(guò)程中起著多種作用［12，13］。研究表明，ADHFE1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)和高甲基化，ADHFE1高表達(dá)水平與腫瘤患者的良好預(yù)后呈正相關(guān)，表明其在結(jié)直腸癌中具有抑瘤作用［14-16］。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中ADHFE1基因的表達(dá)顯著低于正常組織，ADHFE1基因高表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組。RFS分析結(jié)果顯示ADHFE1基因與胃癌患者的無(wú)病生存期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

CEP55（Centrosome protein 55）基 因 編 碼 的 中心體蛋白55 是中心體相關(guān)蛋白家族的成員［17］。此基因位于第10 號(hào)染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)3 帶［18］。已有研究證實(shí)，在許多人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了CEP55的高表達(dá)，例如乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌， 并且CEP55基因與腫瘤的惡性程度、侵襲以及不良預(yù)后密切相關(guān)［19，20］。在本研究中，CEP55基因高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存時(shí)間存在顯著差異，CEP55基因高表達(dá)組患者生存時(shí)間顯著高于低表達(dá)組。

綜上所述，差異基因的不同表達(dá)水平在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要的作用，并與胃癌的生存預(yù)后密切相關(guān)，其中ADHFE1的低表達(dá)和CEP55的高表達(dá)是發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)因素。這些發(fā)現(xiàn)為胃癌早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)研究提供了新的重要線索和基礎(chǔ)，探明這些基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機(jī)制是值得未來(lái)研究關(guān)注的方向。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

張紫涵：數(shù)據(jù)處理、作圖并撰寫論文；陳明明：文獻(xiàn)檢索并處理數(shù)據(jù)；劉君：論文的審閱與修改；桑圣剛、張榮光：全程參與、指導(dǎo)數(shù)據(jù)分析和作圖并修改論文。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。