安艷霞, 劉欣, 李占超, 趙陽, 張劍, 李夢琴

(河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大宗糧食加工重點實驗室,河南 鄭州 450002)

木質(zhì)纖維生物質(zhì)資源豐富,可再生,價格低廉,含纖維素(40%～50%)、半纖維素(20%～30%)和可提取的木質(zhì)素(extractable lignin, EL)(15%～30%)等組分,在生物轉(zhuǎn)化和生物精煉方面具有巨大的應(yīng)用潛力,其高值化轉(zhuǎn)化與綜合利用也是實現(xiàn)“碳達峰”和“碳中和”的重要途徑[1]。纖維素通過酶解首先轉(zhuǎn)化為纖維二糖、單糖或通過微生物降解成小分子物質(zhì),然后才能被進一步應(yīng)用。木質(zhì)素以愈創(chuàng)木基(guaiacyl,G)、丁香基(syringyl, S)和對羥苯基(p-hydroxyphenyl,H)為基本單位,通過連接鍵構(gòu)成具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的大分子,形成剛性結(jié)構(gòu),根據(jù)比例分為G型、S型和H型木質(zhì)素[2]。原生物質(zhì)酶解率極低,其原因通常歸結(jié)為底物中木質(zhì)素與纖維素酶之間的空間位阻,以及氫鍵、疏水和靜電作用引起的非生產(chǎn)性吸附,使纖維素酶與纖維素組分之間接觸的機會較少[3]。因此,木質(zhì)纖維在利用前通常需預(yù)處理,以打破組分之間的牢固結(jié)構(gòu),促使纖維素酶與纖維素之間作用位點增加和可及性增強。

木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制機制已有報道[4],主要包括空間位阻、木質(zhì)素和纖維素酶之間產(chǎn)生的非生產(chǎn)性吸附。另外,也有研究表明,雖然木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物對纖維素酶存在抑制,但在酶解體系中添加改性木質(zhì)素卻可降低該效果[5]。因此,明確木質(zhì)素的去除和分布、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等因素,采取有效措施以降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制,從而合理設(shè)計酶解體系,為生物質(zhì)組分的綜合利用提供思路。

1 木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制機制

木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制機制主要包括空間位阻、非生產(chǎn)性吸附和酚類化合物的影響。

1.1 空間位阻

木質(zhì)素本身三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及其獨特的理化性能所形成的空間位阻,是抑制纖維素酶酶解的重要因素之一。VERMAAS等[6]模擬了纖維素酶與由纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成的模型化合物的相互作用,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素與纖維素酶之間形成的空間位阻,阻礙了酶與纖維素的有效接觸,導(dǎo)致酶解效率降低。DJAJADI等[7]表明,經(jīng)水熱預(yù)處理的草本類生物質(zhì)中的木質(zhì)素是阻礙纖維素酶酶解的物理屏障,而不是通過酶的非生產(chǎn)吸附引起的抑制。此外,生物質(zhì)預(yù)處理過程中形成的木質(zhì)素液滴和偽木質(zhì)素也會形成物理屏障,阻礙酶與纖維素的有效結(jié)合[8]。此外,木質(zhì)素在纖維素表面的沉積和再分布也會阻礙酶與纖維素的接觸。

1.2 非生產(chǎn)性吸附

木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附被認為是木質(zhì)素抑制纖維素酶酶解的關(guān)鍵因素之一。YARBROUGH等[3]發(fā)現(xiàn),在木質(zhì)素存在情況下,β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶蛋白很難單獨存在,木質(zhì)素極易與其結(jié)合,導(dǎo)致酶的活性降低。QIN等[9]指出,硫酸鹽木質(zhì)素與纖維素酶間的黏附力大于羥丙基纖維素與纖維素酶間的黏附力,表明疏水作用是纖維素酶與木質(zhì)素結(jié)合的主要作用力。酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附主要表現(xiàn)為疏水作用、靜電作用和氫鍵作用。

1.2.1 疏水作用 疏水作用被認為是纖維素酶和木質(zhì)素之間非生產(chǎn)性吸附的主要作用之一。纖維素酶分散在水解液后疏水基團伸展,疏水作用與纖維素酶的纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain,CBD)密切相關(guān), CBD在Cel7B酶中的疏水性比在Cel7A酶中高,因此Cel7B酶更易吸附木質(zhì)素[10]。此外,抑制效果與纖維素酶構(gòu)成有關(guān)。LU等[11]發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素對Cel7A酶的活性抑制影響最大,其次是木聚糖酶、內(nèi)切β-1,4葡聚糖酶(Cel5B酶、Cel5C酶和Cel7B酶)和β-葡萄糖苷酶。除了纖維素酶本身的疏水性外,木質(zhì)素的存在使底物的疏水性增強,底物的疏水性將影響酶與底物的有效吸附[12]。LI等[13]借助旋轉(zhuǎn)涂布機制備的薄膜研究木質(zhì)素和纖維素的疏水性作用,證實了上述結(jié)論。上述研究表明疏水作用促進了酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附,抑制了纖維素酶酶解。

1.2.2 靜電作用 靜電作用是酶在木質(zhì)素上產(chǎn)生非生產(chǎn)性吸附的原因之一。酶表面因存在羧基、氨基和磷酸基等基團而帶電荷,酶分子的凈電荷與其等電點(isoelectric point, pI)、組分和酶解液的pH值有關(guān)。大多數(shù)纖維素酶的pI值≤4.8,在酶解液(pH值為4.8～5.0)時帶正電荷。此外,纖維素酶所攜帶的電荷也與其組成有關(guān)。在pH值為4.8～5.0時,里氏木霉(Trichodermareesei)的Cel6A酶、Cel12A酶和β-葡萄糖苷酶帶正電荷,而Cel7A酶、Cel7A酶、Cel7B酶和Cel5A酶則帶負電荷[14]。另一方面,預(yù)處理分離的木質(zhì)素通常含羧基、酚羥基和醇羥基等基團[15],改性后的磺化木質(zhì)素含有磺酸基團,在酸性條件下(pH值為4.8～5.0),木質(zhì)素通常帶負電荷,因此纖維素酶與木質(zhì)素之間會產(chǎn)生靜電作用。

此外,有研究表明靜電作用與酶解體系的pH值有關(guān)。LOU等[16]研究表明,當pH值從4.5提高至6.0時,纖維素分解酶和蛋白酶Zeta電位的負性增大,木質(zhì)素的親水性提高,木質(zhì)素對纖維素酶的親和力下降。該研究結(jié)果與酶解時最佳pH值為4.8～5.0的觀點不同。由于調(diào)整酶解體系的pH值易于實行,商業(yè)化成本低,因此該研究結(jié)果具有一定的科學和現(xiàn)實意義。

1.2.3 氫鍵作用 關(guān)于纖維素酶和木質(zhì)素或木質(zhì)纖維素底物之間形成的氫鍵作用也有研究。QIN等[9]利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)考察了木質(zhì)素與纖維素酶的黏附力,發(fā)現(xiàn)氫鍵在一定程度上加強了木質(zhì)素與酶的相互作用。ZHANG等[17]和LIN等[18]發(fā)現(xiàn),添加聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)等表面活性劑可與木質(zhì)素的酚羥基形成氫鍵,進而形成PEG -纖維素酶復(fù)合物,減少了酶通過氫鍵在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附,避免了纖維素酶的聚集。關(guān)于氫鍵作用研究較少,因此,氫鍵對酶解的影響尚需深入研究。

此外,木質(zhì)素易與酶蛋白結(jié)合,酶蛋白被不可逆吸附,被吸附的酶蛋白折疊結(jié)構(gòu)消失,活性降低或消失[19]。通過添加阻斷劑吐溫80、牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)、PEG和金屬離子等可減少纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附,從而提高酶與纖維素的接觸機會[20-21]。AKIMKULOVA等[22]研究表明,Mg2+削弱了纖維素酶在靜電作用和氫鍵作用下對木質(zhì)素的非生產(chǎn)吸附。

為進一步研究木質(zhì)素非產(chǎn)性吸附與酶之間的關(guān)系,采用Langmuir吸附等溫線模型測定了纖維素酶對水不溶性木質(zhì)素(water insoluble lignin, WIL)的吸附參數(shù)如吸附量、親和力和結(jié)合強度等。NAKAGAME等[14]發(fā)現(xiàn),不同來源的WIL吸附數(shù)據(jù)與Langmuir吸附等溫線模型吻合較好。有研究發(fā)現(xiàn),酶解體系中,軟木和硬木磨木木質(zhì)素(milled wood lignin, MWL)分別吸附了68%和40%的纖維素酶,糖轉(zhuǎn)化率分別降低了4%和13%[23]。經(jīng)稀酸處理的酶解殘留木質(zhì)素(enzymatic residual lignin, ERL)阻礙了纖維素的水解,稀酸預(yù)處理的ERL與纖維素酶的結(jié)合強度高于未處理的ERL[24]。上述結(jié)果表明,酶的吸附性能與木質(zhì)素的類型密切相關(guān)。近年來,利用石英晶體微天平(quartz crystal microbalance with dissipation, QCM-D)實時監(jiān)測分離木質(zhì)素對酶的吸附。LAI等[25]利用QCM-D計算纖維素酶吸附參數(shù),發(fā)現(xiàn)EL的最大吸附容量和不可逆吸附量均低于MWL,表明相對于MWL,EL的存在有助于酶解。蒲福龍等[26]研究表明,基于乳酸的低共熔溶劑(deep eutectic solvent, DES)提取的水稻秸稈木質(zhì)素的疏水性與酶蛋白的吸附性能呈正相關(guān),即疏水性越大則木質(zhì)素對酶蛋白吸附能力越強,纖維素水解效率則越低。

綜上,通過降低木質(zhì)素對纖維素酶的空間位阻、添加阻斷劑或PEG或金屬離子、調(diào)整酶解體系的pH值等措施,可降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解的非生產(chǎn)性吸附。

1.3 酚類化合物

預(yù)處理通常有利于纖維素的酶解,然而高強度的預(yù)處理可能有木質(zhì)素衍生的酚類化合物生成[27]。當纖維素酶暴露于這些酚類化合物時,隨著暴露或接觸時間的延長,纖維素酶酶活及其穩(wěn)定性逐步喪失[28],究其原因是酚類化合物與纖維素酶形成了共沉淀[29]。KIM等[30]對蒸汽爆破預(yù)處理后的硬木洗滌液濃縮后添加于酶解體系時發(fā)現(xiàn),葡萄糖產(chǎn)率從88%降至20%～30%,該研究表明對纖維素酶酶解抑制來自于洗滌濃縮液中的酚類化合物。同時,也有研究發(fā)現(xiàn)里氏木霉的β-葡萄糖苷酶比黑曲霉的β-葡萄糖苷酶更易受酚類化合物的抑制[31]。因此,抑制效果取決于酚類化合物的類型、纖維素酶的來源及類型等[32]。綜上,采取一些措施例如對纖維素酶的來源、類型等進行有效調(diào)控,可降低酚類化合物的抑制。

2 木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制影響因素

2.1 預(yù)處理及底物中木質(zhì)素的含量

木質(zhì)纖維原料中的木質(zhì)素很大程度上阻礙了酶對纖維素的可及性,致使其酶解效率低[33-34],因此需通過預(yù)處理以去除木質(zhì)素和降低木質(zhì)素的天然抗性,這是生物質(zhì)組分分離和提高酶解效率的關(guān)鍵步驟之一[35-37]。常用的預(yù)處理溶劑有酸、堿、亞硫酸鹽、有機溶劑、離子液體(ionic liquid, IL)和DES等[38-39]。采用堿和綠液(green liquor, GL)等溶劑進行預(yù)處理以提高酶解效率已被廣泛應(yīng)用。堿預(yù)處理時,底物中木質(zhì)素的醚鍵斷裂,纖維素酶對纖維素的可及性增大。采用亞硫酸鈉和亞硫酸銨預(yù)處理可有效去除木質(zhì)素,亞硫酸鹽攻擊木質(zhì)素的脂肪族側(cè)鏈、取代羥基和醚等官能團,木質(zhì)素被磺化親水性增強,因此預(yù)處理降低了纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附和空間位阻[40-41]。同樣,有機溶劑也是通過去除木質(zhì)素后纖維素裸露,酶與纖維素的接觸面積增加,酶解效率提高。一般認為ILs去除木質(zhì)素是通過陰離子氫鍵的堿性和陽離子氫鍵的酸性、π-π共價鍵作用和疏水作用來實現(xiàn),預(yù)處理后木質(zhì)素的天然抗性降低,酶和纖維素的有效接觸機會增加,酶解效率提高[42]。DES由氫鍵供體和氫鍵受體構(gòu)成,是室溫下呈熔融態(tài)的混合體系,對木質(zhì)素的作用及后續(xù)生物質(zhì)酶解規(guī)律與ILs相似[43-45]。

BRIENZO等[46]對不同含量木質(zhì)素的蔗渣的研究發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素含量低的酶解效率較高。ZHANG等[47]采用僅由木質(zhì)素和纖維素構(gòu)成的新型薄膜模型研究木質(zhì)素含量對酶解的影響,表明膜中的木質(zhì)素含量越低越有利于膜的酶解。HAO等[48]通過稀酸(dilute acid, DA)和稀堿預(yù)處理玉米秸稈獲取富含木質(zhì)素組分(lignin-rich residues, LRR),分別為LRR-DA和LRR-NaOH,對比發(fā)現(xiàn)LRR-DA對酶解的抑制大于LRR-NaOH,其原因是LRR-DA木質(zhì)素含量較高所致。

此外,通過基因調(diào)控也可降低木質(zhì)素含量或調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成以減少木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附[49]。EDMUNDS等[50]發(fā)現(xiàn),與對照組相比,木質(zhì)素含量低的轉(zhuǎn)基因火炬松(PinustaedaL.)的葡萄糖釋放量增加了1.9倍～3.2倍。MANSFIELD等[51]通過調(diào)控木質(zhì)素含量評估細胞壁中木質(zhì)素對水解效率的影響,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量低的纖維素水解率接近100%。綜上,通過預(yù)處理或基因調(diào)控可降低底物中木質(zhì)素的含量,可有效降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制。

2.2 木質(zhì)素的分布

無論選用何種預(yù)處理溶劑或預(yù)處理方式,經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維中仍有木質(zhì)素殘留,然而預(yù)處理過程中木質(zhì)素和半纖維素的部分去除及組分間化學連接鍵的斷裂,使木質(zhì)素含量和原有位置發(fā)生輕微移動并重新分布。例如水熱、氨纖維膨脹(ammonia fiber expansion, AFEX)、蒸汽爆破和稀硫酸等預(yù)處理均引起了底物組成和結(jié)構(gòu)的改變,纖維素酶與纖維素的可及性增強,酶解效率提高[52]。WANG等[53]發(fā)現(xiàn)水熱預(yù)處理后酶解效率有大幅度提升,發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化率提高了3.5倍。

然而,預(yù)處理會導(dǎo)致木質(zhì)素發(fā)生縮合沉積或形成偽木質(zhì)素等,對纖維素酶產(chǎn)生非生產(chǎn)性吸附從而抑制酶解[54]。經(jīng)水熱預(yù)處理后形成的球形木質(zhì)素液滴對酶解產(chǎn)生了抑制[29]。ZHAO等[55]發(fā)現(xiàn)與未處理時相比,經(jīng)H2O2/底物加載AFEX預(yù)處理后毛竹中的木質(zhì)素含量增加,這是預(yù)處理過程中解離的木質(zhì)素液滴再凝結(jié)形成新的大分子、木質(zhì)素和半纖維素部分降解形成偽木質(zhì)素,造成木質(zhì)素含量提高。類似地,經(jīng)水熱預(yù)處理的秸稈由于木質(zhì)素液滴在底物表面的不斷積累,水解速率呈降低的趨勢[56]。SHINDE等[57]報道了稀酸預(yù)處理時有木質(zhì)素類聚物(偽木質(zhì)素)形成,對酶有非生產(chǎn)性吸附。同時HU等[58]發(fā)現(xiàn),偽木質(zhì)素對酶解的抑制較大,這是偽木質(zhì)素中存在甲氧基和多芳烴結(jié)構(gòu),對纖維素酶有較強的吸附性,導(dǎo)致底物與酶接觸機會減小,抑制效果增強。

2.3 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)

2.3.1 木質(zhì)素相對分子質(zhì)量 不同相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素對酶解有不同的影響[59]。LI等[60]發(fā)現(xiàn)高相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素易沉積到纖維素表面,沉積的木質(zhì)素增大了纖維素酶與纖維素的空間位阻;相反,低相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素不易沉積反而有降低木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附作用。云杉水解預(yù)處理中,2-萘酚和二甲基間苯三酚的引入導(dǎo)致木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量顯著降低,酶解效率提高了39%和42%[61]。此外,LAI等[62-63]發(fā)現(xiàn)低相對分子質(zhì)量的有機溶劑木質(zhì)素,在添加酶解體系后促進了木質(zhì)纖維的酶解。綜上,不同來源和相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素對纖維素的酶解有不同程度的影響,低相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素對酶解的抑制小于高相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素,甚至對酶解有促進作用。

2.3.2 木質(zhì)素S/G值及相對豐度 不同S/G值的木質(zhì)素對酶解效率也有一定影響。STUDER等[64]發(fā)現(xiàn)高S/G值的樣品有利于酶解中還原糖的釋放。溫和的預(yù)處理條件和相近的纖維素酶用量條件下,玉米秸稈的酶解效率遠高于柳枝稷[65],且發(fā)現(xiàn)玉米秸稈中木質(zhì)素的S/G值為1.4,柳枝稷則為0.8,這與高S/G值有利于酶解的結(jié)論相吻合[66-67]。然而也有不一致的報道。XU等[68]發(fā)現(xiàn)高S/G值的木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)吸附增強,不利于纖維素的酶解。TAN等[69]觀察到經(jīng)亞硫酸氫鹽預(yù)處理的油棕空果束木質(zhì)素的S/G值較高,然而S/G值的高低卻與酶解效率呈負相關(guān)。PAPA等[70]表明,IL預(yù)處理的桉木S/G值對生物質(zhì)糖化效率幾乎無影響,同時該課題組也發(fā)現(xiàn)對未處理的生物質(zhì),雖然底物有高S/G值但酶解效率仍很低。因此,木質(zhì)素S/G值對纖維素的酶解規(guī)律尚需深入研究。

有研究表明,木質(zhì)素中S型、G型和H型的相對豐度對酶解效率也有不同程度的影響。KIM等[71]發(fā)現(xiàn),與經(jīng)硫酸預(yù)處理的生物質(zhì)對比,草酸預(yù)處理的對酶解抑制更明顯,原因是經(jīng)草酸預(yù)處理的樣品含有大量的G型木質(zhì)素,對纖維素酶具有較高的親和力,抑制明顯。類似地,KO等[72]發(fā)現(xiàn),含有較高G型的軟木木質(zhì)素比硬木對酶解有更強的抑制。此外,也有研究表明從木材中提取的木質(zhì)素比從草本類中提取的對纖維素酶酶解抑制更顯著,并且發(fā)現(xiàn)草本木質(zhì)素結(jié)構(gòu)松散,H型結(jié)構(gòu)含量高[73],這是由于G型木質(zhì)素對纖維素酶的親和力高于S型和H型[72, 74]。BONAWITZ等[75]研制了一種新的擬南芥突變體,其木質(zhì)素幾乎完全由H型組成,發(fā)現(xiàn)其酶解效率較高。另外還有研究發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素中羥基肉桂酸酯的存在使生物質(zhì)的頑固性和抗性更強,阿魏酸酯(ferulates, FA)和對香豆酸酯(p-coumarates, pCA)是草本中2種重要的羥基肉桂酸酯,FA的存在木質(zhì)素與纖維素之間結(jié)合更為緊密,底物的頑固性更強,因而酶解效率較低[76]。REINOSO等[77]發(fā)現(xiàn),由于酯鏈pCA的存在,底物的抗性較強,然而經(jīng)堿預(yù)處理后底物的FA和pCA發(fā)生裂解,對酶解有促進作用。

2.3.3 木質(zhì)素化學結(jié)構(gòu) 木質(zhì)素含有的官能團例如酚羥基、脂肪羥基、羧基和甲氧基等對纖維素的酶解也有影響。研究表明,酚羥基含量高的木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附較強[78],原因是氫鍵的形成促進了纖維素酶與木質(zhì)素的結(jié)合。HUANG等[79]發(fā)現(xiàn),木質(zhì)素中酚羥基的含量與對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附能力呈正相關(guān),而與脂肪羥基含量呈負相關(guān)。YU等[23]研究了羥基對酶解的影響,發(fā)現(xiàn)纖維素酶對MWL的吸附能力隨著總羥基含量的減少而增加,而脂肪族羥基的減少是引起總羥基變化的主要原因。羧基的存在對酶解有一定的促進作用,原因是羧基增加了親水性能。YING等[80]發(fā)現(xiàn),堿預(yù)處理結(jié)合羧基化處理可將酶促效率提高1.5倍～3.4倍,歸因于羧基含量的增加。GUO等[81]發(fā)現(xiàn),與紅麻和白楊木質(zhì)素相比,玉米秸稈中MWL與纖維素酶具有較強的親和力,原因是玉米秸稈MWL的羧基含量低,酚羥基含量高,對酶解有抑制。此外,有研究表明,甲氧基與酶解效率之間無相關(guān)性[82]。QIN等[83]利用木質(zhì)素模型化合物研究了甲氧基與酶解效率的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)甲氧基的引入對酶解無明顯影響。木質(zhì)素中的官能團與酶解效率之間的關(guān)系與生物質(zhì)來源和預(yù)處理方法有關(guān),因此木質(zhì)素的官能團對酶解的影響有待于深入研究。

除官能團外,木質(zhì)素的化學鍵例如β—O—4鍵的含量等對纖維素酶酶解也有影響。預(yù)處理通常引起β—O—4鍵的斷裂和新化學鍵的形成,β—O—4鍵的斷裂破壞細胞壁的天然抗性,理論上有助于纖維素酶酶解。楊木經(jīng)水熱預(yù)處理[78]和柳枝稷經(jīng)稀酸預(yù)處理后大量的β—O—4鍵發(fā)生斷裂[67],對酶解有促進作用。但β—O—4鍵的斷裂產(chǎn)生較多的游離酚羥基,酚羥基不利于酶解。YOO等[19]表明,楊木經(jīng)有機溶劑預(yù)處理后殘留木質(zhì)素中β—O—4鍵的含量顯著降低但酚羥基含量明顯增加,隨酚羥基含量的增加木質(zhì)素對纖維素酶吸附能力增強,但經(jīng)預(yù)處理的楊木酶解效率并未提高。此外,預(yù)處理中木質(zhì)素通過縮合形成新的碳-碳鍵,導(dǎo)致底物與纖維素酶之間疏水作用增加[79]。SONG等[84]發(fā)現(xiàn),經(jīng)DES預(yù)處理的柳木和玉米秸稈中的木質(zhì)素發(fā)生了縮合反應(yīng),木質(zhì)素與酶的疏水作用增強,預(yù)處理后酶解效率并未升高。

木質(zhì)素通過共價鍵與半纖維素的側(cè)鏈形成木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物(lignin-carbohydrate complex, LCC),形成天然抗性[68],因此通過預(yù)處理破壞LCC的鏈接鍵,提高底物的酶解效率。SINGH等[85]通過AFEX預(yù)處理破壞了LCC,發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后酶解效率顯著提高。同時LI等[86]也發(fā)現(xiàn),經(jīng)水熱預(yù)處理后LCC的斷裂促進了樣品的酶解。JEONG等[87]采用Fenton氧化-水熱法分別預(yù)處理落葉松和黃楊獲取對應(yīng)的LCC,結(jié)果發(fā)現(xiàn)落葉松和黃楊LCC的酶解率分別為26.23%和93.53%,同時發(fā)現(xiàn)落葉松LCC中β—β鍵和β—5鍵的含量高于黃楊LCC,表明β—β鍵和β—5鍵的存在不利于酶解。另外,LAI等[25]從乙醇有機溶劑預(yù)處理的木屑中分離出EL和MWL,發(fā)現(xiàn)MWL對纖維素酶酶解抑制大于EL,原因是MWL的β—5鍵豐度較高。TAN等[69]發(fā)現(xiàn)樣品中木質(zhì)素含量相當?shù)那闆r下,LCC的含量與S/香草醛(vanillin,V)值呈正相關(guān),表明S/V值越高對酶解的抑制越強。上述研究表明,β—β鍵和β—5鍵的存在不利于底物的酶解。

綜上,預(yù)處理及木質(zhì)素的含量、木質(zhì)素的分布、相對分子質(zhì)量、木質(zhì)素中S/G值及豐度、木質(zhì)素含有的官能團和化學鍵類型及含量等對纖維素酶酶解均有一定的影響。經(jīng)預(yù)處理的底物酶解效率除了受本身組成、結(jié)構(gòu)特點和理化特性例如比表面積和孔體積等影響外,還與預(yù)處理過程中解離的木質(zhì)素和木質(zhì)素基衍生物的空間位阻等有關(guān)[88]。底物中殘留木質(zhì)素含有高S/G值、羧基和脂肪族羥基含量高有利于纖維素酶酶解,然而高含量的酚羥基、羥基肉桂酸酯、β—β鍵、β—5鍵等對酶解不利[64, 82]。

3 木質(zhì)素降低纖維素酶酶解抑制途徑

3.1 不同類型木質(zhì)素的引入

3.1.1 改性木質(zhì)素 對木質(zhì)素進行改性,可適當降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制?；腔举|(zhì)素(sulfonated lignin ,SL)、木質(zhì)素磺酸鹽(lignosulfonate, LS)、水溶性木質(zhì)素(water soluble lignin,WSL)及一些相對分子質(zhì)量低的堿木質(zhì)素等可以適當降低對纖維素酶酶解抑制。研究發(fā)現(xiàn),LS的引入降低了對纖維素酶酶解抑制,原因是LS有親水性能,對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附減少[24]。ZHU等[89]將3種不同相對分子質(zhì)量的LS引入酶解體系中,發(fā)現(xiàn)低相對分子質(zhì)量的LS比高相對分子質(zhì)量更有助于降低纖維素酶酶解抑制。此外,可溶性堿木質(zhì)素和硫酸鹽Kraft木質(zhì)素也可有效降低對纖維素酶酶解抑制[90]。上述研究表明,LS對底物的酶解影響與底物中殘留的木質(zhì)素有關(guān),WSL降低對維素酶酶解的抑制與WSL和殘留木質(zhì)素對纖維素酶形成“競爭性吸附”有關(guān)。

受WSL可有效降低對纖維素酶酶解抑制的啟發(fā),關(guān)于木質(zhì)素親水改性以降低對酶解抑制方面的研究得到關(guān)注[91-94]。乙醇有機溶劑木質(zhì)素的親水改性使木質(zhì)素與纖維素酶的結(jié)合強度降低,從而消除了76%～96%的木質(zhì)素抑制[88]。堿木質(zhì)素通過磺化改性、氧化改性和羧基化改性[80]可使木質(zhì)素接觸角降低,對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附降低。類似地,木質(zhì)素的磺化和羧基化改性提高了木質(zhì)素的親水性,相對于未改性的木質(zhì)素,改性木質(zhì)素可使纖維素酶酶解效率提高8.0%～15.3%。另外也有研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PEG-1000修飾后的堿木質(zhì)素則對纖維素酶酶解有促進作用[16]?？傊?木質(zhì)素的親水改性一定程度上減少了纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附,有利于酶解。這一現(xiàn)象表明,改性后的WSL有效地降低了對纖維素酶酶解抑制。上述研究結(jié)果為木質(zhì)素的應(yīng)用提供了新的思路。

3.1.2 含有羧基的不溶性木質(zhì)素 從木質(zhì)纖維原料中提取或經(jīng)預(yù)處理后可獲取木質(zhì)素,在中性或酸性條件下得到的木質(zhì)素大多不溶于水,這類木質(zhì)素稱為WIL。多數(shù)木質(zhì)素對纖維素酶酶解存在抑制。然而,有報道引入某種類型的WIL時對纖維素酶酶解抑制有一定程度下降。例如,乙醇有機溶劑木質(zhì)素可降低對纖維素酶酶解抑制[62],其原因是乙醇和水極性相似,有少許溶于水,并且該木質(zhì)素的相對分子質(zhì)量較低,抑制是由這部分水溶性木質(zhì)素引起的。此外,WIL中羧基含量高也可降低纖維素酶酶解抑制[14]。JIA等[91]研究了外源木質(zhì)素對纖維素酶酶解的影響,采用γ-戊內(nèi)酯/水預(yù)處理玉米秸稈獲得的2種木質(zhì)素分別加入酶解體系后,纖維素的轉(zhuǎn)化率從28.0%提高到37.4%和31.3%,對纖維素酶酶解抑制降低的原因是這2種木質(zhì)素中均含有羧基。上述研究表明,含有羧基的WIL可降低對纖維素酶酶解抑制。

3.1.3 降低纖維素酶酶解抑制原理 有報道表明,低相對分子質(zhì)量WIL和WSL,以及改性木質(zhì)素在一定程度上降低了木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制[95],該結(jié)論為降低纖維素酶酶解抑制提供了新的思路。WSL屬于新型木質(zhì)素,可減少纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附,但WSL降低纖維素酶酶解抑制的原因尚無明確定論。WSL與纖維素酶結(jié)合會形成木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物,推測這是WSL降低纖維素酶酶解抑制的關(guān)鍵。WSL引入酶解體系后,纖維素酶將和底物中含有的內(nèi)源性木質(zhì)素及添加的外源性WSL同時作用,而二者因分子結(jié)構(gòu)的差異影響其相互作用即產(chǎn)生競爭性吸附。WSL降低纖維素酶酶解抑制主要分為2種,即WSL的引入導(dǎo)致WSL與底物中的木質(zhì)素發(fā)生競爭性吸附,形成WSL-纖維素酶配合物,以及WSL作為表面活性劑穩(wěn)定纖維素酶促進纖維素酶對纖維素的可及性[90, 96]。

在含有木質(zhì)素的底物中,WSL的添加可降低纖維素酶與底物中木質(zhì)素之間的非生產(chǎn)性吸附。另外,通過調(diào)控底物中木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)可以增加纖維素酶與外來木質(zhì)素之間的競爭性,降低對纖維素酶酶解抑制。有研究表明,LS與其他陰離子聚電解質(zhì)含有相同的電離基團,可與BSA結(jié)合形成LS-BSA復(fù)合物[94]。WANG等[90]報道了LS與纖維素酶結(jié)合形成親水的纖維素酶- LS復(fù)合物,通過減弱疏水和靜電作用降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制。ZHENG等[21]研究表明LS的引入促進了LS-稀酸預(yù)處理甘蔗渣 (dilute acid pretreated sugarcane bagasse,DA-SCB)木質(zhì)素復(fù)合物和LS-纖維素酶復(fù)合物的形成,從而增加了纖維素酶與DA-SCB木質(zhì)素之間的靜電排斥作用,纖維素酶與纖維素的結(jié)合位點增加,從而減少了纖維素酶在DA-SCB上的非生產(chǎn)吸附。同時,LS作為表面活性劑減少了纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)吸附作用。除LS外,還開發(fā)了其他改性木質(zhì)素,類似地也降低了纖維素酶在木質(zhì)素上的非生產(chǎn)性吸附[95]。

對純纖維素底物,多數(shù)研究表明WSL抑制純纖維素的酶解,原因是純纖維素底物中不含木質(zhì)素,WSL作為外源木質(zhì)素無法和底物形成競爭性吸附,相反纖維素酶在WSL上產(chǎn)生非生產(chǎn)性吸附,導(dǎo)致纖維素酶在纖維素表面的有效吸附減少[96]。與酶蛋白相比,WSL的相對分子質(zhì)量較小,特定條件下WSL與纖維素酶的吸附域結(jié)合形成復(fù)合物,即WSL封閉了纖維素酶的部分吸附域,限制了纖維素酶與纖維素的結(jié)合,因此在純纖維素底物酶解時WSL對酶解并無促進作用。同時也有研究表明,LS阻礙了純纖維素的酶解,ZHENG等[21]發(fā)現(xiàn)LS與Avicel結(jié)合,形成Avice-LS配合物,占據(jù)了纖維素酶與Avicel的結(jié)合位點,從而纖維素酶在Avicel上的有效吸附降低。LIU等[96]和WANG等[97]的研究也證實了該結(jié)論,即纖維素酶在LS上的非生產(chǎn)性吸附是抑制純纖維素底物酶解的主要原因。但也有少許關(guān)于WSL促進純纖維素水解的報道。LOU等[16]發(fā)現(xiàn),3種不同分子質(zhì)量的LS的引入可提高純纖維素的酶解,認為LS-纖維素酶復(fù)合物可以改善和穩(wěn)定纖維素酶與纖維素的結(jié)合。WSL的引入對純纖維素酶酶解體系產(chǎn)生影響,該影響與WSL的相對分子質(zhì)量和類型有關(guān)。

綜上,對木質(zhì)素進行親水改性和提高WIL的羧基含量是降低對纖維素酶抑制的有效策略,且WSL-纖維素酶復(fù)合物的形成可降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制[98],但是復(fù)合物如何影響纖維素-木質(zhì)素-酶的相互作用尚無定論,仍需深入研究。

3.2 現(xiàn)代技術(shù)手段的應(yīng)用

用于解析木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制的現(xiàn)代技術(shù)分析手段主要有QCM-D、表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)、AFM、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(fourier transform attenuated total reflection infrared spectroscopy, FTIR-ATR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光譜、熒光光譜(fluorescence spectroscopy, FLS)和分子動力學(molecular dynamics, MD)模擬等。其中,QCM-D、SPR和AFM在揭示木質(zhì)素-纖維素酶作用方面取得了一定進展。HE等[99]借助QCM-D研究了偽木質(zhì)素和殘余木質(zhì)素對酶解的影響,酶解動力學研究表明當偽木質(zhì)素和殘留木質(zhì)素與纖維素混合時,葡萄糖釋放量減少。JIANG等[100]借助LiCl/DMSO體系制備了全組分木質(zhì)纖維素超薄膜,QCM-D薄膜的原位酶解過程證實了纖維素酶對木質(zhì)素的非生產(chǎn)性吸附。PEREIRA等[101]利用 SPR 在不同離子強度的緩沖溶液中進行酶吸附實驗,發(fā)現(xiàn)靜電作用起著重要作用。

利用AFM測定木質(zhì)素與纖維素酶之間的相互作用力獲得表面圖像,同時也可用于化學特性的分析,測定特定材料和分子之間的相互作用。ARSLAN等[102]利用AFM分析纖維素酶疏水殘基模型表面和用不同方法預(yù)處理的生物質(zhì)底物之間的納米尺度空間作用力。AFM也用于測定Cel7A 的碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate binding module, CBM)和3種木質(zhì)纖維素基底之間的納米尺度,結(jié)果表明,基質(zhì)對CBM的總黏附力與表面木質(zhì)素覆蓋率呈正相關(guān),同時,改變木質(zhì)素的表面疏水性和表面能是避免纖維素在LS上非生產(chǎn)性吸附的先決條件[103]。

綜上,隨著科技的進步,解析木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制的技術(shù)手段將越來越先進,明確其機制然后采取對應(yīng)的措施降低其抑制,有助于木質(zhì)纖維資源全組分的開發(fā)與利用。

4 存在問題與展望

木質(zhì)纖維素酶酶解是利用糖平臺技術(shù)轉(zhuǎn)化生物平臺化合物和生物燃料的關(guān)鍵步驟,由于木質(zhì)素和纖維素酶結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性,其相互作用尚未清晰,明確木質(zhì)素與纖維素酶間的疏水作用、氫鍵、靜電締合等作用是提高酶解效率的前提條件。因此,如何識別木質(zhì)素與纖維素酶間的疏水、靜電和氫鍵相互作用,是未來研究木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制的出發(fā)點之一。

通過預(yù)處理去除木質(zhì)素的成本高,預(yù)處理后廢液對環(huán)境有不良影響,同時預(yù)處理過程還會導(dǎo)致木質(zhì)素縮合或偽木質(zhì)素的形成,促使木質(zhì)素對纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附增強。因此,選擇適宜的預(yù)處理溶劑或技術(shù),或?qū)δ举|(zhì)素進行適宜的改性等,是降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制的有效途徑之一。另外也可通過基因工程技術(shù)改變木質(zhì)素含量、調(diào)控木質(zhì)素的生物合成等方式降低對纖維素酶酶解抑制。未來的研究需借助先進的技術(shù)手段,從微觀角度和分子水平上揭示木質(zhì)素與纖維素酶的相互作用,以降低木質(zhì)素對纖維素酶酶解抑制,為高效、經(jīng)濟利用纖維素和木質(zhì)素生物質(zhì)組分提供有效途徑。