陳昕宇, 張真, 張?jiān)缌? 宋圓圓, 曾任森, 盧龍

(福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院,作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350002)

土地鹽漬化已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)不可忽視的一大難題[1]。鹽漬化在造成鹽脅迫的同時(shí)又會(huì)引發(fā)滲透脅迫與氧化損傷,進(jìn)而影響作物種子萌發(fā)、作物生長(zhǎng)及器官發(fā)育,在嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致作物萎蔫,甚至死亡[2]。中國(guó)當(dāng)前土地鹽漬化擴(kuò)大嚴(yán)重,由此造成耕地面積不斷減少,是制約大豆生產(chǎn)的重要原因之一。大豆是中國(guó)重要的糧食和油料作物,其種子是重要的植物蛋白與油脂來(lái)源,也是中國(guó)工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要原材料。但大豆是一種中等鹽敏感作物,鹽脅迫會(huì)降低大豆的發(fā)芽率與出苗率,干擾節(jié)瘤,減少大豆生物量累積,最終嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量[3-5]。

自然界中植物的根部聚集著特定種類(lèi)的微生物,被稱(chēng)為根系微生物組[6-8]。根系微生物根據(jù)其受根系影響和調(diào)控的程度被分為根際微生物、根表微生物及根內(nèi)微生物[9]。根系微生物通過(guò)改進(jìn)土壤養(yǎng)分的有效性、與植物的互作、拮抗病原菌、誘導(dǎo)植物抗性等方式,促進(jìn)植物生長(zhǎng),增強(qiáng)植物抗逆性,對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[10-11]。根系微生物的變化既能反應(yīng)土壤性質(zhì)的變化,也能在一定程度上反應(yīng)植物生長(zhǎng)的變化[12-13]。當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí),其根系微生物也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變,部分微生物甚至參與了植物抵御脅迫的過(guò)程。例如,在植物遭遇鹽脅迫時(shí),根系微生物會(huì)分泌生長(zhǎng)素等植物激素類(lèi)物質(zhì)幫助植物抵御鹽脅迫[14]。在干旱或洪澇脅迫下,如根瘤菌等根系微生物會(huì)分泌胞外多糖(EPSs)幫助植物抵御脅迫[15]。

隨著微生物組學(xué)及高通量測(cè)序技術(shù)的興起與發(fā)展,擬南芥[16]、水稻[17]、玉米[18]等植物的根系微生物結(jié)構(gòu)特征得到研究。已有研究表明,植物根系微生物的結(jié)構(gòu)受其所處環(huán)境,植物的基因型及其生長(zhǎng)狀態(tài)等因素決定[19],而在特定的土壤環(huán)境中,根系微生物的結(jié)構(gòu)受到植物根系分泌物的調(diào)控[20]。

近年來(lái),已有學(xué)者對(duì)鹽害條件下多種植物的根系微生物進(jìn)行研究[21]。但多集中于群落結(jié)構(gòu)分析及農(nóng)藝性狀改良應(yīng)用方面[22-23],對(duì)鹽脅迫下不同基因型大豆根系微生物群落結(jié)構(gòu)變化及耐鹽大豆根系微生物的篩選研究較少。本研究通過(guò)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)研究鹽敏感和耐鹽2個(gè)大豆品種在對(duì)照條件和鹽脅迫條件下的根系微生物群落結(jié)構(gòu)差異,揭示鹽脅迫條件下大豆根系微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,從中篩選可能影響大豆耐鹽性的有益菌株,進(jìn)而深入了解根系微生物介導(dǎo)的大豆耐鹽機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及方法

供試大豆品種分別為鹽敏感的科豐1(KF)和耐鹽的南農(nóng)1183-2(NN)。依照處理方式不同將所有樣本分為4組:KF_R_W(科豐1對(duì)照處理)、KF_R_N(科豐1鹽處理)、NN_R_W(南農(nóng)1183-2對(duì)照處理)、NN_R_N(南農(nóng)1183-2鹽處理)。

將大豆種子播于內(nèi)徑7 cm,高8 cm的塑料花盆中,所有花盆置于托盤(pán)中,待大豆出苗后,每3 d于托盤(pán)內(nèi)用1 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌1次。每盆大豆定苗4株,待第1片復(fù)葉長(zhǎng)出時(shí),取生長(zhǎng)情況相同的大豆按品種與處理方式不同分為4組。試驗(yàn)組每3 d澆灌1次1 L 120 mmol·L-1NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。處理7 d后,挖出大豆的完整根系,取樣參照胡雅麗等[24]的方法,先用無(wú)菌水洗掉粘在大豆根上的松散的土壤顆粒,接著放入裝有25 mL PBS緩沖液的50 mL管中,180 r·min-1搖晃清洗3次,然后用無(wú)菌濾紙吸干根表面水分,最后將樣本放入-80 ℃中保存。

1.2 DNA提取、16S擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

采用MoBio的土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒(PowerSoil? DNA Isolation Kit)對(duì)大豆根系樣品完成基因組DNA抽提后,利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提基因組DNA后,采用簡(jiǎn)并PCR引物799F:AACMGGATTAGATACCCKG以及1492R:ACGTCATCCCACCTTCC,對(duì)16SRNA基因的V5～V7區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增完成后對(duì)PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小,并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化,再進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建,最后進(jìn)行Miseq上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析與制圖

對(duì)測(cè)序得到的Pair-End(PE)雙端序列數(shù)據(jù),使用Trimmomatic (v0.36)、Pear (v0.9.6)、Flash (v1.20)、Vsearch (v2.7.1)軟件進(jìn)行質(zhì)控與拼接處理,采用uchime方法及自比對(duì)(denovo)方法去除嵌合體以及不合要求的短序列,最終得到優(yōu)質(zhì)序列。使用Qiime(version 1.8.0)軟件對(duì)所有序列進(jìn)行OTU(operational taxonomic units,可操作分類(lèi)單元)聚類(lèi)(相似水平97%)分析,并進(jìn)行注釋,最后計(jì)算各樣本的Alpha多樣性指數(shù)和Beta多樣性指數(shù);采用PICRUSt2軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。采用SPSS 26對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析;采用R語(yǔ)言工具及graph8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與作圖;通過(guò)MAGE11軟件選擇Test UPGMA Tree算法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)狀圖;使用R及其igraph包,psych包對(duì)共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣本根系微生物群落結(jié)構(gòu)

2.1.1 OTU及多樣性分析 Shannon-wiener是反映樣本中微生物多樣性的指數(shù),利用各樣本的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線,以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。測(cè)序結(jié)果表明,所有樣本的Shannon-wiener曲線最終都趨于平坦(圖1),且覆蓋率都在99%以上(表1),表明測(cè)序結(jié)果達(dá)到要求,可以反映樣本的真實(shí)情況。各組的Chao指數(shù)與物種數(shù)沒(méi)有明顯差異,KF_R_W的Shannon-wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)低于KF_R_N,而NN_R_W的Shannon-wiener指數(shù)與Simpson指數(shù)顯著高于NN_R_N(p<0.05),這表明在鹽脅迫條件下大豆的根系微生物多樣性均發(fā)生改變。

表1 4組大豆根系樣本的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index of root-associated samples from four groups of soybeans

圖1 4組大豆根系樣本Shannon-wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curves of microorganism in root-associated samples from four groups of soybeans

由各組根系微生物的OTU(操作分類(lèi)單元,operational taxonomic units)所構(gòu)建的Venn圖可知(圖2),KF_W、NN_W、KF_N、NN_N各處理共有820個(gè)OTU。所有處理共有的OTU數(shù)目為209個(gè),這可能代表了KF與NN 2種大豆根系中存在穩(wěn)定的菌種。KF_W、NN_W、KF_N、NN_N 4種處理方式特有的OTU個(gè)數(shù)依次為31、95、63、105。無(wú)論是對(duì)照條件下還是鹽脅迫條件下,NN的OTU數(shù)大于KF。因此,在鹽脅迫處理下,兩種大豆的根系微生物群落菌屬均發(fā)生改變,不但存在相似部分也衍生出特有部分,群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖2 4組大豆根系微生物樣本OUT數(shù)Venn圖Fig.2 Venn diagram based on OUT number of root microbiota samples from four groups of soybeans

2.1.2 不同樣本微生物群落差異性分析 通過(guò)基于unifrac及bray-curtis的主坐標(biāo)(principal coordinates analysis PCoA)分析4組大豆根系樣本的微生物多樣性(圖3)。圖3顯示,在第一主坐標(biāo)軸上2種大豆的根系微生物組按照處理環(huán)境被分為了2簇,表明環(huán)境差異導(dǎo)致了大豆根系微生物的組成不同,是本研究造成微生物差異的主要來(lái)源,證明鹽脅迫處理是影響2種大豆根系微生物群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素。

PCoA橫縱軸上所標(biāo)注的比例即該主坐標(biāo)對(duì)樣品矩陣數(shù)據(jù)差異的貢獻(xiàn)度。4組樣本的根系微生物組在PCoA的第一軸上(主成分1)按處理方式分開(kāi),第二軸上(主成分2)按基因型分開(kāi),組間差異顯著(p<0.001)。The values displayed on the horizontal and vertical axis of principal coordinate analysis (PCoA) represent the extent to which each principal coordinate contributes to the dissimilarity observed in the sample matrix data. The root microbiomes of the four groups were distinguished by treatment along the first axis (principal component 1) and by genotype along the second axis (principal component 2). These differences were found to be statistically significant among the groups (p<0.001).

利用樹(shù)枝結(jié)構(gòu)描述和比較多個(gè)樣本間的相似性和差異關(guān)系,即根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類(lèi)(hierarchical clustering)分析[25],使用非加權(quán)組平均法UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu),得到4組大豆的根系微生物群落結(jié)構(gòu)樹(shù)狀關(guān)系如圖4所示,同一處理?xiàng)l件下的不同基因型大豆各自處于不同的分支,表明基因型也是影響大豆根系微生物群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素之一。

圖4 4組大豆根系微生物樣本Hcluster分析結(jié)果Fig.4 Hierarchical clustering analysis (Hcluster) of root microbiota from four groups of soybeans

2.2 鹽脅迫對(duì)大豆根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門(mén)水平的影響

4組大豆根系樣本中的微生物在門(mén)水平上的相對(duì)豐度如圖5所示,門(mén)一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)Proteobacteria,變形菌門(mén)無(wú)論在對(duì)照還是鹽脅迫下,在2種大豆的根系中所占比例均超過(guò)90%,高于其他任何菌門(mén)。KF_R_N相較于KF_R_W根系中的放線菌門(mén)Actinobacteriota與擬桿菌門(mén)Bacteroidota所占比例升高,分別由0.347%上升至6.810%,0.072%上升至1.043%。而NN_R_N變形菌門(mén)由97.890%上升至98.870%,其余菌門(mén)豐度均未超過(guò)0.500%。

圖5 4組大豆根系微生物樣本在門(mén)水平上的相對(duì)豐度Fig.5 The relative abundance of root microbiota in samples from four groups of soybeans at phylum level

2.3 鹽脅迫對(duì)大豆根系細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平的影響

對(duì)4組大豆根系樣本中的微生物在屬水平上的相對(duì)豐度如圖6所示。在屬水平上, KF_R_W的根系微生物中,排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬為:艾德昂菌屬I(mǎi)deonella(72.45%),根瘤菌屬Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium(4.94%),馬賽菌屬M(fèi)assilia(2.43%)。艾德昂菌屬占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),所占比例超過(guò)70.00%, 其余菌屬比例均未超過(guò)10%;在鹽脅迫條件下,排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬為:根瘤菌屬(22.39%),假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas(17.04%),艾德昂菌屬(12.32%)。艾德昂菌屬比例顯著下降,由72.45%下降至12.32%,根瘤菌屬與假黃單胞菌屬比例顯著上升,分別從4.94%上升至22.39%,0.22%上升至17.04%。NN_R_W根系微生物各個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬比例相對(duì)均勻,排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬依次為:艾德昂菌屬(13.82%),馬賽菌屬M(fèi)assilia(11.81%),嗜甲基菌屬M(fèi)ethylophilus(11.58%);在鹽脅迫條件下,排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬為:艾德昂菌屬(45.40%),假單胞菌屬Pseudomonas(25.78%),根瘤菌屬(6.83%),假單胞菌屬占比上升,由對(duì)照條件下時(shí)的2.15%提高至25.78%,成為NN_R_N的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖6 4組大豆根系微生物樣本在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.6 The relative abundance of root microbiota in samples from four groups of soybeans at genus level

2.4 Co-occurrence network共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析

在對(duì)微生物群落的研究中,Co-occurrence network共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)常被用以表示群落中微生物的互作關(guān)系[26]。以所有樣本中絕對(duì)豐度前20的屬水平結(jié)果進(jìn)行相互關(guān)聯(lián)性分析并構(gòu)建共顯性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖7所示。所有大豆根系樣本中參與構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的微生物絕對(duì)豐度前20的菌屬均為變形菌門(mén)Proteobacteria或放線菌門(mén)Actinobacteriota,且變形菌門(mén)無(wú)論在豐度與菌屬的種類(lèi)上均占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。艾德昂菌屬盡管豐度占比最大,但多與其他菌屬負(fù)相關(guān),而作為植物促生根系菌(PGPB)的根瘤菌屬及假單胞菌屬與多數(shù)菌屬呈正相關(guān)。

圖中各點(diǎn)代表微生物的屬,點(diǎn)的大小代表微生物屬豐度的大小,線的粗細(xì)代表相關(guān)性大小;點(diǎn)的顏色代表所屬門(mén),線為紅色表示呈正相關(guān),藍(lán)色表示呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。In the given diagram, each data point corresponds to a specific genus of microorganism. The size of the data point is indicative of the relative abundance of the genus, while the thickness of the connecting lines represents the strength of correlation between the genera. Additionally, the color of the data points corresponds to the category to which they belong. Notably, a red line signifies a positive correlation, whereas a blue line signifies a negative correlation.

2.5 菌群相關(guān)功能預(yù)測(cè)

通過(guò)PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)對(duì)2種大豆正常環(huán)境下與鹽脅迫條件下根系微生物群落的代謝功能進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如圖8所示。在對(duì)照條件下,大豆根系微生物中,生物降解代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism),輔助因子及維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins),碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism),氨基酸代謝(amino acid metabolism)豐度最高,表明大豆根系微生物代謝狀態(tài)活躍。相對(duì)于對(duì)照條件,NN_R_N根系微生物在生物降解代謝、脂類(lèi)代謝(lipid metabolism)以及氨基酸代謝方面豐度高于KF_R_N,尤其在色氨酸代謝方面,NN_R_N高于KF_R_N(圖9),而色氨酸的一條關(guān)鍵代謝途徑則是合成吲哚乙酸(IAA)。這表明耐鹽大豆根系微生物可能通過(guò)生物降解以及脂類(lèi)、氨基酸代謝參與調(diào)節(jié)并提高大豆對(duì)鹽脅迫的耐受性。

1: 生物降解和代謝; 2: 核苷酸代謝; 3: 萜類(lèi)和多酮類(lèi)代謝; 4: 其它氨基酸代謝; 5: 輔助因子和維生素代謝; 6: 脂類(lèi)代謝; 7: 聚糖生物合成和代謝;8: 能量代謝; 9: 碳水化合物代謝; 10: 其它次生代謝產(chǎn)物的生物合成; 11: 氨基酸代謝。1: Xenobiotics biodegradation and metabolism; 2: Nucleotide metabolism; 3: Metabolism of terpenoids and polyketides; 4: Metabolism of other amino acids; 5: Metabolism of cofactors and vitamins; 6: Lipid metabolism; 7: Glycan biosynthesis and metabolism; 8: Energy metabolism; 9: Carbohydrate metabolism; 10: Biosynthesis of other secondary metabolites;11: Amino acid metabolism.

圖9 4組大豆根系微生物的色氨酸代謝通路差異Fig.9 Differences in the tryptophan metabolism pathway among four groups of soybean root microbiota

3 結(jié)論與討論

基于16S高通量測(cè)序技術(shù)鹽脅迫下大豆根系微生物多樣性的研究結(jié)果表明,基因型及環(huán)境均導(dǎo)致大豆根系微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同樣在小麥,冬棗,煙草等植物的研究中均發(fā)現(xiàn)基因型與環(huán)境是改變植物根系微生物的重要驅(qū)動(dòng)因素[27-28]?；跇颖綩TU建立的Venn圖結(jié)果顯示,在對(duì)照與鹽脅迫條件下,2種大豆的根系微生物群落均發(fā)生改變。對(duì)樣本的主坐標(biāo)分析表明了鹽脅迫是影響根系微生物群落的主要因素,而對(duì)樣本的Hcluster分析則表明,基因型也是影響大豆根系微生物的因素之一。反映出根系微生物受環(huán)境與基因型影響的復(fù)雜性。

根系微生物對(duì)作物生長(zhǎng)、發(fā)育、抗病,抵御非生物脅迫等方面有著積極作用,根系微生物的改變對(duì)于作物的生長(zhǎng)發(fā)育有著很大影響[29-30]。本研究對(duì)鹽脅迫下大豆根系微生物物種分析發(fā)現(xiàn),NN根系微生物群落中假單胞菌屬的豐度占比明顯提高,所占比例高達(dá)25%。假單胞菌屬是一種根系促生菌,可通過(guò)分泌吲哚乙酸(IAA)類(lèi)似物促進(jìn)植物生長(zhǎng)與根部發(fā)育,同樣被視作一種可以緩解植物鹽脅迫的根系促生菌[31]。由日本學(xué)者分離的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT440能夠改善鹽脅迫下大豆與玉米的生長(zhǎng)情況[32]。此外,已有學(xué)者在大豆根系微生物中成功分離出4株假單胞菌屬菌株,4株菌株均表現(xiàn)出對(duì)高鹽極強(qiáng)的耐受性,且其中一株菌株改善了鹽堿土壤中大豆的生長(zhǎng)情況[33]。目前已有研究證明了假單胞菌屬是一種有大豆特異親和性的根系促生菌[34]。

通過(guò)對(duì)根系微生物的代謝分析進(jìn)行功能預(yù)測(cè)表明,鹽處理樣品中,NN大豆的根系微生物在生物降解及代謝,脂類(lèi)代謝以及氨基酸代謝方面豐度高于KF,說(shuō)明NN的根系微生物可能通過(guò)上述幾種代謝途徑參與調(diào)控大豆耐鹽。在色氨酸代謝方面,NN代謝豐度高于KF,而色氨酸是合成吲哚乙酸的前體物質(zhì),這與假單胞菌屬可以分泌生長(zhǎng)素類(lèi)似物的功能恰好吻合。近年來(lái)有相關(guān)報(bào)道表明,作物根系微生物產(chǎn)生的生長(zhǎng)素可以緩解鹽脅迫對(duì)作物生長(zhǎng)的影響,增強(qiáng)作物耐鹽性[35-36],這可能是NN相對(duì)于KF有著更強(qiáng)耐鹽性的原因[37]。基于本文研究結(jié)果,推測(cè)在鹽脅迫條件下,耐鹽大豆會(huì)招募耐鹽根系促生微生物如假單胞菌屬等定殖根部,利用其分泌的生長(zhǎng)素類(lèi)似物增強(qiáng)自身對(duì)鹽脅迫的耐受性,本文主要研究鹽敏感大豆與耐鹽大豆在鹽脅迫條件下根系微生物的變化以及功能預(yù)測(cè),而假單胞菌是否在大豆耐鹽脅迫中起到重要作用有待于進(jìn)一步研究。因此,后續(xù)將對(duì)根系微生物中假單胞菌屬進(jìn)行分離與功能驗(yàn)證,并對(duì)大豆根系生長(zhǎng)素含量變化等方面進(jìn)行深入研究。

綜上所述,鹽脅迫與基因型是影響大豆根系微生物群落的重要因素。相較于鹽敏感大豆科豐1,鹽脅迫下耐鹽大豆南農(nóng)1183-2中假單胞菌屬豐度明顯上升。該菌作為一種有高鹽耐受性,且有大豆特異親和性的根系際促生菌,或可成為改善大豆耐鹽性的可利用資源。