王曉東 汪愷 陳峻 徐驍

3D 生物打印技術(shù)作為組織工程領(lǐng)域最先進的技術(shù)之一，可用于制造生物替代物來替換或修復(fù)受損的組織和器官，現(xiàn)已在皮膚科、骨科、口腔科等學(xué)科中得到了應(yīng)用[1]。肝臟作為人體最大的腺器官，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，功能多樣，且相關(guān)疾病高發(fā)，在3D 生物打印技術(shù)研究中同樣受到廣泛關(guān)注。目前3D 生物打印技術(shù)已可以用于制造具有生物活性與部分功能的肝組織模型，在肝臟組織修復(fù)與再生研究中取得一定進展。這一技術(shù)的進步與肝臟相關(guān)疾病的治療密切相關(guān)，有進一步實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的潛力。本文就該技術(shù)用于肝組織模型構(gòu)建的相關(guān)研究進展作一綜述。

1 3D 生物打印技術(shù)

3D 生物打印技術(shù)是在計算機輔助下，利用3D 打印機將細胞和由各類生物材料組成的“生物墨水”按特定空間排列組合，構(gòu)建與目標組織或器官生物結(jié)構(gòu)相似替代物的一種增材制造技術(shù)。該技術(shù)使得細胞與生物材料在空間內(nèi)實現(xiàn)精確分布，再現(xiàn)目標組織或器官中復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)與微環(huán)境，實現(xiàn)對目標組織或器官的高度復(fù)制[1-2]。因此3D 生物打印技術(shù)在組織與器官構(gòu)建中具有很大應(yīng)用潛力，是最有希望實現(xiàn)在體外制造人體器官的技術(shù)之一。根據(jù)構(gòu)建功能性組織結(jié)構(gòu)的不同工作原理，有著多種生物打印技術(shù)，如擠壓式生物打?。╡xtrusion bioprinting，EB）、光固化生物打?。╯tereolithography bioprinting，SLB）、噴墨生物打?。╥nkjet bioprinting，IJB）、激光輔助生物打?。╨aser-assisted bioprinting，LAB）等[3]。這些生物打印技術(shù)工藝各有優(yōu)劣，可以單獨或組合使用，以實現(xiàn)所需結(jié)構(gòu)的制造。

2 生物墨水

負載細胞的生物墨水是3D 生物打印的基本原料，用于模仿組織中的細胞外基質(zhì)，其能在打印過程中保護細胞，并在打印后為模型提供促進細胞生長和組織再生的支架[4]。為構(gòu)建功能性組織模型，生物墨水應(yīng)具有與目標組織細胞外基質(zhì)相似的生化和生物特性，以維持細胞的正常生長和增殖[5]。此外，其還須具備可打印性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物相容性等特性，以滿足生物打印需要。在模型構(gòu)建中，研究者們還會根據(jù)需要在墨水中添加額外的生物活性成分，例如肝細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，以促進打印模型中的細胞增殖黏附、血管生成，進一步改善模型性能[6-7]。

天然高分子聚合物是肝組織模型打印中常見的生物墨水組分，其通常具有良好的生物相容性和降解性，能夠滿足3D 生物打印的要求[8]。目前常用的天然聚合物有膠原蛋白、明膠、海藻酸鹽、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸等。除天然聚合物外，人造合成聚合物也是常用的打印原料，其具有較好的機械性能，能承受打印過程中和體內(nèi)植入時的內(nèi)外張力。常用的合成聚合物有聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯和聚己內(nèi)酯等[9]。為實現(xiàn)對肝臟細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)與成分更為精確的復(fù)制，越來越多的學(xué)者選擇使用脫細胞基質(zhì)（decellularized extracellular matrix，dECM）生物墨水來打印肝組織模型[10-11]。dECM 是通過去除組織中細胞成分制成的天然支架，具有其他材料難以模擬的原組織中細胞外基質(zhì)的固有成分和獨特結(jié)構(gòu)，能通過再現(xiàn)組織特異性微環(huán)境來維持細胞活力和功能，促進組織生長發(fā)育，在生物打印應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢[12]。

生物墨水在肝組織模型構(gòu)建中起著重要作用，目前對于生物墨水的研究已取得許多進展，包括開發(fā)出了各類含天然或合成組分的墨水，以及性能更為優(yōu)越的dECM 墨水。但由于肝臟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，傳統(tǒng)生物墨水在可打印性和生物相容性等方面仍存在不足。為構(gòu)建具有高保真度的肝組織模型，未來有必要進一步開發(fā)高黏度、高生物相容性的多組分生物墨水。在改善生物墨水生化特性方面，對于生物墨水添加劑的研究也需要進一步加強。這需要研究者不斷完善生物墨水的設(shè)計與材料選擇，加強與其他學(xué)科的交流合作。

3 3D 生物打印肝組織模型的構(gòu)建與應(yīng)用

由于3D 生物打印技術(shù)具有快速精確制造出高保真度組織模型的能力，利用該技術(shù)打印的肝組織模型較傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)模型具有更好的細胞存活與功能維持[13]，這為肝臟組織工程的發(fā)展帶來了新希望。因此，3D 生物打印技術(shù)被越來越多地用于再生醫(yī)學(xué)研究，以期制造出能夠長期保持活力與功能的肝組織模型[14]，用于治療各種因素導(dǎo)致的肝臟損傷。

3.1 肝組織模型的細胞來源 肝臟主要由肝實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞組成。肝實質(zhì)細胞主要是肝細胞、膽管細胞，承擔(dān)肝臟的主要功能，而非實質(zhì)細胞則包括Kupffer 細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和肝星狀細胞等，起連接和支持肝實質(zhì)細胞的作用。肝組織模型的成功構(gòu)建首先需要解決細胞來源的問題。

原代肝細胞是直接從肝臟中分離出來的肝細胞，具有較高體外代謝活性，是生物打印肝組織模型最理想的細胞來源之一[15-16]。然而原代肝細胞數(shù)量有限，難以分離且增殖能力差、體外功能退化快，對于其獲取與培養(yǎng)仍存在困難[17]。此外一些肝癌來源的細胞系，如HUH7、HepG2 和HepaRG 等[18-20]，可以發(fā)揮白蛋白分泌、尿素合成等多種肝細胞功能，被作為一種替代選擇而廣泛用于肝組織模型的構(gòu)建。在其他研究中，一些誘導(dǎo)的肝細胞樣細胞（hepatocyte-like cells，HLCs）也被用于3D 生物打印，如從人脂肪干細胞分化的HLCs[21]，從人誘導(dǎo)多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）、胚胎干細胞衍生的肝細胞等[22]，這類細胞可以從人自體取材，具有開發(fā)個體化模型的優(yōu)勢，但需要關(guān)注細胞的轉(zhuǎn)錄特性和生物活性方面的差異。不同于肝細胞的來源多樣，膽管細胞與各類非實質(zhì)細胞多直接與肝細胞進行共打印來構(gòu)建肝組織模型。此外，在一些研究中，也有學(xué)者使用其他細胞來替代肝非實質(zhì)細胞，例如人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）可以替代肝竇內(nèi)皮細胞，用于肝組織模型中血管的構(gòu)建[23-24]。另一方面，隨著干細胞培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化技術(shù)的進步，越來越多的研究開始選擇利用干細胞分化來獲得各類肝非實質(zhì)細胞[25]。

3.2 肝內(nèi)脈管結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

3.2.1 肝內(nèi)血管 血管構(gòu)建對于肝內(nèi)微環(huán)境的建立、肝功能的維持以及移植物體內(nèi)的長期生存至關(guān)重要。為構(gòu)建血管化打印模型，研究人員已提出多種方法，包括將生長因子摻入打印結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)血管生成，在結(jié)構(gòu)中植入內(nèi)皮細胞以刺激血管生成，或使用各種微加工技術(shù)在模型中構(gòu)建多尺度微流體通道來制造血管等[26-27]。

在肝內(nèi)血管構(gòu)建中，Kang 等[28]通過EB 技術(shù)將含肝細胞、內(nèi)皮細胞的生物墨水與犧牲材料海藻酸鹽進行共打印，構(gòu)建以海藻酸鹽為犧牲骨架的模型，再通過調(diào)節(jié)溫度除去海藻酸鹽，形成由內(nèi)皮細胞覆蓋的管腔，用以代表肝內(nèi)血管，實現(xiàn)模型中血管系統(tǒng)的構(gòu)建。Liu 等[23]則使用甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）和纖維蛋白混合物制成載細胞墨水，用于封裝HUVECs、間充質(zhì)干細胞和HepG2 細胞來構(gòu)建肝組織模型，實驗中HUVECs、間充質(zhì)干細胞能在打印模型中形成良好的3D 毛細血管網(wǎng)絡(luò)。為實現(xiàn)進一步的血管仿真，Gao 等[29]使用含有血管組織細胞外基質(zhì)成分的生物墨水來負載HUVECs，結(jié)合同軸細胞打印技術(shù)成功構(gòu)建出體外血管模型，該模型具有選擇性通透、抗血小板黏附等多種血管生理功能與特點，在血管化肝組織模型的構(gòu)建中具有良好應(yīng)用前景。除人工構(gòu)建肝內(nèi)血管外，也有研究發(fā)現(xiàn)在一些打印模型中能自發(fā)形成功能性血管網(wǎng)絡(luò)[20]，證明3D 生物打印能模擬出促進血管生成的微環(huán)境。

3.2.2 肝內(nèi)膽管 肝組織模型中膽管的構(gòu)建是另一項重大挑戰(zhàn)，3D 生物打印技術(shù)同樣在模擬膽管結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中發(fā)揮作用，有學(xué)者使用立體光刻打印技術(shù)將大鼠膽管細胞封裝到3D 水凝膠結(jié)構(gòu)中，引導(dǎo)它們形成分支管狀網(wǎng)絡(luò)。實驗中，這些大鼠膽管細胞可以增殖、遷移并組成具有預(yù)定幾何結(jié)構(gòu)的膽道分支網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)對肝內(nèi)膽管的復(fù)制[30]。Lewis 等[31]則采用犧牲材料泊洛沙姆打印出具有特定幾何形狀的膽管樣結(jié)構(gòu)，然后將承載膽管細胞的水凝膠共打印到該結(jié)構(gòu)內(nèi)壁，再通過降溫將泊洛沙姆液化洗去，最終成功構(gòu)建出形狀可控的3D 肝內(nèi)膽管模型，為未來人體肝組織模型中膽管的打印提供基礎(chǔ)。

目前肝內(nèi)膽管的構(gòu)建已取得一定進展，但仍有許多問題需要解決，例如膽管打印細胞和生物材料的選擇以及打印后膽管活力與功能的維持等。此外，為在未來的移植過程中實現(xiàn)有效的供受體膽管吻合，還需進一步提高打印膽管的仿真度與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這需要研究人員不斷提升3D 生物打印的多組織構(gòu)建能力以及優(yōu)化改進各類生物墨水。

3.3 肝組織模型構(gòu)建 實現(xiàn)功能化模型構(gòu)建是生物3D 打印的重要目標。最初，研究者們進行了體外肝組織模型的打印與功能研究。Wu 等[19]使用海藻酸鹽、纖維素納米晶體和GelMA 配制生物墨水來封裝HepG2細胞和小鼠胚胎成纖維細胞，在實驗中運用EB 技術(shù)成功將其打印成一種模擬肝小葉結(jié)構(gòu)的蜂窩狀組織模型。這一模型實現(xiàn)了兩種細胞的共培養(yǎng)，增加了細胞間的相互作用，有利于細胞的生長與功能維持，在模型培養(yǎng)中觀察到了白蛋白產(chǎn)生增多，為功能性肝組織模型的生物打印提供了基礎(chǔ)。Cui 等[32]則以GelMA水凝膠為基質(zhì)，共打印肝細胞和成纖維細胞來構(gòu)建肝小葉狀微模塊，并通過非接觸微操作技術(shù)組裝微模塊來創(chuàng)建更大的小葉狀微組織，進一步改善組織的結(jié)構(gòu)完整性。實驗中該微組織能發(fā)揮白蛋白分泌和尿素合成等功能，且在培養(yǎng)1 周后仍能維持90%以上細胞活性，展現(xiàn)出3D 生物打印在功能性肝組織再造中的巨大應(yīng)用潛力。

此外，也有學(xué)者選擇使用干細胞來構(gòu)建肝組織模型[33]。Faulkner-Jones 等[22]利用閥門式生物打印技術(shù)打印出了含有hiPSCs 和人胚胎干細胞的生物組織。這些細胞在打印后可以分化成與肝細胞形態(tài)與功能類似的HLCs，且細胞活力和分化能力幾乎不受打印影響。這首次表明hiPSCs 具有生物打印的潛力，為未來生產(chǎn)復(fù)雜器官提供可能。為進一步提高打印模型存活率，Goulart 等[13]嘗試將hiPSCs 衍生的HLCs 與各類非實質(zhì)細胞先團聚成細胞球體，再運用EB 技術(shù)構(gòu)建出肝組織模型，實驗中該球體打印模型在培養(yǎng)18 d 后仍能保持80%細胞活性，而非球體打印模型此時僅能維持60%細胞活性，且肝組織代謝功能遠低于球體打印模型。Goulart[34]還進一步將hiPSCs 衍生的HLCs 與間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞等細胞結(jié)合，使用3D 生物打印技術(shù)成功制造出結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定的肝移植物。除肝細胞外，干細胞還能定向分化為各種其他肝內(nèi)細胞，包括肝竇內(nèi)皮細胞，肝星狀細胞和Kupffer 細胞等[25]，用于構(gòu)建更為仿生的肝組織模型。

綜上所述，在體外肝組織模型的構(gòu)建中，研究者們已嘗試使用各類細胞構(gòu)建出了多種打印模型。雖然相關(guān)模型與正常人體肝組織相比還有很大差距，但在體外實驗中皆被證實能維持一定時間的活力與功能，這為之后更為仿生的肝組織模型構(gòu)建與體內(nèi)移植提供了基礎(chǔ)。

3.4 基于3D 生物打印的肝損傷修復(fù) 為進一步研究生物打印肝組織模型能否在體內(nèi)發(fā)揮功能，起到肝損傷修復(fù)的作用，許多學(xué)者進行了相關(guān)的動物實驗。Kang 等[35]將生物打印肝組織模型植入藥物誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠網(wǎng)膜之中，發(fā)現(xiàn)植入小鼠體內(nèi)的模型較體外培養(yǎng)生長得更快，白蛋白的表達水平也更高。Yang 等[20]則根據(jù)特定的打印程序，使用HepaRG 細胞構(gòu)建3D 生物打印的肝類器官模型。這一模型在體外誘導(dǎo)肝向分化后被植入到肝衰竭小鼠體內(nèi)，在植入2 周后發(fā)現(xiàn)模型內(nèi)自發(fā)形成功能性血管。植入4 周后，小鼠體內(nèi)膽紅素及肝酶水平顯著降低并獲得了人類肝臟特有的藥物代謝功能，且該打印模型的植入顯著提高了肝衰竭小鼠的存活率。上述動物研究表明3D 生物打印肝組織應(yīng)用于移植以治療嚴重肝病的可能。

除各類肝病以外，在臨床中，創(chuàng)傷、手術(shù)切除等問題同樣能造成肝臟的嚴重損傷，且這些問題所導(dǎo)致的肝臟缺損在幾何形態(tài)上往往是隨機的，難以與預(yù)制的結(jié)構(gòu)模型匹配。在肝臟損傷嚴重的情況下，外部干預(yù)對促進肝臟再生至關(guān)重要。其中原位生物打印為損傷肝臟的再生修復(fù)提供了新途徑，其通過在缺陷處植入生物材料支架，提供人工微環(huán)境與結(jié)構(gòu)支持，來促進肝組織形成，避免了體外模型構(gòu)建的麻煩與不足[36]。Yang 等[37]通過磁控3D 生物打印技術(shù)在肝切大鼠模型中制備具有電活性與自愈性的生物水凝膠支架，實驗中可顯著促進肝組織再生，實現(xiàn)肝損傷修復(fù)與肝功能維持。

上述研究表明，基于3D 生物打印技術(shù)所構(gòu)建肝組織模型或生物支架能用于治療各類肝臟損傷。雖然相關(guān)研究目前尚處于起始階段，離最終的臨床應(yīng)用還有很長的路要走。但不可否認該技術(shù)在人體肝損傷修復(fù)中具有巨大應(yīng)用潛力，未來有望實現(xiàn)進一步的臨床轉(zhuǎn)化，為各類肝臟疾病的治療提供重要幫助。

4 局限與挑戰(zhàn)

3D 生物打印作為一項快速發(fā)展的前沿技術(shù)，在肝組織模型構(gòu)建中已取得了不少可喜的成果，但其同樣面臨諸多問題與挑戰(zhàn)。首先，在打印前的材料選擇方面，為實現(xiàn)模型的體內(nèi)移植，需要解決各類打印材料在受體內(nèi)的相容性、毒性、降解率以及宿主免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)等問題。其次，對于合適打印細胞的選擇同樣存在挑戰(zhàn)，各類細胞需要符合打印要求，且要有穩(wěn)定的細胞來源。

在肝組織模型構(gòu)建中，受限于當(dāng)前打印技術(shù)的精度與分辨率，人們?nèi)詿o法完全精確重建肝組織的微結(jié)構(gòu)，且血管、膽管等重要功能性結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及整合還存在不足，這必然會影響打印模型功能的發(fā)揮[33]。此外，目前打印模型的力學(xué)性能通常較差，缺乏足夠的機械強度及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，需要對模型性能進行改進。且目前構(gòu)建的肝組織模型與可供移植的肝臟相比尺寸偏小，未來需要進一步擴大模型尺寸。這有望通過模塊化組織工程來實現(xiàn)，即組裝成熟的3D 生物打印功能單元以構(gòu)建大尺寸的組織模型[38-39]。

在成功打印出模型后，細胞活性與功能的維持則是研究者們需要關(guān)注的重點，如果打印后細胞存活率很低，將無法實現(xiàn)目標組織的功能。而在目前的生物打印過程中，由于需要使用各種光、熱、氣體等刺激，不可避免地會對細胞的活性產(chǎn)生不確定的影響[40]。此外，打印肝組織模型時可能會用到各類干細胞，由它們所分化形成的肝細胞可能與正常肝細胞存在生物活性與功能方面的差異[41]。因此，研究者們還需要優(yōu)化改進各類生物打印工藝，并篩選合適打印細胞與生物墨水。

5 展望

目前，3D 生物打印技術(shù)仍處于發(fā)展的初級階段，所構(gòu)建的肝組織模型只進行了少量的動物體內(nèi)移植實驗，離完整人體肝臟再造與移植仍有很長距離。為提高打印模型的質(zhì)量，實現(xiàn)最終的臨床轉(zhuǎn)化，未來的研究需要集中于開發(fā)具有更好生物性能和打印保真度的生物材料，以及尋找能夠滿足打印需求的合適細胞。展望未來，隨著材料科學(xué)、生物工程和計算機科學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，以及新型生物墨水的開發(fā)和理想生物打印方法的使用，3D 生物打印技術(shù)有望用于構(gòu)建具有活力與功能的生物人工肝臟，在肝臟再生研究與肝臟疾病治療中發(fā)揮重要作用。