陳鐵鑫

［摘 要］聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是江蘇高考生物試題中的?？純?nèi)容，PCR技術(shù)的用途并不局限于最初、最基本的獲取目的基因。PCR技術(shù)的使用場(chǎng)景極其靈活，通過引物設(shè)計(jì)，可以達(dá)到融合基因、定點(diǎn)誘變等效果。文章對(duì)PCR技術(shù)中的引物設(shè)計(jì)思路進(jìn)行分類，介紹其衍生的各種應(yīng)用，為教師教學(xué)提供參考。

［關(guān)鍵詞］PCR；引物設(shè)計(jì)；高中生物學(xué)

［中圖分類號(hào)］??? G633.91??????? ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］??? A??????? ［文章編號(hào)］??? 1674-6058（2024）14-0084-04

核心素養(yǎng)是高考命題和各類考試命題的指導(dǎo)方向和原則。為加深學(xué)生對(duì)基因工程大概念的理解，提升學(xué)生的生物學(xué)科核心素養(yǎng)，《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版2020年修訂）》要求教師在基因工程的教學(xué)過程中開展“利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定，或運(yùn)用軟件進(jìn)行虛擬PCR實(shí)驗(yàn)”活動(dòng)［1］。引物直接決定PCR的特異性與成功與否。人教版高中生物學(xué)選擇性必修三中通過圖片簡單演示了PCR的基本過程，并未涉及引物設(shè)計(jì)，而近幾年各地的高考試題為了響應(yīng)新課標(biāo)要求，基于核酸檢測(cè)、DNA測(cè)序等真實(shí)情境，增加了許多與引物設(shè)計(jì)相關(guān)的技術(shù)困境內(nèi)容。為跨越教材與實(shí)際應(yīng)用的鴻溝，筆者對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景中的引物設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，以促進(jìn)學(xué)生對(duì)PCR的理解，為教師教學(xué)提供參考。

一、以基因定位為目的的反向引物設(shè)計(jì)

以真核生物為受體細(xì)胞時(shí)，目的基因一般需整合至受體細(xì)胞的染色體DNA中，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定存在與表達(dá)。在上述情境中，為進(jìn)行目的基因定位，需要在已知目的基因的附近逐步搜索并測(cè)序相鄰的DNA區(qū)域，這就需要用到反向PCR。

［例1］農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機(jī)插入到被侵染植物的DNA中。研究者將圖1中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法不正確的是（）。

圖 1

A.PCR擴(kuò)增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復(fù)制的原理

B.進(jìn)行PCR擴(kuò)增需要熱穩(wěn)定DNA聚合酶

C.利用圖中的引物②、③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列

D.通過與受體細(xì)胞的基因組序列比對(duì)，可確定T-DNA的插入位置

解析：對(duì)含目的基因的T-DNA中兩側(cè)未知序列通過同種限制酶或是同尾酶進(jìn)行酶切（目的基因中不能存在該酶的酶切位點(diǎn)），可取得相同的黏性末端。通過DNA連接酶令圖 1含T-DNA的片段自身環(huán)化［2］成圖2甲的環(huán)形DNA分子。

礙于DNA聚合酶的特性，子鏈總是從5＇端往3＇端延伸。若目的為擴(kuò)增T-DNA，應(yīng)選擇指向已知擴(kuò)增片段的內(nèi)側(cè)的引物②、③。選擇引物①、④，子鏈向外側(cè)未知序列進(jìn)行延伸。由于PCR體系中沒有DNA連接酶，因此子代DNA仍是線性（如圖2乙）。擴(kuò)增后，原本在兩側(cè)的未知序列被轉(zhuǎn)移到已知序列的內(nèi)部（如圖2丙）。隨后，我們可以對(duì)未知序列進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)受體細(xì)胞的基因組文庫，即可確定T-DNA插入的位置。

圖 2

參考答案：C

二、鑒定目的基因連接方式的反向引物設(shè)計(jì)

構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，若使用單酶切可能出現(xiàn)目的基因的反向連接。目的基因的篩選與檢測(cè)是基因工程的重要環(huán)節(jié)，可以通過設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，篩選目的基因與載體的正向連接產(chǎn)物。

［例2］為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖3所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置。

（1）PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是????????????? 。

（2）某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 。

解析：如圖 4所示，黑色區(qū)域?yàn)槟康幕颍覀冊(cè)谀康幕騼?nèi)、外各設(shè)計(jì)一引物，圖中為正向連接時(shí)各引物序列的位置。使用引物1、引物3可擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)片段，當(dāng)目的基因反向連接時(shí)，引物1與引物3方向相同，無法有效擴(kuò)增。同理，選擇引物2、引物4，也可以進(jìn)行上述驗(yàn)證。與預(yù)期相符的DNA長度就可以用于確認(rèn)目的基因的正向連接。

圖3為正向連接時(shí)的引物分布。引物丙、引物甲位于目的基因的上游和下游，無論連接方向是否正確，均可擴(kuò)增出片段且長度相同，無法作為排除的依據(jù)。

若使用引物丙、引物乙進(jìn)行PCR，考慮反向連接時(shí)，引物乙的方向與引物丙相同，無法擴(kuò)增片段，正向連接時(shí)引物丙、引物乙可以擴(kuò)增出350 bp長度的片段。

同理，若選擇引物甲、引物乙進(jìn)行PCR，反向連接時(shí)能擴(kuò)增出400 bp片段，正向連接時(shí)無擴(kuò)增產(chǎn)物，但空質(zhì)粒也會(huì)帶來相同的結(jié)果，無法確定實(shí)現(xiàn)了正向連接。

因此，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇引物乙、引物丙。學(xué)生擴(kuò)增出400 bp片段的原因是目的基因反向連接。

參考答案：（1）乙、丙 （2）目的基因反向連接

三、PCR體系中的引物序列改造

目的基因想要導(dǎo)入表達(dá)載體，兩側(cè)需要有合適的酶切位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室用到的限制酶價(jià)格高昂，種類有限，為了不被基因自身序列限制，就需要對(duì)引物序列進(jìn)行改造。引物設(shè)計(jì)的依據(jù)是目的基因的兩側(cè)序列，但這并不意味著引物需要與模板完全互補(bǔ)。我們既可以在5＇端進(jìn)行添加限制酶識(shí)別序列，也可以在中間進(jìn)行少量堿基的增刪或者替換。引物改造的部分序列不能和原對(duì)應(yīng)模板配對(duì)，但不影響引物和模板的整體配對(duì)，因此，其擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)位置就會(huì)引入識(shí)別序列，或是發(fā)生堿基對(duì)的增刪或者替換［3］。

（一）引入序列與連接DNA

引物與模板的結(jié)合并不需要完全一一對(duì)應(yīng)。引物的3＇端是DNA聚合酶添加游離脫氧核苷酸的位點(diǎn)，如果引入的核苷酸序列添加在3＇端，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性下降。因此，我們常常只在5＇端添加所需要的酶切位點(diǎn)。若在兩個(gè)DNA片段對(duì)應(yīng)引物的5＇端分別構(gòu)建相同或者互補(bǔ)序列，對(duì)獲得的新DNA進(jìn)行變性與雜交，還可以達(dá)到連接DNA的效果。

［例3］科研人員通過敲除里氏木霉基因組中去乙?；富颍℉DAC），探究組蛋白乙?；瘜?duì)纖維素酶基因表達(dá)的影響，其主要過程如圖5。請(qǐng)據(jù)圖回答：引物設(shè)計(jì)是PCR的關(guān)鍵，本研究中引物R1的5＇端添加與引物FG互補(bǔ)的序列，其目的是???????????????????? 。在PCR5中加入的引物是?????????????????????? 。

圖 5

解析：通過PCR1、PCR2，可獲得新霉素抗性基因GR與H1的構(gòu)造（如圖 6）。

圖 6

以GR 基因、H1為模板，F(xiàn)1和RG為引物進(jìn)行PCR4擴(kuò)增，在高溫作用下雙鏈會(huì)打開。由題可知，引物R1的5＇端添加了與引物FG互補(bǔ)的序列，因此其延伸產(chǎn)物H1基因的b鏈5＇端也存在引物FG的互補(bǔ)序列，b鏈與c鏈就能夠部分配對(duì)（如圖 7）。Taq? DNA聚合酶只能從5＇端向3＇端延伸，這兩條鏈的3＇端都缺乏模板，無法繼續(xù)延伸。

圖 7

a鏈的3＇端與R1序列互補(bǔ)，d鏈的3＇端與FG互補(bǔ)。由于R1與FG互補(bǔ)，因此a鏈的3＇端和d鏈的3＇端也是互補(bǔ)的（如圖 8）。

圖 8

在Taq? DNA聚合酶的作用下，可將重疊的兩條鏈補(bǔ)齊（如圖9）。

圖 9

兩個(gè)基因就這樣融合成功。隨后a鏈、d鏈分別結(jié)合引物RG、F1進(jìn)行PCR4，就得到了大量的H1-GR融合基因。這種借助引入序列連接DNA的方法我們稱為重疊延伸PCR。按照相同的邏輯，可以將基因H2和GR也進(jìn)行連接。

圖10

如圖10，通過類比，不難想到應(yīng)令c鏈和f鏈發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)、延伸。隨后c鏈、f鏈分別以R2、FG為對(duì)應(yīng)引物，進(jìn)行大量擴(kuò)增。為確保這兩條鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)，可在F2的5＇端通過引入序列，添加與RG互補(bǔ)的序列。

綜上，本研究中在引物R1的5＇端添加與引物FG互補(bǔ)的序列，其目的是便于PCR4時(shí)H1和GR基因的連接。在PCR5中加入的引物是R2和FG。

參考答案：便于H1和GR的拼接 R2和FG

（二）定點(diǎn)誘變

引物是PCR產(chǎn)物5＇端的一部分，引物長度一般為15～27 bp，因此最初建立的PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)只適用于DNA的末端突變。突變位點(diǎn)在基因中部時(shí)，我們就得設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，基因中部的兩個(gè)誘變引物分別與兩側(cè)常規(guī)引物將目的基因分段擴(kuò)增，再以上文中連接DNA的方式將兩段誘變DNA融合。

［例4］重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，獲得想要的目的基因。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因的特定位點(diǎn)引入特定突變，以實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)突變，原理如圖11。下列說法錯(cuò)誤的是（）。

圖11

A. 過程②需要含Mg2+的緩沖液、DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶等

B. 若引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次DNA分子的復(fù)制后，一共會(huì)產(chǎn)生3種DNA分子

C. 經(jīng)過過程④獲得的雜交DNA有2種，其中只有一種可以經(jīng)過過程⑤獲得目的基因

D. 過程⑤使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，需要引物

解析：過程④獲得的雜交DNA具有游離的3＇端，也具有模板，可以直接使用耐高溫的DNA聚合酶延伸，不需要引物。其連接機(jī)制與例3相同。

參考答案：D

四、特異性擴(kuò)增的嵌套引物設(shè)計(jì)

引物的長度一般在20個(gè)堿基左右，因此從概率上講，待擴(kuò)增片段上出現(xiàn)與引物配對(duì)序列的概率是[1420]，約萬億分之一，因此一段長度為20 bp的序列在人類基因組約31.6億堿基對(duì)的排列組合中理論上重復(fù)的概率很低。但堿基對(duì)的排列順序并不是完全隨機(jī)的，引物與模板鏈的結(jié)合也并不需要完全互補(bǔ)，因此總有非特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)。巢式PCR為了解決上述困境，對(duì)PCR體系中的引物數(shù)量進(jìn)行了設(shè)計(jì)。

［例5］普通PCR在擴(kuò)增DNA的過程中存在一定概率的堿基錯(cuò)誤配對(duì)，得到部分的錯(cuò)誤產(chǎn)物。巢式PCR是一種在普通PCR基礎(chǔ)上改良的新型PCR技術(shù)，擴(kuò)增的精確性比普通PCR更高。巢式PCR對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)需要用到兩對(duì)不同的引物，首先使用第一對(duì)引物（外引物）對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行第一次擴(kuò)增得到中間產(chǎn)物，然后使用第二對(duì)引物（內(nèi)引物）對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物，過程如圖12所示。請(qǐng)回答相關(guān)問題：

圖12

巢式PCR通常在第一支試管中進(jìn)行第一次擴(kuò)增，然后把得到的中間產(chǎn)物分離出來轉(zhuǎn)移到另外一支試管中進(jìn)行第二次擴(kuò)增反應(yīng)，兩次擴(kuò)增不在同一支試管中擴(kuò)增的原因是??? ???????????????????????????????????????。

解析：針對(duì)已知的目的基因兩側(cè)部分序列，設(shè)計(jì)外引物1、4，內(nèi)引物2、3。

圖13

如圖13，首先通過外引物1、4擴(kuò)增序列，此時(shí)依然存在這樣的可能性：引物與其他未知片段結(jié)合。經(jīng)過第一次擴(kuò)增后，提取反應(yīng)產(chǎn)物作為下一輪模板，使用內(nèi)引物2、3進(jìn)行第二次擴(kuò)增。若第一次擴(kuò)增出非特異性條帶，第二次擴(kuò)增因缺乏模板無法正常進(jìn)行。第二次擴(kuò)增的成功也是對(duì)第一次擴(kuò)增反應(yīng)正常進(jìn)行的鑒定。因此，若兩次擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，精確性就無法得到驗(yàn)證。

參考答案：防止內(nèi)引物直接參與第一次擴(kuò)增，無法實(shí)現(xiàn)巢式PCR高精確性擴(kuò)增

五、利用濃度不對(duì)稱的引物制備DNA單鏈

基因組DNA分析經(jīng)常用到southern印跡，依賴單鏈DNA探針與固定的DNA雜交。為了制備擴(kuò)增特異長度的單鏈DNA，我們采用不同濃度的引物。高濃度引物的量是低濃度引物的50～100倍。在一個(gè)PCR體系中，低濃度引物被快速消耗完后，高濃度引物主導(dǎo)之后的PCR進(jìn)程，從而產(chǎn)生大量單鏈DNA。

［例6］DNA分子雜交時(shí)，常需要大量的單鏈DNA探針。不對(duì)稱PCR是一種常見的單鏈DNA探針制備方法，其原理是反應(yīng)體系中加入一對(duì)數(shù)量不相等的引物。在PCR反應(yīng)的早期10～15個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，當(dāng)后期數(shù)量較少的限制性引物耗盡后，數(shù)量較多的非限制性引物將引導(dǎo)合成大量目標(biāo)DNA單鏈。

圖14

若圖14中A鏈為所需的DNA分子探針，則非限制性引物應(yīng)選用引物???????????????? 。

解析：若選擇引物Ⅱ、Ⅲ，限于子鏈延伸方向向外，擴(kuò)增的是無效片段。引物Ⅳ與B鏈互補(bǔ)，A鏈與B鏈互補(bǔ)，故引物Ⅳ是合成大量A鏈所必不可少的一部分。為合成大量A鏈，就需要大量引物Ⅳ作為非限制性引物。通過最初10～15個(gè)循環(huán)，獲得大量模板B鏈?。后15次循環(huán)只以大量B鏈為模板產(chǎn)生大量A鏈作探針。單鏈的分子量較小，通過電泳可以將這些單鏈DNA探針分離出來。

參考答案：Ⅳ

六、檢測(cè)特定基因的存在或缺失的多重PCR

一個(gè)抗原可能具備多個(gè)抗原決定簇，對(duì)應(yīng)多個(gè)基因位點(diǎn)。有時(shí)需要檢測(cè)一份樣本中是否含有多種病原體，或者對(duì)具有多個(gè)位點(diǎn)的病毒進(jìn)行探究，如SARS-CoV-2的檢測(cè)診斷至少需要兩個(gè)基因靶標(biāo)［4］。這種情況下，為節(jié)約人力物力，并且高效快速檢測(cè)，可以在同一反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上的引物。這種方式稱為多重PCR，其優(yōu)點(diǎn)是可以通過一次PCR同時(shí)對(duì)多個(gè)目的序列進(jìn)行擴(kuò)增，還可以檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。

［例7］人類γ基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)γ基因表達(dá)的抑制，可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。F1～F7，R均為引物。相關(guān)信息如圖15所示。

圖15

含F(xiàn)1～F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光，而含F(xiàn)5～F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列，據(jù)此結(jié)果可推測(cè)，BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于???????????? 。

解析：熒光蛋白終止子在DNA左側(cè)，為使熒光蛋白基因表達(dá)，應(yīng)將調(diào)控序列及啟動(dòng)子反向連接在熒光蛋白基因與啟動(dòng)子P之間。參考圖16。

圖16

若擴(kuò)增產(chǎn)物含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)與BCL11A蛋白的結(jié)合將抑制熒光蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使得受體細(xì)胞不能發(fā)出熒光。使用F5、R擴(kuò)增的片段仍有熒光，因此無結(jié)合位點(diǎn)。使用F4、R擴(kuò)增的片段熒光消失，因此結(jié)合位點(diǎn)在F4～F5對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段。

參考答案：F4～F5對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段

［?? 參?? 考?? 文?? 獻(xiàn)?? ］

［1］? 中華人民共和國教育部.普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)：2017年版2020年修訂［M］.北京：人民教育出版社，2020.

［2］? 屈伸，劉志國.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［3］? 任桂杰，王志玉.PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變與隨機(jī)突變的應(yīng)用［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005（9）：865-867.

［4］? 李慶超，房學(xué)迅，徐小潔.多重PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的研究進(jìn)展［J］.軍事醫(yī)學(xué)，2022（10）：798-801.

（責(zé)任編輯 羅 艷）