糧食中玉米赤霉烯酮含量測(cè)定的前處理方法優(yōu)化

摘要：優(yōu)化GB 5009.209—2016高效液相色譜法前處理過(guò)程，建立新的糧食中玉米赤霉烯酮含量的高效液相色譜測(cè)定方法。樣品經(jīng)乙腈-水（V乙腈：V水=4∶1）調(diào)速振蕩器提取，免疫親和柱富集凈化，甲醇洗脫后，直接用水稀釋定量至2.00 mL，采用 C18反相色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5.0 μm），在10～500 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率為94.3%～106.3%，精密度為0.8%～6.1%，連續(xù)4天的基質(zhì)加標(biāo)回收率為96.7%～104.8%，日間精密度為0.8%～4.3%，高效液相色譜可以很好地對(duì)糧食中玉米赤霉烯酮進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量分析。經(jīng)驗(yàn)證該方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。與國(guó)標(biāo)相比，尤其是本方法通過(guò)去除氮吹、省去流動(dòng)相復(fù)溶步驟可實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、批量檢測(cè)，提高了工作效率。

關(guān)鍵詞：糧食；玉米赤霉烯酮；高效液相色譜；免疫親和柱；前處理

中圖分類號(hào)：TS212.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240224

Optimization of pre-treatment method for determining the content of zearalenone in food

Tang Linghui， Yang Zhengfei

（ Yongzhou Food Quality and Safety Supervision， Inspection and Testing Center， Yongzhou， Hunan 425000 ）

Abstract： Optimization of the pretreatment process of high-performance liquid chromatography in GB 5009.209—2016， and the establishment of a new high-performance liquid chromatography method for the determination of Zearalenone in grain. The samples were extracted by（Vacetonitrile：Vwater=4∶1 ）speed-regulating oscillator， enriched and purified by an immunoaffinity column， and eluted with methanol. The eluate was then diluted and quantified to 2.00 mL with water directly， analyzed using a C18 reversed-phase chromatographic column （150 mm×4.6 mm， 5.0μm）. The linear relationship was good within the mass concentration range of 10-500 ng/mL， with a correlation coefficient （R2） of 0.999. The detection limit （LOD） was 3.8 μg/kg， and the quantitative limit （LOQ） was 12.8 μg/kg， the recoveries were 94.3%～106.3%， the precision was 0.8%～6.1% ， the recoveries were 96.7%～104.8%， the daytime precision was 0.8%～4.3%. The high-performance liquid chromatography can be used for rapid and accurate quantitative analysis of Zearalenone in grains. Compared with the national standard method， there was no significant difference. Especially， the method can realize rapid， simple， and batch detection by removing nitrogen blowing and removing the steps of mobile phase re-dissolving， thus improving the working efficiency.

Key words： grains； zearalenone； high-performance liquid chromatography； immunoaffinity； pretreatments

玉米赤霉烯酮主要由鐮刀菌屬株產(chǎn)生，其成分為粉紅鐮刀菌、禾谷鐮刀菌等產(chǎn)生的2，4-二羥基苯甲酸內(nèi)酯類化合物[1]。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麥類、高粱等農(nóng)作物，具有很強(qiáng)的雌性激素作用，可引起嚴(yán)重的生殖道癥及不孕癥，還具有免疫毒性和遺傳毒性，有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，是倉(cāng)儲(chǔ)糧食中常見(jiàn)的一種真菌毒素污染物[2-3]。

目前，測(cè)定糧食中玉米赤霉烯酮含量的主要方法為液相色譜法、高效液相色譜液質(zhì)聯(lián)用法等[4-9]。本研究結(jié)合自身多年從事真菌毒素的檢測(cè)與研究，提出對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.209-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》[10]中第一法液相色譜法的前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)的建議，通過(guò)增加對(duì)試樣采樣量和制備的要求、降低料液比和提取液乙腈濃度、采用調(diào)速振蕩浸提設(shè)備、去除氮吹、省去流動(dòng)相復(fù)溶等方面進(jìn)行優(yōu)化，探索出一條既與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，又能快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、操作安全、可實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；HY-4A型調(diào)速振蕩器：常州澳華儀器有限公司；玉米赤霉烯酮免疫親和柱：（柱容量為2 000 ng），北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；甲醇中玉米赤霉烯酮溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：20.52±0.25 μg/mL，國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院；玉米粉中玉米赤霉烯酮分析質(zhì)控樣品：92±19 μg/kg，北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；乙腈（色譜純）：德國(guó)默克公司。

1.2 試樣制備

采樣量需大于1 kg，玉米、小麥等谷物及其制品直接粉碎，過(guò)篩，并過(guò)2 mm實(shí)驗(yàn)篩，混合均勻，放置備用。

1.3 優(yōu)化的試樣提取

稱取20±0.01g試樣置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL提取液（V乙腈：V水=4∶1）混勻，調(diào)速振蕩器（200～300 r/min）劇烈振蕩20 min，靜止后，過(guò)濾并收集濾液。

采用移液管準(zhǔn)確移取10.0 mL濾液置于100 mL錐形瓶中，加入40.0 mL去離子水稀釋，再用微纖維濾紙過(guò)濾并收集濾液，作為免疫親和柱凈化上樣液備用。

1.4 優(yōu)化的親和柱凈化

取出免疫親和柱，放置室溫平衡后，免疫親和柱上端與一次性注射器（25 mL）固定，下端去掉塞子后，待保護(hù)液流盡前，準(zhǔn)確移取25.0 mL上樣液，保持重力作用自然流下；待液體排干后，用10 mL去離子水洗滌2次；用洗耳球排盡免疫親和柱內(nèi)液體，準(zhǔn)確移取1.00 mL甲醇（色譜純）洗脫玉米赤霉烯酮，并用去離子水稀釋定量至2.00 mL，混勻后用0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，置于樣品瓶待測(cè)。

1.5 優(yōu)化的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取質(zhì)量濃度為20.52±0.25 μg/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入甲醇—水溶液（V甲醇∶V水= 2∶1）稀釋，將其依次配制成質(zhì)量濃度為10、20、30、60、100、200、500 ng/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 色譜條件

色譜柱分析柱：C18 柱，5.0 μm，150 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈= 23∶4∶23）；進(jìn)樣量：100 μL；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

與GB 5009.209-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定》檢測(cè)方法相比，本方法增加了對(duì)試樣采樣量和制備的要求，需大于1kg，且全粉碎后使其至少通過(guò)粒徑小于2 mm孔徑實(shí)驗(yàn)篩。因?yàn)橥ㄟ^(guò)多年的糧油檢測(cè)工作證實(shí)，真菌毒素準(zhǔn)確分析中的決定性因素、最大的誤差來(lái)源是樣品的扦樣與制備，這也與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告一致[11]。其次，本方法檢測(cè)樣品由40 g降低為20 g，且提取液中乙腈體積分?jǐn)?shù)由90%優(yōu)化為80%，降低了料液比和提取液乙腈濃度，不僅可以增加提取效果，而且可以減小較大比例的乙腈對(duì)親和柱上抗體的破壞。再者，將浸提設(shè)備均質(zhì)器更換為調(diào)速振蕩器，調(diào)速振蕩器價(jià)格便宜且便于操作，延長(zhǎng)提取時(shí)間至20 min，保證玉米赤霉烯酮的充分提取。最后，在國(guó)標(biāo)中采用流動(dòng)相水—甲醇—乙腈溶液（V水∶V甲醇∶V乙腈=23∶4∶23）稀釋配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，并且為了使前處理后的樣品溶劑濃度與標(biāo)準(zhǔn)工作液保持一致，洗脫下的樣液經(jīng)55℃以下氮吹，再用流動(dòng)相復(fù)溶，而本優(yōu)化的方法是采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）稀釋配制玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，在加入甲醇洗脫后，采用水直接稀釋定量至2.00 mL，去除氮吹步驟，既減小了損失的可能性，又節(jié)省了時(shí)間，提高了工作效率。其2種方式下稀釋配制的各濃度梯度保留時(shí)間和峰面積見(jiàn)下表1，并以60 ng/mL質(zhì)量濃度2種方式下的色譜圖為例，見(jiàn)圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇—水溶液（V甲醇∶V水=2∶1）直接定容，其色譜峰面積稍大，從而檢測(cè)靈敏性更高?？梢?jiàn)，去除氮吹、省去流動(dòng)相復(fù)溶步驟完全滿足對(duì)糧食中玉米赤霉烯酮含量的測(cè)定。

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

采用確定的液相色譜條件，對(duì)配制所得的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（10～500 ng/mL）依次進(jìn)行分析。在10～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，其線性方程為If = 0.018 4×c+0.005 5，相關(guān)系數(shù)R2為0.999。通過(guò)液相色譜軟件計(jì)算，以基線噪聲3倍峰面積確定方法的檢出限，以基線噪聲10倍峰面積確定方法的定量限，得玉米赤霉烯酮的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.8 μg/kg、12.8 μg/kg，本方法檢出限和定量限均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，能完全滿足糧食中玉米赤霉烯酮的測(cè)定需求。

2.3 方法的回收率與精密度

選取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米樣品稱取20.00g，分別添加玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液致使試樣含有20、60、180 μg/kg（添加量當(dāng)量）等3個(gè)濃度水平，混勻，放置60 min以上，使其達(dá)到平衡，再采用本文中優(yōu)化的前處理方法進(jìn)行回收率與精密度測(cè)定，每個(gè)添加水平作3次平行，其結(jié)果見(jiàn)表2。從回收率與精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法測(cè)定玉米赤霉烯酮的回收率全部在94.3%～106.3%，3個(gè)濃度水平分別添加3次重復(fù)測(cè)定的精密度為0.8%～6.1%，基本滿足糧食中玉米赤霉烯酮定量檢測(cè)對(duì)回收率與精密度的要求。

2.4 日間精密度

選取不含玉米赤霉烯酮的空白玉米樣品稱取20.00g，添加玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液致使試樣含60 μg/kg（添加量當(dāng)量），作3平行，再采用本文中優(yōu)化的前處理方法進(jìn)行連續(xù)4天日間精密度測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示連續(xù)4天的加標(biāo)回收率范圍為96.7%～104.8%，其日間精密度為0.8%～4.3%。可見(jiàn)，本方法對(duì)糧食中玉米赤霉烯酮的測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)試及方法比對(duì)

分別對(duì)6份玉米樣（樣品編號(hào)為：1～6號(hào)）、3份小麥樣（樣品編號(hào)為：7～9號(hào)）、3份玉米粉樣（樣品編號(hào)為：10～12號(hào)），其中第12號(hào)為玉米粉中玉米赤霉烯酮分析質(zhì)控樣：（92±19） μg/kg和1份面條樣（樣品編號(hào)為：13號(hào)）應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的前處理方法和國(guó)標(biāo)法進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，計(jì)算2種前處理方法測(cè)定結(jié)果的精密度，并采用t檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)其測(cè)定結(jié)果是否一致，結(jié)果見(jiàn)表4。2種前處理方法測(cè)定結(jié)果的精密度均滿足國(guó)標(biāo)要求（精密度<15%）；經(jīng)t檢驗(yàn)分析，2種前處理方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異（P>0.05），因此，本方法可用于大批量糧食中玉米赤霉烯酮含量的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)增加試樣采樣量和制備的要求、降低料液比和提取液乙腈濃度、采用調(diào)速振蕩器浸提設(shè)備、去除氮吹、省去流動(dòng)相復(fù)溶等玉米赤霉烯酮測(cè)定前處理方法的優(yōu)化，測(cè)得的玉米赤霉烯酮含量與國(guó)標(biāo)方法無(wú)顯著性差異；采用本方法測(cè)定玉米赤霉烯酮含量，其保留時(shí)間穩(wěn)定且峰形良好，可以很好地對(duì)糧食中玉米赤霉烯酮進(jìn)行快速定量分析，在10～500 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)為0.999，檢出限和定量限分別為3.8 μg/kg、 12.8 μg/kg，3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率為94.3%～106.3%，精密度為0.8%～6.1%，連續(xù)4天的基質(zhì)加標(biāo)回收率為96.7%～104.8%，日間精密度為0.8%～4.3%。尤其是本方法通過(guò)去除氮吹、省去流動(dòng)相復(fù)溶步驟可實(shí)現(xiàn)快速簡(jiǎn)便檢測(cè)，提高了工作效率，降低實(shí)驗(yàn)人員與玉米赤霉烯酮、有機(jī)試劑等有害物質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間接觸的風(fēng)險(xiǎn)，并為基層實(shí)驗(yàn)室大批量快速準(zhǔn)確測(cè)定糧食中玉米赤霉烯酮提供了方法[12]。

參 考 文 獻(xiàn)

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