基于轉(zhuǎn)錄組分析枇杷響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制

摘要：為了探索枇杷對(duì)于干旱脅迫響應(yīng)和耐受性的分子機(jī)制，鑒定可用于培育抗旱枇杷新品種的關(guān)鍵基因，為枇杷抗旱機(jī)制提供理論依據(jù)，以白玉枇杷為試驗(yàn)材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）篩選響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)基因。以正常供水為對(duì)照，進(jìn)行短期干旱脅迫處理，RNA-Seq篩選差異表達(dá)基因（DEG），并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。結(jié)果表明，RNA-Seq共鑒定出3 270個(gè)DEG，其中上調(diào)1 810個(gè)，下調(diào)1 460個(gè)。GO富集分析表明，一些脅迫響應(yīng)基因在干旱處理后顯著上調(diào)。KEGG富集分析表明，植物MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、類(lèi)胡蘿卜素生物合成等相關(guān)DEG在響應(yīng)脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)DEG深入分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫后，抗氧化酶基因、脫落酸（ABA）生物合成基因NCED、ABA信號(hào)通路基因顯著上調(diào)。此外，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)枇杷主要通過(guò)調(diào)控bHLH、bZIP、AP2/ERF、GRAS、HD-Zip、MYB、MYB_related、NAC、WRKY這9個(gè)家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)響應(yīng)干旱。

關(guān)鍵詞：枇杷；干旱脅迫；轉(zhuǎn)錄組分析；差異基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.301  文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）17-0027-07

收稿日期：2023-09-26

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校基礎(chǔ)科學(xué)（自然科學(xué)）研究面上項(xiàng)目（編號(hào)：22KJD210003）；江蘇省珍稀樹(shù)種白沙枇杷種質(zhì)資源保護(hù)與培育長(zhǎng)期科研基地項(xiàng)目（編號(hào)：LYKJ［2020］28）；江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（特色果樹(shù)）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：JATS［2021］395）；蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士提升計(jì)劃科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：BS［2022］01）。

作者簡(jiǎn)介：趙 雙（1990—），女，山東聊城人，博士，講師，主要從事果樹(shù)生理生態(tài)和分子育種研究。E-mail：zhsh812972738@126.com。

通信作者：郄紅麗，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)槌＞G果樹(shù)種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)。E-mail：75864268@qq.com。

枇杷（Eriobotrya japonica）原產(chǎn)于我國(guó)，是典型的亞熱帶常綠果樹(shù)。枇杷果實(shí)于夏初成熟，味酸甜，皮薄多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛(ài)；白肉枇杷是枇杷中的極品，已被江蘇省列為重點(diǎn)發(fā)展的應(yīng)時(shí)鮮果之一［1-2］。枇杷根系分布淺，須根稀少，對(duì)水分要求較高；我國(guó)枇杷果園大多建在灌溉條件差的山坡上，特別容易受干旱脅迫影響［3-5］。季節(jié)性干旱嚴(yán)重影響枇杷樹(shù)體的生長(zhǎng)發(fā)育及其果實(shí)的產(chǎn)量與品質(zhì)［6-7］。江蘇省蘇州市是我國(guó)枇杷傳統(tǒng)種植四大產(chǎn)區(qū)之一。近年來(lái)高溫、干旱等極端天氣時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響蘇州市枇杷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前有關(guān)枇杷耐旱性的研究仍相對(duì)較少，亟待進(jìn)行探索枇杷對(duì)干旱脅迫響應(yīng)和耐受性的分子機(jī)制、鑒定可用于培育抗旱枇杷新品種關(guān)鍵基因等相關(guān)研究。

RNA-Seq技術(shù)是識(shí)別新轉(zhuǎn)錄本和分析基因表達(dá)譜的有力方法。近年來(lái)，研究人員利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)枇杷特定生物學(xué)性狀的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，并成功鑒定出大量候選基因或轉(zhuǎn)錄本［8-12］。本研究對(duì)白玉枇杷品種進(jìn)行干旱脅迫處理，利用 RNA-Seq 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析以探索枇杷響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，以期為探索參與枇杷抗旱響應(yīng)的基因表達(dá)模式和信號(hào)通路提供新思路，也為枇杷的抗旱基因工程育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

本研究于2023年3—6月在江蘇省常綠果樹(shù)工程研究中心進(jìn)行。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、健康且種植于營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量相同基質(zhì)的2年生白玉枇杷植株，在蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院東山校區(qū)（120°40′E，31°08′N(xiāo)）溫室中進(jìn)行干旱處理。將白玉枇杷植株澆透水后計(jì)為 0 d，并收集枇杷葉片樣品；而后停止供水，使其遭受干旱脅迫，并于干旱處理9 d時(shí)收集枇杷葉片樣品。干旱處理0 d設(shè)為對(duì)照組，干旱處理9 d設(shè)為處理組。所有樣品立即使用液氮速凍，在 -80 ℃ 超低溫冰箱中保存，以便用于后續(xù) RNA-Seq 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。

1.2 白玉枇杷葉片總 RNA 提取和cDNA合成

根據(jù)制造商的試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用植物 RNA 分離試劑盒提取白玉枇杷葉片的總RNA［Wolact，威邦生命科學(xué)（香港）有限公司］。根據(jù)制造商的試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa公司，日本）反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。

1.3 白玉枇杷葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

白玉枇杷葉片的RNA樣品質(zhì)檢、cDNA文庫(kù)構(gòu)建等RNA-Seq與分析工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)Zhou等的方法［13］進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果驗(yàn)證

隨機(jī)選取轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中給出的差異表達(dá)基因，使用在線(xiàn)軟件Primer3（https：//primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），以白玉枇杷干旱與對(duì)照處理的cDNA為模板，使用Bio-Rad CFX Opus 96（Bio-Rad）熒光定量PCR儀進(jìn)行表達(dá)分析，熒光定量PCR的程序按照熒光實(shí)時(shí)定量染料的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)定。選用枇杷EjActin為內(nèi)參基因［14］。通過(guò)2ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量［15］。使用熔解曲線(xiàn)確定擴(kuò)增片段的特異性。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用SPSS Statistics 17.0軟件中的單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行雙變量分析以測(cè)試2個(gè)因素之間的相互作用，不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用Office Excel作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白玉枇杷葉片響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

為探索干旱條件下枇杷品種響應(yīng)干旱的分子遺傳機(jī)制，對(duì)干旱脅迫9 d（處理組）和對(duì)照樣品進(jìn)行RNA-Seq分析。分析結(jié)果（表2）顯示，6個(gè)枇杷干旱與對(duì)照樣品共獲得了277.3 Mbp clean reads，經(jīng)過(guò)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，測(cè)序錯(cuò)誤率檢查和GC含量分布檢查后，每個(gè)樣品平均獲得46.2 Mbp clean reads，與枇杷基因組的匹配率約為91％。

基于基因的FPKM值（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads），通過(guò)皮爾森相關(guān)系數(shù)計(jì)算干旱處理組與對(duì)照組各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性。由圖1可知，對(duì)照組和干旱處理組的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性均高于0.9，重復(fù)性好，可用于進(jìn)一步分析。

由圖2可見(jiàn)，在干旱處理9 d后，共檢測(cè)到 3 270 個(gè)差異表達(dá)基因（差異表達(dá)倍數(shù)>2，P<0.05），其中上調(diào)基因?yàn)? 810個(gè)，下調(diào)基因?yàn)? 460個(gè)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準(zhǔn)確性，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取16個(gè)差異表達(dá)基因（表3）進(jìn)行 qRT-PCR 驗(yàn)證。由圖3可見(jiàn)， 16個(gè)基因的表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。且轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r2=0.976），表明轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果是可靠的。

2.3 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的GO富集分析

為了進(jìn)一步了解白玉枇杷對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的潛在機(jī)制，對(duì)干旱脅迫下白玉枇杷葉片的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析。GO分析結(jié)果表明，一些與脅迫途徑相關(guān)的基因在干旱處理后顯著上調(diào)，包括對(duì)缺水的響應(yīng)、氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)、對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)、對(duì)活性氧的響應(yīng)；另外，部分與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的基因在干旱處理后上調(diào)（圖 4-a）。而大量與生長(zhǎng)素激活信號(hào)通路、生長(zhǎng)素介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控、生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)纳锿废嚓P(guān)的基因在干旱條件下下調(diào)；此外，光合作用、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)水楊酸的反應(yīng)等生物途徑相關(guān)基因在干旱處理后下調(diào)（圖4-b）。

多種非生物脅迫能夠?qū)е禄钚匝跛降脑黾?，而活性氧累積可以引起氧化脅迫，進(jìn)而對(duì)植物細(xì)胞和細(xì)胞器造成損害。由表4轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可知，干旱條件下，2個(gè)過(guò)氧化物酶（POD）、1個(gè)抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）、2個(gè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）顯著上調(diào)，這些酶參與植物體內(nèi)活性氧的清除。

2.4 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

為了確定白玉枇杷干旱響應(yīng)的代謝途徑，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，并評(píng)估了20條富集最明顯的途徑。由圖5可見(jiàn)，富集程度最高的途徑包括植物MAPK信號(hào)通路、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用-天線(xiàn)蛋白、類(lèi)胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝。

2.5 干旱脅迫下枇杷葉片植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

通過(guò)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在響應(yīng)干旱脅迫中至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果（表5）顯示，干旱處理后，脫落酸（abscisic acid，ABA）信號(hào)通路中的多個(gè)ABRE結(jié)合因子（abscisic acid responsive elements-binding factor，ABF）、蔗糖非酵解型蛋白激酶2（SnRK2）、3個(gè)ABA生物合成基因 9-順式-環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）的表達(dá)水平顯著上調(diào)；生長(zhǎng)素信號(hào)通路中，多個(gè)生長(zhǎng)素/吲哚-3-乙酸（Aux/IAA）家族成員呈上調(diào)趨勢(shì)。

2.6 干旱下枇杷葉片中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控一系列下游目標(biāo)基因，在非生物脅迫響應(yīng)等多個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為挖掘枇杷葉片中響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，本研究篩選出轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有差異表達(dá)的所有轉(zhuǎn)錄因子。RNA-Seq結(jié)果共鑒定出255個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中bHLH、bZIP、AP2/ERF、GRAS、HD-Zip、MYB、MYB_related、NAC、WRKY這9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員在差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中數(shù)量較多（圖6）。差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中，大多數(shù)bHLH、GRAS家族成員在干旱處理后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，而差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中bZIP、AP2/ERF、NAC、HD-Zip家族的多數(shù)成員在干旱處理后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞中活性氧過(guò)量累積，過(guò)量的ROS會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞膜和其他重要的大分子，例如光合色素、蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)，進(jìn)而造成氧化損傷［16-18］。研究表明，干旱脅迫下，植物通過(guò)觸發(fā)酶抗氧化防御系統(tǒng)，清除活性氧，減輕急性細(xì)胞損傷，保持膜的完整性［19-20］。本研究表明，干旱處理后，與對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)、對(duì)活性氧的響應(yīng)途徑相關(guān)的基因顯著上調(diào)，且編碼抗氧化酶基因POD、APX、GPX顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，干旱脅迫下，枇杷通過(guò)調(diào)控抗氧化酶基因的表達(dá)，清除活性氧，降低氧化損傷，提高其耐旱性。

植物激素ABA是干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。干旱脅迫下，植物組織和葉片中的ABA含量增加，改變了許多離子通道的活性，觸發(fā)氣孔關(guān)閉［21-22］。研究表明，過(guò)表達(dá)AtNCED3提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的內(nèi)源ABA水平，過(guò)表達(dá)AtNCED3轉(zhuǎn)基因植株的葉片蒸騰速率低于野生型，其耐旱性增強(qiáng)［23］。本研究中，干旱脅迫后，與氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)途徑相關(guān)的基因顯著上調(diào)，且ABA生物合成關(guān)鍵的限速酶NCED顯著上調(diào)。ABA主要通過(guò)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)干旱脅迫響應(yīng)的生物學(xué)功能。研究表明，ABA信號(hào)途徑中SnRK2通過(guò)磷酸化激活下游轉(zhuǎn)錄因子ABF等，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，在植物逆境脅迫響應(yīng)中起著正調(diào)控作用［24-25］。本研究干旱處理后，3個(gè)ABF和SnRK2顯著上調(diào)。以上數(shù)據(jù)表明，干旱脅迫下，枇杷通過(guò)ABA合成基因的表達(dá)促進(jìn)氣孔關(guān)閉，減少水分散失，以及調(diào)控ABA信號(hào)通路基因的表達(dá)，響應(yīng)干旱脅迫。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與干旱應(yīng)答基因的啟動(dòng)子互作，來(lái)調(diào)控干旱應(yīng)答相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)干旱脅迫響應(yīng)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［8，26］。本研究從轉(zhuǎn)錄組中鑒定出255個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。干旱脅迫下，一系列正調(diào)控抗旱的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，包括HD-Zip家族的EVM0023669、EVM0026197。EVM0026197是蘋(píng)果中MdHB-7的同源基因，蘋(píng)果中MdHB-7通過(guò)促進(jìn)干旱引起的內(nèi)源性ABA積累，促進(jìn)氣孔關(guān)閉，清除活

性氧，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性［18］。EVM0023669是MdHB7-like的同源基因，在蘋(píng)果中過(guò)表達(dá)MdHB7-like可增強(qiáng)蘋(píng)果的耐旱性，而MdHB7-like的干擾植株則對(duì)干旱更敏感［27］。NAC家族中EVM0001934是擬南芥中NAC072/RD26的同源基因，在擬南芥中NAC072/RD26的過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫耐受性［28］，NAC072RD26基因的同源煙草基因NtabNAC087通過(guò)影響葉片的生理結(jié)構(gòu)，增加抗氧化物酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱脅迫的耐受性［20］。

綜上所述，RNA-Seq鑒定的差異表達(dá)基因在一定程度上解釋了枇杷響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制，期待可為今后枇杷干旱育種提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

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