威寧短柱油茶根圍叢枝菌根真菌多樣性調(diào)查

摘要：為了揭示高寒山區(qū)野生油茶（威寧短柱油茶）根圍土壤叢枝菌根真菌（AMF）的結(jié)構(gòu)與組成，解析土壤因子對AMF群落組成及其多樣性的影響，為高寒山區(qū)抗逆性AMF資源的發(fā)掘及物種多樣性研究提供理論依據(jù)，以貴州省高寒山區(qū)分布的威寧短柱油茶7個樣地根圍土壤為材料，采用高通量測序結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的方法，研究威寧短柱油茶AMF的侵染情況、群落結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、AMF種類，并進行土壤因子與AMF相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，威寧短柱油茶AMF侵染率在不同樣地中存在差異。7個樣地的AMF菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊浸染率、總侵染率、侵染強度的平均值分別為59.52%、13.49%、51.59%、65.87%、61.11%。通過高通量測序，7個樣地共鑒定到5屬46種AMF，其中球囊霉屬（Glomus）的相對豐度最高，為優(yōu)勢類群；VTX00223為優(yōu)勢虛擬種。7個樣地的AMF群落組成和相對豐度差異較大，但ɑ多樣性無顯著差異。RDA分析表明，全磷、速效鉀、堿解氮含量對無梗囊霉屬（Acaulospora）的基因豐度有正向影響，盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）的基因豐度與全磷含量相關(guān)，而全鉀含量影響球囊霉屬的基因豐度。此外，通過形態(tài)學(xué)，鑒定到4屬13種AMF；其中球囊霉屬6種，無梗囊霉屬5種，盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬各1種；G.sp1出現(xiàn)頻率最高，為7個樣地共有。貴州高寒山區(qū)野生油茶根圍土壤中的AMF資源豐富，土壤因子是影響AMF侵染的一個重要因素，AMF種類對土壤因子有一定選擇性。

關(guān)鍵詞：威寧短柱油茶；叢枝菌根真菌；高通量測序；土壤因子；多樣性；形態(tài)學(xué)鑒定

中圖分類號：S718.81；S794.4 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0268-09

收稿日期：2024-07-20

基金項目：貴州省林業(yè)科研項目（編號：黔林科合〔2022〕05號）；貴州科學(xué)院博士基金（編號：黔科院R字［2021］2號）；貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2022］重點 017 號）。

作者簡介：劉 燕（1981—），女，貴州貴陽人，博士，副研究員，主要從事植物種苗繁育及菌根真菌研究。E-mail：472395057@qq.com。

油茶（Camellia spp.）屬山茶科（Theaceae）山茶屬植物，廣泛分布于我國南方亞熱帶地區(qū)，少量分布于東南亞北部［1］。油茶是集食用、藥用、化工為一體的優(yōu)良樹種，油茶籽油的不飽和脂肪酸達90%以上，茶殼、茶枯可應(yīng)用于日用化工、肥料、生物制藥、生物農(nóng)藥等領(lǐng)域［2-3］。威寧短柱油茶（C. weiningensis Y.K.Li.sp.nov）是一種野生油茶種類，主要分布于貴州省威寧縣，是怒江紅山茶（C.saluenensis Stapf ex Bean）威寧種源的統(tǒng)稱［4-5］。它與普通油茶相比，垂直分布高（海拔1 800～2 700 m），成熟早，果皮、種殼薄，出油率高，油質(zhì)好，同時抗寒、抗旱、耐瘠薄土壤等抗逆性也較強［6-7］，是貴州省高寒山地經(jīng)濟林業(yè)發(fā)展的主推樹種［8］。目前，威寧短柱油茶在其資源調(diào)查與利用［6-8］、種子油脂含量及成分分析［9］、扦插繁育［4-5］、苗木質(zhì)量分級［10］等方面已逐步受到關(guān)注，但其與土壤微生物之間的相關(guān)研究還鮮見報道。近年來，國內(nèi)外學(xué)者證實菌根真菌是一種有益于植物生長和生存的土壤真菌，油茶的菌根真菌主要是叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）［11］。AMF定殖普通油茶根部后，對其生長、品質(zhì)改良、水肥吸收、耐逆性均有促進作用［12-14］?？梢?，AMF在油茶種植生產(chǎn)中有著巨大的應(yīng)用潛能。油茶根圍AMF多樣性調(diào)查和功能菌株的篩選是將AMF應(yīng)用到油茶栽培種植的前提。關(guān)于低海拔地區(qū)油茶種類（普通油茶）及其品種間AMF物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)已有相關(guān)報道［15-18］，但高寒山區(qū)野生油茶的AMF多樣性研究仍鮮見。大量研究表明，地理分布差異會導(dǎo)致AMF的多樣性和群落結(jié)構(gòu)不同［19-22］，不同的AMF群落結(jié)構(gòu)通常具有不同的功能特征［23-24］。因此，探明高寒山區(qū)野生油茶AMF的物種多樣性和群落組成，對高寒山區(qū)野生油茶優(yōu)良性狀的形成尤為重要。為了了解高寒山區(qū)野生油茶根圍土壤AMF的群落結(jié)構(gòu)和特征，本研究以威寧短柱油茶7個林地的根圍土壤為材料，通過 Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序，研究AMF物種多樣性及與土壤肥力因子的相關(guān)性。同時采用高通量和孢子形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，探究根圍土壤中的AMF種類，以期為后續(xù)高寒山區(qū)油茶功能性AMF的篩選及應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土樣

供試樣品采自威寧縣境內(nèi)威寧短柱油茶分布較廣的7個林地［25］，具體采集地點見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

試驗開展于2022年8月。每個采樣地選取長勢相似的野生油茶（樹齡約為30年）各5株，去掉枯枝落葉層后，分別在距離植株主干0～5 cm范圍內(nèi)，采集0～20 cm土層深度的根系和土壤［26］。根系洗凈泥土后用FAA固定液（70%乙醇）保存，用于觀測AMF侵染情況。土壤樣品用冰盒運回實驗室后，一部分放入無菌袋中，保存于 -80 ℃ 冰箱，用于AMF的DNA提取及高通量測序；一部分土樣在實驗室自然風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)和AMF孢子分離及密度測定。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 土壤理化性

土壤pH值及全磷（TP）、全鉀（TK）、全氮（TN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）、堿解氮（AN）、有機質(zhì)含量測定參照秦維等的方法［25］。

1.2.2.2 AMF侵染率及孢子數(shù)量

采用堿解離-臺盼藍染色法［27］處理根樣。各樣本隨機選取30個長1 cm的根樣，在顯微鏡下觀察AMF的侵染結(jié)構(gòu)，并測定侵染率、侵染強度［28］，重復(fù)3次。采用濕篩傾析-蔗糖離心法［29］分離土壤中的AMF孢子，每份土樣中取10 g風(fēng)干土檢測，重復(fù)3次，在體視顯微鏡下計算孢子密度（個/10 g干土）。

1.2.2.3 AMF的分子多樣性

根據(jù)E.Z.N.A. soil DNA kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）的使用說明，進行總DNA的提取。使用NanoDrop2 000（美國Thermo Scientific公司）檢測DNA的濃度和純度。用特異性引物AML1/AML2（5′-ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA-3′；5′-GAACCCAAACACTTTGGTTTCC-3′）和AMV4-5NF/AMDGR（5′-AGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′；5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′）進行巢式PCR擴增［30］。產(chǎn)物回收定量后，使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq 試劑盒對純化PCR產(chǎn)物建庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.2.4 AMF的分離與鑒定

用濕篩傾斜-蔗糖梯度離心法分離獲得AMF孢子，采用尚昆等的方法［21］挑選和觀察孢子形態(tài)，參照 http：//www.amf-phylogeny.com/、http：//invamwvu. edu/home、http：//www.zor.zut.edu.pl/、http：//mycobank.org/等網(wǎng)站上的種類描述，進行種屬鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Uparse 7.0.1090在Silva數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de/）進行OTU分析，采用mothur v.1.30.2（http：//www.mothur.org/wiki/Calculators）計算α多樣性指數(shù)Chao 1、Shannon指數(shù)等，并采用Wilxocon秩和檢驗進行α多樣性的組間差異分析；用LEfSe分析（Linear discriminant analysis Effect Size）（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/LEfSe）（LDA>2，P<0.05）確定不同組間從門到屬水平的豐度顯著差異性。使用基于距離的冗余分析（distance-based redundancy analysis，db-RDA）來調(diào)查土壤因子對AMF群落的影響。采用Origin Pro 8.5（http：//www.originlab.com/）進行AMF侵染率和孢子密度繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表2可知，7個樣地均為酸性土壤（平均pH值為4.54），樣地MAZA的pH值最高，XUESHAN、CAOHAI、HEISHI的pH值較低（3個樣地?zé)o顯著性差異）。全磷含量最高的為樣地HEISHI，較低的是TUJIE、XUESHAN（2個樣地間無顯著差異）；7個樣地的平均全磷含量為1.38 g/kg。全氮含量較高的是樣地XUESHAN、YUNGUI、CAOHAI（3個樣地間無顯著性差異），含量較低的是DAJIE、MAZA、HEISHI（3個樣地間無顯著差異）；7個樣地的平均全氮含量為 2.15 g/kg。全鉀含量最高的是樣地HEISHI，含量最低的是CAOHAI，除樣地DAJIE外，2個樣地與其他4個樣地之間差異顯著（P<0.05）；7個樣地的平均全鉀含量為 10.81 g/kg。有效磷含量最高的是樣地YUNGUI，最低的是MAZA，2個樣地與其他5個樣地之間差異顯著（P<0.05）；7個樣地的平均有效磷含量為1.43 mg/kg。堿解氮含量最高的是樣地TUJIE，最低的是HEISHI，2個樣地與其他5個樣地之間差異顯著（P<0.05）；7個樣地的平均堿解氮含量為 74.72 mg/kg。速效鉀含量最高的是樣地TUJIE，較低的是DAJIE、CAOHAI、HEISHI（3個樣地之間無顯著性差異）；7個樣地的平均速效鉀含量為 114.95 mg/kg。有機質(zhì)含量最高的是樣地YUNGUI，較低的是DAJIE、MAZA、HEISHI（3個樣地之間無顯著性差異）；7個樣地的平均有機質(zhì)含量為43.12 g/kg。由上可知，7個樣地間的土壤養(yǎng)分差異較大，存在空間異質(zhì)性。

2.2 AMF侵染率及孢子含量

威寧短柱油茶根系被AMF侵染后主要形成根外菌絲、根內(nèi)菌絲、泡囊、叢枝等結(jié)構(gòu)（圖1）。AMF菌絲在根外形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，在根內(nèi)沿縱軸延伸；菌絲末端膨大形成泡囊，大小不一，主要呈圓形、橢圓形；菌絲末端二分叉式生長，形成叢枝，主要以Arum型（疆南星型）叢枝為主。

威寧短柱油茶AMF各結(jié)構(gòu)侵染率在不同樣地中存在差異（圖2）。AMF菌絲侵染率最高的樣地為XUESHAN、MAZA，最低的是HEISHI。AMF叢枝侵染率最高的是樣地XUESHAN，其次為DAJIE、TUJIE、MAZA、 YUNGUI（4個樣地間無顯著性差異），

最低的是HEISHI。AMF泡囊侵染率最高的樣地有5個，分別是XUESHAN、DAJIE、TUJIE、YUNGUI、MAZA；最低的是HESH。AMF總侵染率最高的樣地是XUESHAN、MAZA，其次為DAJIE、TUJIE、YUNGUI，樣地HEISHI的總侵染率最低?？梢姡煌瑯拥亻g，AMF總侵染率、菌絲侵染率變化趨勢一致。AMF侵染強度最高的是XUESHAN、MAZA，其次為TUJIE，最低的是CAOHAI。AMF孢子密度最高的樣地是XUESHAN、MAZA，其次為DAJIE，最低的是HEISHI。7個樣地的菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊侵染率、總侵染率、侵染強度的平均值分別為59.52%、13.49%、51.59%、65.87%、61.11%，平均孢子密度為151個/10 g干土。

2.3 測序質(zhì)量分析

7個樣地檢測到447 639條原始序列，歸為424個OTU。其中樣地XUESHAN有78 417條有效序列，53個OTU；DAJIE有58 566條有效序列，103個OTU；TUJIE有53 871條有效序列，68個OTU；YUNGUI有69 969條有效序列，50個OTU；CAOHAI有69 963條有效序列，34個OTU；MAZA有59 742條有效序列，73個OTU；HEISHI有 57 111 條有效序列，43個OTU。7個樣地共有的OTU較少，僅3個。對序列按97%相似度進行歸并和OTU劃分，利用mothur計算不同隨機抽樣下的α多樣性指數(shù)，利用R語言工具制作稀釋曲線。由圖3可知，7個樣地的稀釋曲線均趨于平坦，表明測序深度基本覆蓋了樣品中的所有物種，測得的數(shù)據(jù)能反映威寧短柱油茶根圍AMF群落的真實情況，可進行數(shù)據(jù)分析。

2.4 AMF群落系統(tǒng)分類

除3.91%未注釋到OTU外，其余OTU經(jīng)序列比對歸為1門［球囊菌門（Glomeromycota）］，1綱［球囊菌綱（Glomeromycetes）］，4目［球囊霉目（Glomerales）、多樣孢囊霉目（Diversisporales）、類球囊霉目（Paraglomerales）、原囊霉目（Archaeosporales）］，5科［球囊霉科（GloUpiajCEV3vk2PkNQSoMZCj1M8n2WzNWQskuIpBjF4ZI=meraceae）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、無梗囊霉科（Acaulosporaceae）、類球囊霉科（Paraglomeraceae）、原囊霉科（Archaeosporaceae）］（表2）。其中球囊霉科的相對豐度較高，占82.49%，巨孢囊霉科、無梗囊霉科、類球囊霉科、原囊霉科的相對豐度較低，分別為5.61%、5.52%、1.54%、0.91%。

2.5 AMF在屬水平上的相對豐度變化

7個樣地OTU經(jīng)序列比對劃分為5個屬，即球囊霉屬（Glomus）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）、原囊霉屬（Archaeospora）（圖4）。樣地YUNGUI、DAJIE、TUJIE均檢測到以上5個屬的AMF；5個屬的相對豐度，在樣地YUNGUI分別為99.01%、0.05%、0.02%、0.01%、0.01%，在DUIJIE分別為36.21%、34.26%、1.86%、9.25%、3.67%，在TUJIE分別為65.36%、7.86%、19.98%、2.32%、3.24%。樣地MAZA僅檢測到4個屬，即球囊霉屬、無梗囊霉屬、類球囊霉屬、原囊霉，其相對豐度分別為95.06%、1.83%、1.66%、0.58%。樣地CAOHAI、XUESHAN檢測到2個屬的AMF，即球囊霉屬、無梗囊霉屬，其相對豐度在CAOHAI分別為96.54%、3.46%，在XUESHAN分別為90.36%、9.64%。樣地HEISHI除了檢測出球囊霉屬的AMF外，還檢測到類球囊霉屬，其相對豐度分別為95.32%、0.05%?？梢?，球囊霉屬、無梗囊霉屬為6個樣地共有（樣地HEISHI無無梗囊霉屬）。此外，除樣地DAJIE、TUJIE外，其余5個樣地中球囊霉屬的相對豐度均在90%以上，遠高于其他屬，為威寧短柱油茶根圍AMF的優(yōu)勢屬。

2.6 AMF在種水平的物種豐度

從種水平上看，7個樣地共檢測到46個AMF虛擬種，將豐度小于1%的虛擬種進行合并，得到豐度較高的14個虛擬種，其中10個被注釋，4個未被注釋。由圖5可以看出，豐度較高的虛擬種依次為VTX00223、VTX00084、VTX00224、VTX00291，均為球囊霉屬真菌。盾巨孢囊霉屬、無梗囊霉屬、類球囊霉屬、原囊霉屬雖有檢出，但豐度較低。

2.7 AMF群落的α多樣性指數(shù)

威寧短柱油茶AMF的α多樣性分析結(jié)果（表3）顯示，AMF的辛普森（Simpson）指數(shù)最高的為樣地MAZA（35.64），最低的為YUNGUI（10.09），7個樣地土壤中AMF的辛普森指數(shù)由高到低排序為MAZA>CAOHAI>HEISHI>XUESHAN>TUJIE>DAJIE>YUNGUI。Chao 1指數(shù)最高的為樣地TUJIE（38.92），最低的為樣地CAOHAI（22.50），7個樣地Chao 1指數(shù) 由高到低依次為TUJIE>YUNGUI>MAZA>XUESHAN>DAJIE>HEISHI>CAOHAI。ACE指數(shù)最高的為樣地YUNGUI（47.39），最低的為CAOHAI（22.20），7個樣地ACE指數(shù)由高到低依次為YUNGUI>TUJIE>XUESHAN>MAZA>DAJIE>HEISHI>CAOHAI。香農(nóng)指數(shù)（Shannon）最高的為樣地YUNGUI（2.66），最低的為MAZA（1.70），香農(nóng)指數(shù)由高到低排序為YUNGUI>DAJIE>TUJIE>CAOHAI>XUESHAN>HEISHI>MAZA?？梢?，7個樣地中AMF的4個多樣性指數(shù)間變化趨勢不一致。辛普森指數(shù)、Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)的分析結(jié)果均未達到顯著差異（P＞0.05），表明地理分布對威寧短柱油茶AMF多樣性影響不大。

2.8 AMF的群落結(jié)構(gòu)相似性及與土壤因子的關(guān)系

威寧短柱油茶根圍AMF的群落結(jié)構(gòu)相似性分析（圖6）顯示，樣地MAZA、CAOHAI、HEISHI、YUNGUI分布較集中，而DAJIE、XUESHAN、TUJIE分布較分散，表明MAZA、CAOHAI、HEISHI、YUNGUI群落組成差異較小，而DAJIE、XUESHAN、TUJIE群落組成差異較大。從圖6中P值（P=0.001）可以看出，威寧短柱油茶不同樣地間的AMF屬水平上的群落結(jié)構(gòu)存在極顯著差異。

由圖7 RDA結(jié)果顯示，第1排序軸解釋群落變化的90.25%，第2排序軸解釋群落變化的2.96%，則土壤因子對威寧短柱油茶AMF群落變異的解釋量為93.21%。威寧短柱油茶根圍土壤中的堿解氮、

全磷、全鉀含量對XUESHAN、DAJIE、YUNGUI 這3個樣地的油茶根圍土壤AMF群落分布有顯著影響

（P＜0.05）。土壤中全磷、速效鉀、堿解氮含量對無梗囊霉屬的基因豐度均有正向影響，其中對堿解氮含量的影響最大（P＜0.05）；全磷含量對盾巨孢囊霉屬、類球囊霉屬、某一種類球囊霉綱中不能識別物種unclassified_c_Glomeromycetes的基因豐度有正向影響，其中對盾巨囊孢霉屬的影響顯著（P＜0.05）。球囊霉屬的微生物基因豐度僅受全鉀含量的顯著影響（P＜0.05）。

2.9 AMF孢子的形態(tài)學(xué)鑒定

對7個樣地土壤AMF孢子進行分離和形態(tài)學(xué)鑒定，共鑒定出4屬13種AMF（表4）。其中球囊霉屬有6種（黃孢球囊霉G.flavisporum、凹坑球囊霉G.Multiforum、大果球囊霉G.macrocarpum、G.sp1、G.sp2、G.sp3），盾巨孢囊霉屬有1種（美麗盾巨孢囊霉S. calospora），無梗囊霉屬Acaulospora有5種（蜜色無梗囊霉A.mellea、細凹無梗囊霉A. excavate、科氏無梗囊霉A.koskei、A.sp1、A.sp1），原囊霉屬有1種（波狀原囊霉Ar. Undulata）。每種AMF在7個樣地中出現(xiàn)的頻率存在差異。G.sp1出現(xiàn)的頻率最高，在7個樣地中均有出現(xiàn)，G.sp3（出現(xiàn)在5個樣地）、美麗盾巨孢囊霉（出現(xiàn)在4個樣地）出現(xiàn)的頻率次之，科氏無梗囊霉出現(xiàn)的頻率最低，僅在YUNGUI樣地中出現(xiàn)。

3 討論

AMF是根圍微生物中的一個重要微生物，它能與陸地上80%的維管植物形成共生關(guān)系，具有促進寄主生長、抵抗多種脅迫環(huán)境等重要的生理和生態(tài)功能［31-32］。侵染率是反映真菌與寄主共生緊密度的一個指標(biāo)。侵染率越高，表明真菌與寄主的共生越好，其對寄主發(fā)揮的作用越強［33］。本研究中，7個樣地威寧短柱油茶根系平均總侵染率為65.87%， 平均侵染強度為61.11%，表明AMF與威寧短柱油茶根系形成了良好的共生關(guān)系。從AMF侵染率和土壤孢子密度（平均孢子密度151個/10 g干土）來看，威寧短柱油茶菌根化率較高，是菌根依賴性植物。一般來說，中性至微酸性土壤有利于AMF菌根的發(fā)育［20］。威寧短柱油茶主要生長在山地黃棕壤，其pH值平均為4.54，可能是導(dǎo)致其侵染率高、菌根依懶性強的原因。此外，AMF的孢子含量、根內(nèi)菌絲侵染率、叢枝侵染率、泡囊侵染率、總侵染率等在7個樣地間均存在差異，表明地理分布格局是影響AMF侵染的一個重要因素，這與曹敏等研究茅蒼術(shù)根圍叢枝菌根真菌多樣性時得到的結(jié)論［20］一致。

本研究通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬在所有檢測出的種屬中相對豐度最高，是所有樣地的優(yōu)勢屬，這與Liu等［15］、鄧小軍等［16］、周光榮等［17］的研究結(jié)果一致，表明球囊霉屬是油茶林中AMF分布范圍最廣的屬。球囊霉屬是大多數(shù)植物根圍的優(yōu)勢屬［34-39］，這可能與球囊霉屬真菌能夠通過菌絲片段和菌根根段繁殖，具有較強的產(chǎn)孢能力和侵染能力有關(guān)［40］。周光榮等在研究普通油茶野生林AMF的多樣性時發(fā)現(xiàn)，野生油茶根圍的AMF有6個屬［17］。本研究由高通量測序得到5個屬的AMF，孢子形態(tài)學(xué)鑒定得到4個屬的AMF，相較于普通油茶，威寧短柱油茶根圍土壤中缺少了近明囊霉屬（Claroideoglomus）、多孢囊霉屬（Diversispora）的AMF，但比普通油茶多了盾巨孢囊霉屬。這樣的種屬差異可能與AMF對寄主植物有一定的選擇性、不同種類植物與菌根真菌的親和性存在差異有關(guān)。普通油茶為我國分布最廣且栽培最多的油茶種類，一般生長在海拔1 200 m以下的南方丘陵地區(qū)［3］。威寧短柱油茶則生長在海拔1 800～2 700 m 的高海拔山地。AMF與油茶種類的親和性差異原因是否由海拔梯度造成，還有待進一步探討。

土壤因子是影響AMF群落結(jié)構(gòu)特征的重要因素［40］。大量研究顯示，土壤pH值對AMF多樣性影響顯著［37-40］，可能是由于其影響了孢子萌發(fā)和菌絲生長［11］。本研究中，pH值與威寧短柱油茶根圍AMF群落組成無相關(guān)性，這或許與威寧短柱油茶林地pH值空間變異性較低（變異系數(shù)為13.16%）有關(guān)。此外，RDA結(jié)果表明，堿解氮含量對無梗囊霉屬的基因相對豐度有顯著影響（P＜0.05）；全磷含量對盾巨孢囊霉屬、類球囊霉屬的基因相對豐度有顯著影響（P＜0.05），而全鉀含量則顯著影響了球囊霉屬的基因相對豐度（P＜0.05）?？梢?，不同種類的AMF對土壤養(yǎng)分存在一定的選擇性。本研究只是進行了一次抽樣，并沒有在隨后的幾年中進行重復(fù)試驗，故得出的威寧短柱油茶根圍AMF時空多樣性還不夠全面，后續(xù)將采取多個和連續(xù)樣本來分析威寧短柱油茶AMF的時空多樣性。

本研究采用高通量測序技術(shù)在威寧短柱油茶根圍檢測到5科、5屬、46種AMF，其中球囊霉屬、無梗囊霉屬在6個樣地中共有，表明2個屬的真菌分布較廣泛。通過孢子形態(tài)學(xué)鑒定，7個樣地共鑒定到4科4屬13種AMF真菌，其中球囊霉屬種類最多，其次是無梗囊霉屬，2種方法檢測出來的優(yōu)勢種屬結(jié)果相一致，但高通量測序獲得的檢測結(jié)果更多，更能反映威寧短柱油茶根圍AMF多樣性的真實情況。雖然高通量測序技術(shù)能更真實地反映植物根圍AMF結(jié)構(gòu)和種類，但卻無法分離AMF。想要保存和利用AMF資源，孢子形態(tài)學(xué)鑒定方法必不可少。通過形態(tài)學(xué)和分子鑒定相結(jié)合的方法獲取AMF種類，可為優(yōu)質(zhì)AMF資源的發(fā)掘提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過高通量測序分析7個樣地威寧短柱油茶的AMF群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，結(jié)果表明，威寧短柱油茶根系A(chǔ)MF平均總侵染率為65.87%，每 10 g 干土中含孢子151個，具有較高的菌根依賴性；其AMF群落組成和相對豐度差異較大，但多樣性無顯著差異；通過高通量測序，7個樣地共鑒定到5屬46種AMF，其中球囊霉屬的相對豐度最高，為優(yōu)勢類群，VTX00223為優(yōu)勢虛擬種。通過孢子形態(tài)學(xué)，鑒定到4屬13種AMF。其中球囊霉屬6種，無梗囊霉屬5種，盾巨孢囊霉屬、原囊霉屬各1種，G.sp1出現(xiàn)頻率最高，為7個樣地共有。2種方法檢測出來的優(yōu)勢種屬結(jié)果相一致；土壤因子是影響AMF侵染的一個重要因素，其中堿解氮、全磷、全鉀含量是影響威寧短柱油茶根圍AMF群落結(jié)構(gòu)和組成的主要土壤因子。威寧短柱油茶根圍AMF 資源豐富，可為以后開發(fā)油茶抗逆性專用AMF菌肥提供豐富的菌種資源。

參考文獻：

［1］陳永忠. 油茶優(yōu)良種質(zhì)資源［M］. 北京：中國林業(yè)出版社，2008：15.

［2］李 寧，賀均林，王 敏. 山茶油的藥理活性及專利應(yīng)用［J］. 廣州化工，2013，41（10）：30-33.

［3］莊瑞林. 中國油茶［M］. 2版. 北京：中國林業(yè)出版社，2012：3-4.

［4］劉 燕. 威寧短柱油茶插穗生根發(fā)育及生理特性研究［J］. 西部林業(yè)科學(xué)，2022，51（2）：13-19.

［5］曾維軍，秦 維，安常蓉，等. 威寧短柱油茶扦插育苗技術(shù)研究［J］. 貴州師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，40（3）：27-32.

［6］李永康，王道植，梁緯祥，等. 威寧短柱油茶的初步研究［J］. 林業(yè)科學(xué)，1980，16（3）：198-202.

［7］王道植，梁緯祥，黃鶴先，等. 貴州高寒山區(qū)發(fā)現(xiàn)野生的威寧短柱油茶［J］. 林業(yè)科技通訊，1979（9）：16-17.

［8］耿繼斌，許 杰，王 進，等. 威寧短柱油茶資源現(xiàn)狀調(diào)查及利用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（18）：128-131.

［9］嚴(yán)梅和，李 和. 威寧短柱油茶種子油中的脂肪酸、甾醇和三萜醇的研究［J］. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，1984，5（3）：355-360.

［10］李 芳，寧選爭，王 進，等. 威寧短柱油茶苗木質(zhì)量分級研究［J］. 種子，2022，41（5）：133-138.

［11］Liu R C，Xiao Z Y，Hashem A，et al. Unraveling the interaction between arbuscular mycorrhizal fungi and Camellia plants［J］. Horticulturae，2021，7（9）：322.

［12］王東雪，陳國臣，江澤鵬. 叢枝菌根對油茶幼苗生長和氮磷吸收的影響［J］. 林業(yè)科技開發(fā)，2010，24（1）：23-26.

［13］林宇嵐，王 琳，樓玫娟，等. AM真菌與有機磷配施對油茶光合特性的影響［J］. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2021，43（1）：136-143.

［14］林宇嵐，李正昀，張林平，等. 有機磷和AM真菌對油茶生長、根系形態(tài)和光合作用的影響［J］. 經(jīng)濟林研究，2021，39（1）：121-128，210.

［15］Liu R C，Xiao Z Y，Hashem A，et al. Mycorrhizal fungal diversity and its relationship with soil properties in Camellia oleifera［J］. Agriculture，2021，11（6）：470.

［16］鄧小軍，周國英，劉君昂，等. 湖南油茶林叢枝菌根真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征［J］. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2011，31（10）：38-42.

［17］周光榮，尚 昆，江 龍. 野生油茶根圍土壤的AM真菌多樣性調(diào)查［J］. 貴州大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，36（6）：26-31.

［18］林宇嵐，李正昀，吳 斐，等. 不同品種油茶根際叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)特征［J］. 林業(yè)科學(xué)研究，2020，33（5）：163-169.

［20］曹 敏，胡開治，劉燕琴，等. 高通量測序分析重慶地區(qū)茅蒼術(shù)根際叢枝菌根真菌多樣性［J］. 微生物學(xué)通報，2020，47（9）：2877-2886.

［21］尚 昆，石 磊，李海波，等. 梵凈山不同海拔叢枝菌根真菌多樣性［J］. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2020，48（2）：76-80.

［22］張之為，田永偉，楊劍峰，等. 內(nèi)蒙古中部地區(qū)馬鈴薯根際和根系叢枝菌根真菌類群的多樣性［J］. 微生物學(xué)通報，2020，47（3）：738-748.

［23］Jiang S J，Liu Y J，Luo J J，et al. Dynamics of arbuscular mycorrhizal fungal community structure and functioning along a nitrogen enrichment gradient in an alpine meadow ecosystem［J］. New Phytologist，2018，220（4）：1222-1235.

［24］Helgason T，Merryweather J W，Denison J，et al. Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of co-occurring fungi and plants from a temperate deciduous woodland［J］. Journal of Ecology，2002，90（2）：371-384.

［25］秦 維，曾維軍，羅文敏，等. 威寧短柱油茶林地土壤肥力及對果實產(chǎn)量和含油率的影響［J］. 貴州師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2023，45（5）：114-120.

［26］Zhang F，Wang P，Zou Y N，et al. Effects of mycorrhizal fungi on root-hair growth and hormone levels of taproot and lateral roots in trifoliate orange under drought stress［J］. Archives of Agronomy and Soil Science，2018，65（9）：1316-1330.

［27］Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for cleaning and staining parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection［J］. Transactions of the British Mycological Society，1970，55：158-161.

［28］Biermann B，Linderman R G. Quantifying vesicular-arbuscular mycorrhizae：a proposed method towards standardization［J］. New Phytologist，1981，87（1）：63-67.

［29］Ianson D C，Allen M F. The effects of soil texture on extractionof vesicular-arbuscular mycorrhizal fungal spores from aridsites［J］. Mycologia，1986，78（2）：164-168.

［30］van Geel M，Busschaert P，Honnay O，et al. Evaluation of six primer pairs targeting the nuclear rRNA operon for characterization of arbuscular mycorrhizal fungal （AMF） communities using 454 pyrosequencing［J］. Journal of Microbiological Methods，2014，106：93-100.

［31］Solís-Rodríguez U R J，Ramos-Zapata J A，Hernández-Cuevas L，et al. Arbuscular mycorrhizal fungi diversity and distribution in tropical low flooding forest in Mexico［J］. Mycological Progress，2020，19（3）：195-204.

［32］劉宇樂，姜宛彤，蘇文欣，等. 叢枝菌根真菌調(diào)控植物耐鹽堿機制研究進展［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（19）：9-17.

［33］Yan L，Wei X L.Dark septate endophyte improves drought tolerance of Ormosia hosiei hemsley & E. H. Wilson by modulating root morphology，ultrastructure，and the ratio of root hormones［J］. Forests，2019，10（10）：830.

［34］Daniell T J，Husband R，F(xiàn)itter A H，et al. Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising arable crops［J］. FEMS Microbiology Ecology，2001，36（2/3）：203-209.

［35］Wu Q，Sun P，Srivastava A K. AMF diversity in citrus rhizo-sphere［J］. Indian Journal of Agricultural Sciences，2017，87 （5）：653-656.

［36］Tabti S，Bendimered-Mouri F Z. Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizosphere of Plantago coronopus in Northwestern Algerian coast［J］. Journal of Degraded and Mining Lands Management，2022，9（2）：3397-3404.

［37］宋 娟，任嘉紅，陳鳳毛，等. 楓香根圍叢枝菌根真菌多樣性［J］. 林業(yè)科學(xué)，2021，57（9）：98-109.

［38］石兆勇，王發(fā)園，陳應(yīng)龍. 五指山常見熱帶樹種的叢枝菌根真菌多樣性［J］. 生態(tài)學(xué)報，2007，27（7）：2896-2903.

［39］Rodrigues K M，Rodrigues B F. Glomus［M］//Amaresan N，Murugeasn S，Annapurna K，et al. Beneficial microbes in agro-ecology：bateria and fungi. London：Academic Press，2020：561-569.

［40］王化秋，程 巍，郝 俊，等. 貴州煤矸石山香根草根系及根際土叢枝菌根真菌（AMF）群落的季節(jié)動態(tài)研究［J］. 菌物學(xué)報，2021，40（3）：514-530.