火土灰施用對植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及烤煙產(chǎn)質(zhì)量的影響

摘要：為明確火土灰對植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及烤煙產(chǎn)質(zhì)量的影響，采用連續(xù)2年的田間定位試驗(yàn)，共設(shè)置不施火土灰（CK）、半量火土灰（T1，3 000 kg/hm2）、常量火土灰（T2，6 000 kg/hm2）、倍量火土灰（T3，12 000 kg/hm2）4個處理，研究3種梯度用量的火土灰對土壤細(xì)菌群落組成、優(yōu)勢菌群相對豐度及煙葉長勢、經(jīng)濟(jì)性狀和烤后煙化學(xué)成分的影響。結(jié)果表明：（1）連續(xù)2年施用火土灰的處理土壤中綠彎菌門、放線菌門相對豐度呈增加趨勢，增幅最大的是T3處理，分別為15.35%和6.16%，同時T3處理的細(xì)菌OTU數(shù)量較CK增加了15.40%；（2）連續(xù)2年施用火土灰對煙株葉片生物量的提升作用顯著，隨著火土灰施用量的增加，2021、2022年T3處理葉片生物量的增幅分別為35.78%、51.12%，同時T3處理的產(chǎn)量和產(chǎn)值也是增幅最大的；（3）第1年還原糖和總氮含量因施用火土灰出現(xiàn)顯著降低；第2年各堆肥處理的烤后煙葉化學(xué)成分趨于穩(wěn)定，化學(xué)指標(biāo)配比趨于平衡。倍量施用火土灰在優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、提高烤煙產(chǎn)質(zhì)量等方面均具有優(yōu)勢，今后考慮在煙田生產(chǎn)上連續(xù)多年施用以強(qiáng)化效果。

關(guān)鍵詞：火土灰；植煙土壤；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；烤煙經(jīng)濟(jì)性狀；烤煙化學(xué)品質(zhì)

中圖分類號：S572.06 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0115-07

收稿日期：2023-12-11

基金項(xiàng)目：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（編號：ASTIP-TRIC03）。

作者簡介：況 帥（1988—），男，山東青島人，農(nóng)藝師，主要從事土壤健康評價及煙草栽培管理工作。E-mail：kuangshuai@caas.cn。

通信作者：邱銘生，農(nóng)藝師，主要從事煙草生產(chǎn)栽培管理工作。E-mail：1586057267@qq.com。

火土灰不同于秸稈廢棄物與動物糞便的混合堆肥，它是一種非完全燃燒的植物殘體和土壤混合漚制的產(chǎn)物［1］。其制備方法是將農(nóng)作物秸稈等植物殘體進(jìn)行堆積點(diǎn)燃后覆蓋土壤使其處于陰燃狀態(tài)，然后在其上繼續(xù)重復(fù)堆積陰燃的操作，最后再經(jīng)過3～4個月的漚制完成［2］。火土灰的主要組分包括未燃燒的植物殘體、植物體完全燃燒產(chǎn)物草木灰以及無氧燃燒產(chǎn)物生物炭，這使其不僅具備草木灰鉀富集度高的特點(diǎn)，還具備了改良土壤物理性狀和提高有機(jī)質(zhì)含量的效果，其合理應(yīng)用對于植煙土壤改良具有較大意義。

烤煙長勢及產(chǎn)質(zhì)量受土壤條件、自然因素、施肥水平和烘烤技術(shù)等一系列外在因素的影響，其中施肥水平是調(diào)控烤煙生長發(fā)育和影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵人為因素［3-5］?；鹜粱抑泻胸S富的速效氮、鉀元素和有機(jī)質(zhì)，同時還含有一定量的磷及中微量元素，對促進(jìn)煙草生長、增加產(chǎn)量產(chǎn)值和提高煙葉品質(zhì)均有積極作用［6］。植物混合堆肥中同時富含一定量的草木灰和生物炭，相關(guān)研究表明草木灰對增加根際土壤微生物多樣性和改善微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著作用［7］。程揚(yáng)等研究顯示，施用生物炭可以顯著提高玉米非根際土壤微生物群落的多樣性，生物炭施用量為5 t/hm2的處理在21 d時土壤OTU數(shù)相比于7 d時增加了174.56%［8］；姚玲丹等的研究也指出，生物炭通過直接（提供養(yǎng)分棲息環(huán)境等）或者間接（影響土壤理化性質(zhì)等）的作用影響土壤中微生物群落組成和多樣性［9］。另外，火土灰有較低的容重、較高的通透性和豐富的礦質(zhì)營養(yǎng)，能顯著促進(jìn)煙苗根系生長和對養(yǎng)分的吸收，對煙苗緩苗和前期生長作用顯著［10］。相關(guān)研究顯示，火土灰和火土灰加豬糞制作的土雜肥對煙葉生長發(fā)育及增產(chǎn)增收具有較明顯的促進(jìn)作用，可分別提高煙葉產(chǎn)值8.75%和26.65%；相關(guān)研究表明，施用火土灰的烤煙產(chǎn)質(zhì)量顯著高于施用草木灰、碳化谷殼和草木灰與中量肥配施的處理，增幅分別為9.57%、6.43%和16.86%（P<0.05）［11-12］。目前針對火土灰的相關(guān)研究較少，主要集中于農(nóng)業(yè)應(yīng)用推廣類型，鮮有研究報道其在植煙土壤改良及煙葉經(jīng)濟(jì)效益方面的作用，類似的混合堆肥與動物糞便混合的傳統(tǒng)堆肥研究也主要集中在土壤理化性質(zhì)和植物生長方面。本研究通過分析火土灰不同施用量對植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、烤煙田間長勢和經(jīng)濟(jì)性狀的影響，綜合分析得出火土灰的適宜施用量，為當(dāng)?shù)刂矡熗寥栏牧己蛢?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基礎(chǔ)信息

田間試驗(yàn)共計2年時間（2021—2022年），每年從3月初整地移栽開始，至7月初采烤結(jié)束為止。試驗(yàn)位于湖南省郴州市桂陽縣（112°49′14.678″E，25°46′45.984″N），土壤類型為黃壤土，土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

烤煙供試品種為湘煙6號，試驗(yàn)設(shè)置4個處理，CK：常規(guī)施肥，土壤中不施用火土灰；T1：常規(guī)施肥，土壤中火土灰施用量為3 000 kg/hm2；T2：常規(guī)施肥，土壤中火土灰施用量為6 000 kg/hm2，等于常規(guī)火土灰用量；T3：常規(guī)施肥，土壤中火土灰施用量為12 000 kg/hm2。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，共計12個小區(qū)。株行距為分別為0.6、1.2 m，小區(qū)面積69.12 m2（7.2 m×9.6 m）。各處理間除火土灰施用量不同外，其他各項(xiàng)田間管理及操作均保持一致，試驗(yàn)各處理位置及面積在2年試驗(yàn)中保持一致，火土灰在每年移栽起壟前（3月10日左右）均勻撒施進(jìn)相應(yīng)植煙田塊土壤中，在耕整地時隨旋耕機(jī)翻埋入土。

1.3 樣品采集及處理

1.3.1 土壤微生物樣品

2022年5月30日烤煙成熟期，采用五點(diǎn)取樣法采集耕層（0～20 cm）土壤樣品，按小區(qū)將樣品混勻后用4分法留樣，微生物樣品用無菌袋標(biāo)記封存，置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2 植株生物量樣品

在烤煙平頂期（打頂后1周：2021年6月3日和2022年5月30日）各小區(qū)分別選取長勢一致且具有代表性的煙株，分根、莖、葉用清水清洗干凈后，使用鼓風(fēng)干燥箱，進(jìn)行105 ℃殺青30 min，然后75 ℃烘干至恒重再測定生物量。

1.3.3 經(jīng)濟(jì)性狀及烤后煙葉樣品調(diào)查采集

各小區(qū)經(jīng)濟(jì)性狀調(diào)查采用單獨(dú)采收標(biāo)記，按小區(qū)單獨(dú)編桿烘烤的方式，待煙葉烘烤完成后，按各小區(qū)單獨(dú)進(jìn)行煙葉分級計算產(chǎn)量、產(chǎn)值，并采集C3F等級煙葉進(jìn)行煙葉化學(xué)成分檢測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 土壤細(xì)菌群落分析

本試驗(yàn)使用E.Z.N.A.TM （Omega Bio-Tek，USA）試劑盒提取土壤微生物基因組DNA（gDNA），然后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。PCR采用TransGen AP221-02，參照電泳初步定量結(jié)果，PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。檢測合格的文庫采用Illumina MiSeq對16SrRNA基因序列的V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序［13-1gxC8NSbN8pV/Zi3bdIjUQTOgdPfrU0/y+hOr3+EF6cc=4］。

1.4.2 植物樣品測定

初烤煙葉的測定：初考煙葉化學(xué)成分參照國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)，測定總氮（YC/T 161—2002《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續(xù)流動法》）、總植物堿（YC/T 160—2002《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動法》）、總糖（YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動法》）、還原糖（YC/T 159—2002《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動法》）含量［15］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

稀釋曲線使用97%相似度的OTU，利用Mothur作rarefaction分析，R語言進(jìn)行PCA、Venn統(tǒng)計分析和作圖；采用RDP Classifier算法對OTU代表序列進(jìn)行比對分析；基于Unweighted UniFrac距離矩陣，UPGMA方法聚類建樹，并將聚類結(jié)果與各樣品在門、綱、目、科、屬水平上的物種相對豐度整合展示。利用QIIME version 1.8.0 （http：//qiime.org/scri-pts/alpha_rarefaction.html）分析軟件對樣品作Alpha多樣性分析［13-14］。

采用SAS 9.1進(jìn)行差異顯著分析和單因素方差分析，并在α=0.05水平下進(jìn)行Duncan’s多重比較，采用Origin 9.1和Excel 2016進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同火土灰施用量對植煙土壤微生物的影響

2.1.1 細(xì)菌群落種類組成和相對豐度

由圖1可見，土壤細(xì)菌群落的相對豐度在門水平上占優(yōu)勢地位的主要是綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。與CK相比，隨著火土灰施用量的增加，綠彎菌門、放線菌門相對豐度呈增加趨勢，增幅分別為0.68%～15.35%（T3），2.31%～6.16%（T3）；酸桿菌門呈降低的趨勢，降幅為11.18%～19.84%（T1）；變形菌門在T1和T2火土灰用量處理下呈增加趨勢，增幅分別為9.82%和11.33%，而在T3處理下降低12.30%。

2.1.2 細(xì)菌OTU分布

Venn圖可以統(tǒng)計分析出各處理土壤樣品中OTU的數(shù)量和分布差異，直觀展示出土壤樣本中OTU組成的相似性和特異性。由圖2可見，4個處理植煙土壤樣品中共有的OTU的數(shù)量為1 560個，CK、T1、T2、 T3處理OTU總數(shù)分別

為3 720、3 317、2 306、4 293個，與CK比較可得，各處理獨(dú)有的OTU數(shù)量分別為864、326、 1 179 個，T1與CK共有的OTU數(shù)量為2 353個，占CK處理OTU總數(shù)的比例為63.25%；T2與CK共有的OTU數(shù)量為1 980個，占CK處理OTU總數(shù)的53.23%；T3與CK共有的OTU數(shù)量為3 114個，占CK處理OTU總數(shù)的83.71%。

2.1.3 細(xì)菌群落豐度及相似性分析

由群落組成熱力學(xué)圖（圖3）分析可知，T1和T2處理細(xì)菌群落處于樣品間聚類關(guān)系樹的同一分支，CK和T3處理處于同一分支，表明T1和T2處理序列進(jìn)化關(guān)系更近，CK和T3序列進(jìn)化關(guān)系接近；同時在門水平上T1和T2處理（CK與T3處理）間同種微生物的豐度更加接近。

由圖4 PCoA主成分分析可知，PC1（主成分1）和PC2（主成分2）對各處理樣品差異性的結(jié)實(shí)度分別為47.04%和12.62%，合計為59.66%，根據(jù)各處理的相對位置可以看出，T1和T2處理的細(xì)菌物種組成更為相似。

2.2 不同火土灰施用量對烤煙生長的影響

2.2.1 不同火土灰施用量對烤煙生物量的影響 由圖5可知， 與CK處理相比，2021年和2022年施

用火土灰的處理均顯著增加了烤煙葉片的生物量，各處理葉生物量大小趨勢均為T3>T2>T1>CK，2年最大增幅分別為35.78%和51.12%（P<0.05）；2021年根系生物量與CK相比有所增加但差異不顯著，2022年根系生物量顯著增加，其中增幅最大處理為T2（28.05%），其次為T3（27.58%）（P<0.05）；2021年莖稈生物量大小為T3>T1>T2>CK，最大增幅為44.12%（P<0.05），2022年莖稈生物量大小為T2>T1>T3>CK，最大增幅為9.53%（P<0.05）。施用火土灰對烤煙各部位生物量的提升作用不盡相同，其中葉片生物量增加最為顯著，在一定施用量范圍內(nèi)，葉片生物量隨火土灰施用量的增加呈增加趨勢。

2.2.2 不同火土灰施用量對烤煙經(jīng)濟(jì)性狀的影響

由圖6可知，與對照相比，2021年烤煙產(chǎn)量由高到低排序均為T3>T1>T2>CK，產(chǎn)值的排序?yàn)?T3>T1>CK>T2，其中T3處理烤煙產(chǎn)量和產(chǎn)值增幅最大，較CK分別提高了22.24%和21.20%（P<0.05）。 2022年， 烤煙的產(chǎn)量和產(chǎn)值隨火土灰施用量的增加呈遞增的趨勢，但處理間未呈現(xiàn)顯著差異，其中，T3處理產(chǎn)量和產(chǎn)值增幅最大，增幅分別為15.25%和16.15%。

2.2.3 不同火土灰施用量對烤煙化學(xué)品質(zhì)的影響

由圖7可知，2021年不同火土灰施用量處理的烤后煙葉中還原糖含量呈顯著降低趨勢，均顯著低于CK，其中T1、T2和T3較CK分別顯著降低16.90%、16.41%和11.79%（P<0.05）；烤后煙葉中煙堿的含量隨火土灰用量的增加呈顯著增加趨勢，顯著性順序表現(xiàn)為T3>T1>T2>CK，T3處理增幅最高，達(dá)34.18%（P<0.05）；總氮含量呈現(xiàn)降低的趨勢，其中T1和T2的降幅達(dá)到顯著水平，降幅為11.41%和10.33% （P<0.05）。2022年，與CK相比，各處理還原糖和總氮含量變化差異不顯著，煙堿含量T1和T3處理顯著增加，增幅分別為8.33%和13.89%。從烤后煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性入手分析可知，2021年，與CK處理相比，烤后煙葉糖堿比和氮堿比均呈降低趨勢，其中火土灰處理的煙葉糖堿比為8.54～9.62，氮堿比為0.84～0.92，顯著低于CK處理（分別為12.94和1.16）。2022年，烤后煙葉糖堿比均不顯著。

3 討論

3.1 不同火土灰施用量對植煙土壤細(xì)菌群落組成的影響

火土灰不僅具備草木灰鉀富集度高的特點(diǎn)，而且其中還混有非完全燃燒植物殘體形成的生物炭和未燃燒植物殘體經(jīng)過漚制形成的有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)元素。Luo等研究指出，生物炭具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)、比表面積巨大且pH值較高，可吸附水和養(yǎng)分，進(jìn)而為微生物提供充足的養(yǎng)分和良好的棲息環(huán)境［16-17］，復(fù)雜的碳結(jié)構(gòu)使其具有較好的生物穩(wěn)定性［18］，同時能夠有效改善土壤的微生物結(jié)構(gòu)，增加細(xì)菌群落的豐度和多樣性［8-9］。蔡秋華等的研究表明，草木灰對改善植煙土壤中微生物群落組成及提升群落豐度起到積極的作用［7］。李明等通過對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤性質(zhì)的典范對應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷和速效鉀極顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及群落多樣性［19］。而本研究也表明，施用火土灰處理的土壤樣品中細(xì)菌群落豐度和多樣性較對照有顯著增加，這一研究結(jié)果與陳澤斌等的研究結(jié)果［20］一致。這可能與火土灰中的草木灰、生物炭及豐富的有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分密切相關(guān)。本研究中在細(xì)菌門水平上綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門 （Acidobacteria）和變形菌門（ Proteobacteria）是優(yōu)勢菌門，合計占比達(dá)70%以上，這與吳憲等的研究結(jié)果［21］一致。土壤微生物參與多種生化反應(yīng)過程，是有機(jī)物的主要分解者，在陸地生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中扮演著重要角色［22］。鮮

文東等的研究表明，綠彎菌形態(tài)多樣，營養(yǎng)方式和代謝途徑非常豐富，C、N、S等一系列重要生命元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中都有它的參與［23］。放線菌門作為富營養(yǎng)菌對土壤中動植物殘體的分解和土壤碳氮循環(huán)發(fā)揮著重要作用，其中部分放線菌釋放的分解木質(zhì)素的酶，對分解木質(zhì)素和纖維素有明顯的作用［21，24］。酸桿菌門細(xì)菌是最主要的土壤微生物類群之一［25］，其中部分酸桿菌門細(xì)菌具有很強(qiáng)的碳利用能力，對纖維素和木質(zhì)素等多糖具有一定的分解能力［26］。變形菌門細(xì)菌具有固碳、固氮和解磷的作用，可以通過參與土壤氮磷循環(huán)改善土壤環(huán)境［27］。

3.2 不同火土灰施用量對烤煙生長及經(jīng)濟(jì)性狀的提升效應(yīng)

邵慧蕓等的研究表明，施用煙桿灰和生物炭等有機(jī)物料能改善烤煙農(nóng)藝性狀，有利于烤煙葉片干物質(zhì)的積累［28］。有機(jī)物料的施用對煙株的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，對烤煙株高、莖圍和產(chǎn)質(zhì)量的提升作用顯著［12，29］。本研究得出，施用火土灰處理的烤煙地上部和根系生物量均高于對照處理，其中地上部葉片生物量的增幅最顯著。蘭志龍等通過25年長期定位不同施肥措施的試驗(yàn)表明，長期施用有機(jī)肥有助于改善土壤結(jié)構(gòu)，降低土壤容重和緊實(shí)度，提高土壤持水性，有助于作物的生長和產(chǎn)量的提高［30］。本研究顯示，倍量施用火土灰對烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值的提升效果最顯著，并沒有出現(xiàn)連年倍量施用火土灰導(dǎo)致累積量超過閾值而對烤煙產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，后續(xù)仍可以繼續(xù)按12 000 kg/hm2的量施用并持續(xù)檢測煙葉產(chǎn)質(zhì)量是否出現(xiàn)增幅明顯降低。聶慶凱等研究顯示，施用高炭基肥可以顯著提高烤后煙葉中總糖（增幅26.19%）、煙堿（增幅6.70%）和鉀含量（增幅63.64%）［31］。本研究中，第1年的結(jié)果與上述研究一致，但還原糖和總氮含量因施用火土灰出現(xiàn)顯著降低的現(xiàn)象，連續(xù)施用第2年烤后煙葉中化學(xué)成分趨于穩(wěn)定，第1年出現(xiàn)化學(xué)成分含量增減幅度較大可能是由于增施的混合堆肥打破了土壤原有的養(yǎng)分及微生態(tài)平衡，改變了烤煙生長的土壤環(huán)境導(dǎo)致的，在連續(xù)施用第2年后土壤養(yǎng)分及微生態(tài)平衡重新建立，所以煙葉中各項(xiàng)化學(xué)成分開始趨于穩(wěn)定，這可能是由火土灰中的生物炭成分累積起主導(dǎo)作用導(dǎo)致的。相關(guān)研究顯示，優(yōu)質(zhì)煙葉內(nèi)在化學(xué)指標(biāo)成分含量為還原糖16%～20%，煙堿和總氮含量1.5%～3.5%，協(xié)調(diào)性指標(biāo)為糖堿比 8～12，糖氮比6～10，氮堿比≤1（接近1為最佳）［5，32］。本研究顯示，第1年施用火土灰后煙葉化學(xué)成分指標(biāo)中還原糖、糖堿比、和氮堿比指標(biāo)顯著降低，煙堿含量顯著增加，均比CK處理更符合優(yōu)質(zhì)煙葉成分標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)第2年施用火土灰后，T1和T3處理煙堿含量明顯增加，T2處理氮堿比更接近于1，其余指標(biāo)無顯著變化。因此這一結(jié)果可能是因?yàn)榛鹜粱抑胁恢皇巧锾窟€有草木灰和植物殘體的存在，對烤煙化學(xué)品質(zhì)及協(xié)調(diào)性的不同影響應(yīng)該是火土灰中多種主要成分共同作用的結(jié)果。當(dāng)前尚未明確長期施用火土灰對土壤質(zhì)量和烤后煙葉化學(xué)成分及感官質(zhì)量的影響，仍需要長期跟蹤監(jiān)測分析。

4 結(jié)論

綜上所述，持續(xù)施用火土灰對優(yōu)化植煙土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、豐富微生物群落組成具有積極作用，同時施用火土灰12 000 kg/hm2的處理從長效結(jié)果看對增進(jìn)烤煙田間長勢和烤后煙葉產(chǎn)質(zhì)量也具有更加顯著的作用。

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