高溫脅迫對不結(jié)球白菜幼苗生理指標(biāo)的影響及相關(guān)基因篩選

摘要：為探究不結(jié)球白菜不同品種對高溫脅迫的生理響應(yīng)和分子機(jī)制，以耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃為試驗(yàn)材料，通過人工模擬高溫（38 ℃）試驗(yàn)，分別在0、3、6、9、12 d測定幼苗葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD、SOD活性等生理生化指標(biāo)，并在0、6、24 h取樣，選取熱激轉(zhuǎn)錄因子和熱激蛋白家族中的相關(guān)基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)來比較2個(gè)品種的高溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：（1）矮腳黃的類胡蘿卜素含量在高溫脅迫3 d時(shí)較對照組顯著下降了42.86%，而脯氨酸含量在高溫脅迫6 d時(shí)是對照組的9.33倍，其POD活性在高溫脅迫12 d是對照組活性的10.00倍，SOD活性在高溫脅迫處理6 d時(shí)顯著下降，與3 d時(shí)的活性相比降低了52.10%。（2）SHI的葉綠素含量在高溫脅迫處理12 d時(shí)較對照組顯著提高20.61%，與此同時(shí)，可溶性糖含量與3 d時(shí)相比顯著上升了1.59 mg/g，可溶性蛋白含量與9 d時(shí)相比顯著上升，為52.91 mg/g。（3）HSP基因家族中HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2以及HSF基因家族中HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a在耐熱品種中整體上表達(dá)量更高。綜上，耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理下類胡蘿卜素、脯氨酸含量和酶（POD、SOD） 活性均有所波動(dòng)，但矮腳黃比SHI波動(dòng)更大。耐熱品種的葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量在高溫脅迫后期均呈明顯上升趨勢。HSP基因家族中HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2以及HSF基因家族中HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a為篩選出的耐熱相關(guān)基因，可能在幫助不結(jié)球白菜抵御高溫脅迫中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜；高溫脅迫；生理指標(biāo)；熱激蛋白；熱激轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S634.301 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）17-0140-09

收稿日期：2023-09-20

基金項(xiàng)目：大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（編號(hào)：S202110370088）。

作者簡介：賈婧怡（1998—），女，山西晉中人，碩士研究生，主要從事園藝植物逆境脅迫研究。E-mail：1005832854@qq.com。

通信作者：朱 波，博士，副教授，主要從事園藝植物逆境脅迫研究。E-mail：zhubo_ybdx119@163.com。

不結(jié)球白菜屬于十字花科 （Brassicaceae） 蕓薹屬蕓薹種的亞種［1］，因其種質(zhì)資源豐富、生長周期較短、易于栽培種植等特點(diǎn)，在我國多個(gè)省市及地區(qū)周年栽種。不結(jié)球白菜偏喜冷涼氣候，最適生長溫度為15～20 ℃。夏季高溫條件下，不結(jié)球白菜生長衰弱，易死苗，容易感染病蟲害，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降［2］。近年來全球氣候變暖，高溫會(huì)引起植物一系列生理生化和分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，嚴(yán)重影響植物的生長與生存［3］。

高溫脅迫不僅會(huì)抑制植物的光合反應(yīng)，而且會(huì)破壞光合機(jī)構(gòu)，使光合作用速率下降，葉片顏色會(huì)逐漸變淺，抑制花青素積累，一些植物的可溶性糖、可溶性蛋白含量降低，纖維素含量增加。植物在高溫脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧 （ROS） 會(huì)引起膜脂過氧化。這些ROS會(huì)對植物的細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷［4］。植物通過使用抗氧化底物和保護(hù)酶來對抗氧化應(yīng)激，它們與植物抗氧化防御系統(tǒng)的活性具有密切關(guān)系［5］。葉片超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD） 是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)中的重要酶，能有效地阻止O-2·和H2O2在植物體內(nèi)積累，使細(xì)胞內(nèi)自由基維持在低水平上，防止細(xì)胞受自由基的毒害［6］。徐海等研究了不結(jié)球白菜高華青等3個(gè)品種的耐熱性，發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜在應(yīng)對熱脅迫時(shí)葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白及淀粉等的含量均有所下降；脯氨酸和游離氨基酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量則呈上升趨勢，且均以熱敏材料上升幅度最大；丙二醛含量在熱脅迫處理前后變化不明顯；POD活性均為先下降再上升，耐熱材料高于熱敏材料；SOD活性總體均呈上升趨勢，且以熱敏材料升高幅度最明顯；抗壞血酸氧化酶活性則均呈現(xiàn)先大幅升高再大幅下降的變化趨勢［7］。由此表明，熱脅迫下耐熱品種具有更強(qiáng)的調(diào)控能力，以提高不結(jié)球白菜對熱脅迫的適應(yīng)性。

研究表明，熱激蛋白（HSP）的轉(zhuǎn)錄受熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）調(diào)控，HSPs廣泛參與植物響應(yīng)各種脅迫［8-9］。根據(jù)分子量可分為2類，即高分子量熱激蛋白 （HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和HSP40） 和低分子量熱激蛋白 （sHSP）［10］。其中HSP90和HSP70在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用；sHSP基因在高溫、鹽脅迫等條件下高表達(dá)［11］。多項(xiàng)研究表明，sHSP基因在高溫脅迫下呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，如花楸、茶樹和水稻的個(gè)別sHSP基因在高溫脅迫初期快速上調(diào)表達(dá)，在達(dá)到峰值后下降［12-14］。HSF參與植物生長發(fā)育和抵御多種非生物脅迫的調(diào)控［15］。在高溫脅迫下，HSF可以提高熱激蛋白、活性氧清除系統(tǒng)、分子伴侶等抵御脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抵御能力。高溫是HSF對非生物脅迫響應(yīng)研究最多的因素。例如，番茄的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因slHSFA2及其調(diào)控的熱激蛋白基因HSP在高溫脅迫下表達(dá)增加。抑制slHSFA2活性后，番茄對高溫的敏感性增強(qiáng)，說明其在高溫脅迫響應(yīng)中起作用［16］。擬南芥的4個(gè)HSFA1基因控制超過65%的熱應(yīng)答基因，并影響植株的耐熱能力；另一類基因HSFA2在正常生長時(shí)表達(dá)很少，但在高溫脅迫下表達(dá)明顯增多，并調(diào)控多個(gè)逆境脅迫的下游基因，具有信號(hào)放大功能［17-18］。

不結(jié)球白菜耐熱性不同的品種應(yīng)答高溫脅迫的機(jī)制還不清楚。本研究對不結(jié)球白菜耐熱性不同的品種幼苗連續(xù)高溫脅迫處理0、3、6、9、12 d，分別測定其膜脂過氧化相關(guān)酶活性，以及葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量，并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取6個(gè)HSF基因和6個(gè)HSP基因，設(shè)計(jì)它們用于熒光定量PCR的引物序列，通過測定待測基因在植株中的表達(dá)量，證實(shí)待測基因可能為不結(jié)球白菜在高溫脅迫條件下保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用的基因。本研究的結(jié)果可為今后深入研究高溫脅迫下不結(jié)球白菜耐熱機(jī)制及培育耐高溫不結(jié)球白菜品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃為本研究的試驗(yàn)材料。矮腳黃的種子通過網(wǎng)絡(luò)途徑購買，SHI的種子為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所惠贈(zèng)。

1.2 高溫脅迫試驗(yàn)

取長勢一致且生長良好的幼苗于光照培養(yǎng)箱（SPX-350，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）中進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)，晝—夜溫度設(shè)定為38 ℃—25 ℃，相對濕度50%，光周期為12 h—12 h（晝—夜），光照度 12 000 lx。分別于高溫脅迫處理0、3、6、9、12 d時(shí)取樣，測定各項(xiàng)生理指標(biāo)，同時(shí)于高溫脅迫處理0、6、24 h時(shí)取樣，放置-80 ℃冰箱保存材料，用于后續(xù)的熒光定量PCR試驗(yàn)。

1.3 生理指標(biāo)測定

采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑染色法測定可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量；采用乙醇（95%）浸提法測定光合色素含量。生理指標(biāo)測定方法均參照李合生的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［19］。所有指標(biāo)的測定均進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 熒光定量測定

1.4.1 獲取待測定基因的PCR引物序列

從實(shí)驗(yàn)室已有的不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出6個(gè)HSF基因和6個(gè)HSP基因，采用Primer 3.0在線軟件設(shè)計(jì)對應(yīng)的引物（表1）。

1.4.2 不結(jié)球白菜熒光定量試驗(yàn)

采用改良CTAB法提取高溫脅迫處理不同時(shí)間不結(jié)球白菜幼苗的RNA。使用 NovoScriptPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix （gDBA Purge） 方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用熒光定量試劑盒［Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus （Cat. No.：E096）］進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量［20］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和顯著性分析使用Microsoft office 2016和SPSS 19.0軟件，利用Graphpad prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對不結(jié)球白菜光合色素的影響

由圖1可知，SHI的葉綠素含量先降低后升高，而矮腳黃的葉綠素含量則先降低后升高再降低。其中矮腳黃在高溫脅迫處理6 d后達(dá)到最大值，為1.14 mg/L，而SHI在高溫脅迫處理12 d后達(dá)到最大值，為1.58 mg/L，較對照組顯著提高20.61% （P<0.05）?？傮w來看，相較于熱敏品種矮腳黃，耐熱品種SHI的葉綠素含量更高一些。 SHI和矮腳黃的類胡蘿卜素含量總體變化趨勢一致，都是先降低后升高再降低，但是SHI在總體上基本處于比較穩(wěn)定的趨勢，而矮腳黃下降幅度較大，在高溫脅迫3 d時(shí)含量最低，為0.12 mg/L，與對照組相比下降了 0.09 mg/L，降低幅度高達(dá)42.86%，與對照組具有顯著差異 （P<0.05）。

2.2 高溫脅迫對不結(jié)球白菜可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量的影響

由圖2可知，矮腳黃可溶性糖含量呈先下降后上升再下降的趨勢，SHI呈先降后升之后再降再升，整體趨勢呈“W”形。其中矮腳黃在高溫脅迫處理 9 d 時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最大值。SHI高溫脅迫處理前的可溶性糖含量最高，而在高溫脅迫處理3 d時(shí)下降幅度較大，含量為2.11 mg/g，與對照組相比顯著下降了63.99%（P<0.05）；但在脅迫12 d其含量比3 d時(shí)顯著上升了1.59 mg/g。矮腳黃可溶性蛋白含量先下降后上升再下降再上升，整體趨勢呈“W”形，而SHI先上升后下降再上升。矮腳黃在高溫脅迫處理前的可溶性蛋白含量最高，在高溫脅迫3 d時(shí)就大幅度下降，下降了36.02 mg/g；而SHI在高溫脅迫處理3 d時(shí)達(dá)到最大值，在高溫脅迫處理 9 d 時(shí)驟降，為 11.69 mg/g，與對照組相比，顯著下降72.76% （P<0.05），但在處理12 d時(shí)其含量顯著上升，為52.91 mg/g，與處理9 d時(shí)具有顯著差異 （P<0.05）。2個(gè)品種脯氨酸含量均隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但是SHI的變化趨勢相較于矮腳黃更為平緩，矮腳黃在高溫脅迫6 d時(shí)含量劇增，含量高達(dá)99.28 μg/g，是對照組的9.33倍，與對照組相比顯著增加了 88.64 μg/g （P<0.05）。

2.3 高溫脅迫對不結(jié)球白菜抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，熱敏品種矮腳黃的POD活性隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加而不斷升高，高溫脅迫處理12 d時(shí)高達(dá)2 100.00 U/（g·min），是對照組活性

的10.00倍，與對照組具有顯著性差異 （P<0.05），而耐熱品種SHI的POD活性先降低后升高再降低再升高，總體趨于平緩，高溫脅迫處理12 d的POD活性與對照組差異不顯著。2個(gè)品種的SOD活性隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加均先升高后下降再有一定程度的上升，矮腳黃在高溫脅迫處理6 d時(shí)SOD活性顯著下降，為166.67 U/g，與高溫脅迫處理3 d時(shí)的活性相比顯著下降52.10% （P<0.05）；而SHI在高溫脅迫處理9 d時(shí)SOD活性下降最明顯，與高溫脅迫處理6 d相比下降了33.88%。在高溫脅迫處理12 d時(shí)2個(gè)品種的SOD活性與對照組均具有顯著性差異 （P<0.05）。

2.4 高溫脅迫對不結(jié)球白菜HSP基因表達(dá)量的影響

本研究通過熒光定量PCR法得到了不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理不同時(shí)間的HSP基因家族多個(gè)基因（包括HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2、HSP23.5、HSP21和HSP17.4基因）的表達(dá)變化。由圖4可以看出，HSP57-1和HSP17.3基因在SHI中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢，表達(dá)量在高溫脅迫處理6 h達(dá)到峰值，且2個(gè)基因在SHI品種中的表達(dá)量均高于矮腳黃。總體上與矮腳黃相比，HSP57-1基因在SHI中的相對表達(dá)量均較高，且在高溫脅迫 6 h 相對表達(dá)量上調(diào)趨勢更明顯，較對照組上調(diào)了258.00%，6 h的表達(dá)量是對照組的3.58倍；而在矮腳黃中，高溫脅迫6 h的表達(dá)量相較對照組上調(diào)了182.00%，與對照組具有顯著差異 （P<0.05）。HSP17.3基因在SHI中，高溫脅迫6 h的相對表達(dá)量較對照組大幅度上升，是對照組的17.33倍，且不同脅迫時(shí)間的表達(dá)量之間均具有顯著性差異 （P<0.05）；而在矮腳黃中，隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加，該基因呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢，但總體趨于平緩，不同高溫脅迫處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量之間均沒有顯著差異。

HSP57-2基因和HSP23.5基因在2個(gè)品種中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加均持續(xù)上調(diào)表達(dá)，在 24 h 高溫脅迫處理時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。HSP57-2基因在SHI中，高溫脅迫24 h的相對表達(dá)量與對照組相比顯著上調(diào)（P<0.05），是對照組的9.50倍；而在矮腳黃中，該基因的相對表達(dá)量隨著高溫脅迫時(shí)間延長持續(xù)上調(diào)，在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值，是對照組的3.13倍，且與對照組具有顯著差異 （P<0.05）?？傮w上，HSP57-2基因在SHI品種中的相對表達(dá)量更高一些。HSP23.5基因在SHI品種中，高溫脅迫處理24 h達(dá)最大值， 是對照組的7.93

倍，且具有顯著差異（P<0.05）；該基因在矮腳黃品種中，高溫脅迫處理24 h達(dá)最大值，是對照組的9.04倍，具有顯著差異 （P<0.05），HSP23.5基因在矮腳黃品種中的相對表達(dá)量比在SHI中更高一些。

HSP21基因在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在高溫脅迫24 h達(dá)到最大值，是對照組的7.01倍，且與對照組具有顯著差異 （P<0.05），但與高溫脅迫6 h不具有顯著差異；在矮腳黃中表達(dá)趨勢呈先上升后下降的趨勢，在高溫脅迫6 h顯著升高，是對照組的27.16倍，與對照組具有顯著差異 （P<0.05）。HSP17.4基因在2個(gè)品種中隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長均先上調(diào)后下調(diào)，在SHI中，峰值出現(xiàn)在高溫脅迫處理6 h，是對照組的56.60倍，與對照組具有顯著差異 （P<0.05）；在矮腳黃中，高溫脅迫處理6 h表達(dá)量升高，是對照組的188.17倍，在不同高溫脅迫處理時(shí)間的表達(dá)量均具有顯著性差異 （P<0.05）。

2.5 高溫脅迫對不結(jié)球白菜HSF基因表達(dá)量的影響

本研究利用熒光定量PCR法得到了不結(jié)球白菜耐熱品種SHI和熱敏品種矮腳黃在高溫脅迫處理不同時(shí)間的HSF基因家族多個(gè)基因（包括HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2、HSFA4a、HSFB1和HSFA8）的表達(dá)變化。由圖5可以看出，HSFA6b-1基因在SHI中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長而持續(xù)上調(diào)，在高溫脅迫處理6 h表達(dá)量升高了46.53%，在24 h達(dá)峰值，是對照組的2.55倍（P<0.05）；在矮腳黃中隨高溫脅迫處理時(shí)間延長呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，且在高溫脅迫6 h達(dá)峰值，相較于對照組升高了97.00%（P<0.05），在高溫脅迫處理24 h略微下降，較脅迫處理6 h下降了31.47%，但2個(gè)時(shí)間的表達(dá)量具有顯著性差異 （P<0.05）。

HSFA3基因在2個(gè)品種中均有表達(dá)，在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在高溫脅迫6 h表達(dá)量顯著升高，是對照組的36.69倍，在高溫脅迫24 h驟降，與對照組沒有顯著差異；在矮腳黃中持續(xù)上調(diào)，在高溫脅迫 6 h 其表達(dá)量是對照組的4.04倍，但與對照組沒有顯著差異，在高溫脅迫24 h達(dá)峰值，是對照組的6.72倍，與對照組表達(dá)量具有顯著性差異 （P<0.05）。但總體上，HSFA3基因在SHI中的表達(dá)量較矮腳黃高。

HSFA6b-2基因在SHI中，高溫脅迫處理 6 h，較對照組表達(dá)量降低了28.71%，在高溫脅迫24 h，該基因的表達(dá)量顯著提高，是對照組的11.78倍，與對照組和高溫脅迫6 h的表達(dá)量均具有顯著差異 （P<0.05）；而在矮腳黃中隨著高溫脅迫處理時(shí)間的增加，該基因的表達(dá)量呈上升趨勢，在高溫脅迫24 h達(dá)峰值，是對照組的4.87倍，高溫脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均具有顯著性差異 （P<0.05）。但總體上，HSFA6b-2基因在SHI中的表達(dá)量較矮腳黃高。

HSFA4a基因在2個(gè)品種中的表達(dá)量隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢。在SHI中，該基因在高溫脅迫處理6 h表達(dá)量下降了61.39%，而在高溫脅迫處理24 h上升到最大值，是對照組表達(dá)量的3.70倍，與對照組具有顯著差異 （P<0.05）；在矮腳黃中，該基因的表達(dá)量相對穩(wěn)定，在高溫脅迫6 h的表達(dá)量與對照組相比下降了6.93%，而在高溫脅迫24 h較對照組的表達(dá)量顯著提高，是對照組的2.10倍，與對照組和高溫脅迫處理6 h的表達(dá)量均具有顯著性差異 （P<0.05）。

HSFB1基因在2個(gè)品種中均隨著高溫脅迫處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢。在SHI中，該基因在高溫脅迫6 h表達(dá)量較對照組顯著升高，是對照組表達(dá)量的12.13倍，而在高溫脅迫24 h又呈下降趨勢，與對照組相比差異不顯著。在矮腳黃中，該基因的表達(dá)量在高溫脅迫6 h顯著升高，是對照組的84.42倍，并且具有顯著性差異 （P<0.05），而在高溫脅迫24 h的表達(dá)量又顯著下降。

HSFA8基因在2個(gè)品種中隨著高溫脅迫時(shí)間的延長表達(dá)量呈現(xiàn)不同的趨勢。該基因在SHI中隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長表達(dá)量先下降后升高，在高溫脅迫6 h，較對照組下降了59.41%，但沒有顯著差異，在高溫脅迫24 h表達(dá)量顯著升高，是對照組的5.61倍，且與對照組具有顯著性差異 （P<0.05）。在矮腳黃中，該基因隨高溫脅迫時(shí)間延長表達(dá)量逐漸上升，在高溫脅迫24 h達(dá)到峰值，表達(dá)量是對照組的7.27倍，該基因的表達(dá)量在不同脅迫時(shí)間之間均有顯著差異 （P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 葉綠素、類胡蘿卜素與植物耐熱性

高溫脅迫會(huì)破壞葉綠體類囊體的理化性質(zhì)及組織，導(dǎo)致葉綠體降解，從而降低細(xì)胞中參與光合反應(yīng)的酶活性，致使葉綠素含量下降，進(jìn)而破壞植物生理機(jī)制的正常運(yùn)行，造成植物體內(nèi)代謝紊亂［21］。葉綠體中類胡蘿卜素的合成常處于動(dòng)態(tài)的變化過程以適應(yīng)環(huán)境的變化，從而保證光合作用正常進(jìn)行［22］。本研究結(jié)果顯示，矮腳黃葉綠素含量隨高溫脅迫時(shí)間延長呈先下降后上升再下降的趨勢，高溫脅迫處理12 d的葉綠素含量與對照相比下降，并具有顯著差異 （P<0.05）。這與徐海等的研究結(jié)果［7］是一致的。但SHI中葉綠素含量隨高溫脅迫處理時(shí)間延長呈先下降后上升的趨勢，高溫脅迫處理12 d與對照相比有少許上升，可能高溫脅迫使葉片蒸騰失水，葉綠素相對含量增加，同時(shí)高溫處理也會(huì)使酶失活或鈍化從而抑制葉綠素分解。2個(gè)品種在高溫脅迫處理初期 （3 d）類胡蘿卜素含量均有一定程度的下降，這可能是由于高溫脅迫導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞，但隨著高溫脅迫處理時(shí)間延長（3～6 d）均上升，可能此時(shí)植物體內(nèi)積累一定量的活性氧加速類胡蘿卜素的合成使其清除高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧，之后又呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于高溫脅迫時(shí)間過長，植物體內(nèi)代謝紊亂，合成類胡蘿卜素過程被抑制。

3.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物耐熱性

可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量的增加有利于逆境條件下細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的維持。高溫脅迫使可溶性糖含量降低，不同高溫處理下可溶性糖含量即使有上升趨勢，但也一直低于對照，且耐熱品種的可溶性糖含量降低幅度小于熱敏性品種［23-26］?？扇苄缘鞍缀扛叩椭苯优c植物耐熱性相關(guān)［27］。有研究表明，耐熱大白菜品種在高溫下可保持較高的蛋白質(zhì)合成速率和較低的蛋白質(zhì)降解速率［28］。脯氨酸是植物中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物在遇到逆境脅迫時(shí)，脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制敏感性降低，導(dǎo)致體內(nèi)脯氨酸含量增加，且增長的百分率大小與耐熱性有關(guān)［29］。本研究結(jié)果表明，高溫脅迫下 矮腳黃可溶性蛋白含量隨高溫脅迫處理時(shí)間的延長先下降后上升再下降再上升，而SHI可溶性蛋白含量在高溫脅迫過程中雖然曾出現(xiàn)下降趨勢，但高溫脅迫處理12 d與對照組相比上升，具有顯著性差異 （P<0.05），說明SHI耐熱能力較高，可保持較高蛋白質(zhì)合成速率和較低蛋白質(zhì)降解速率。2個(gè)品種的脯氨酸含量隨高溫脅迫時(shí)間延長均呈先上升后下降的趨勢，同時(shí)在高溫脅迫處理12 d時(shí)兩者的脯氨酸含量與對照相比均上升，且均具有顯著性差異 （P<0.05）。說明不結(jié)球白菜在遇到高溫脅迫時(shí)，脯氨酸合成酶類對脯氨酸的反饋抑制敏感性降低，脯氨酸合成速率加快，減緩高溫對植物細(xì)胞造成的損傷，以提高植物耐熱性。

3.3 抗氧化系統(tǒng)與植物耐熱性

高溫脅迫下，植物體內(nèi)生成和清除活性氧的平衡被打破，繼而活性氧不斷積累。植物體內(nèi)的POD和SOD等能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，在高溫脅迫下，這些保護(hù)酶類活性的增大有利于緩解過量的ROS對細(xì)胞的損傷。短時(shí)間的高溫脅迫會(huì)提高SOD活性，但隨著脅迫時(shí)間的延長，SOD活性呈下降趨勢，且耐熱性強(qiáng)的品種SOD活性高于耐熱性差的品種［30-31］。在高溫脅迫下大豆耐熱品種的SOD活性高于熱敏感品種，并且其活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)［32］。不同植物應(yīng)對高溫脅迫的生理機(jī)制不同，高溫脅迫下，部分植物出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，使SOD、POD等抗氧化酶活性下降，隨后進(jìn)入適應(yīng)性階段，使抗氧化酶活性上升，但隨著脅迫加強(qiáng)與作用時(shí)間延長，植物受損程度加強(qiáng)，植物細(xì)胞代謝活動(dòng)受阻，抗氧化酶活性下降，植物最終受到氧化損傷，甚至死亡［33-35］。SHI的POD活性隨高溫脅迫時(shí)間延長呈周期性先下降后上升的趨勢，而矮腳黃則隨高溫脅迫時(shí)間延長一直呈上升趨勢，2個(gè)品種高溫脅迫12 d與對照組相比均上升，其中矮腳黃的POD活性上升幅度較大。矮腳黃的POD活性顯著增加可能由于植物要對抗高溫脅迫導(dǎo)致的活性氧增加，防止植物細(xì)胞受到損害。而SHI上升的幅度沒有矮腳黃幅度大，可能由于未進(jìn)行高溫脅迫時(shí)耐熱品種的POD9368AWiSX/tMUG5/LrhQnvm0JeVA4QAChK7U0U5bNMc=活性比熱敏品種高，使細(xì)胞免于熱害損傷的能力更強(qiáng)，所以高溫脅迫時(shí)反應(yīng)不會(huì)非常敏感，只出現(xiàn)一定幅度的升高以此來保護(hù)植物細(xì)胞免受損傷，維持植物幼苗正常生長。耐熱品種先出現(xiàn)POD活性的下降可能因?yàn)檫m應(yīng)熱激，初步形成穩(wěn)態(tài)后，POD需求量減少，導(dǎo)致POD活性出現(xiàn)短暫下降。之后POD活性又出現(xiàn)上升趨勢，可能由于持續(xù)高溫脅迫導(dǎo)致體內(nèi)活性氧含量增加，為了清除活性氧保護(hù)植物細(xì)胞。而熱敏品種POD活性的增幅大于耐熱品種的增幅，可能由于矮腳黃適應(yīng)于高溫環(huán)境后激發(fā)的POD活性一直保持在較高狀態(tài)。2個(gè)品種SOD活性隨高溫脅迫時(shí)間延長均呈先上升后下降再上升的趨勢，且高溫脅迫12 d與對照組相比均上升，SOD活性增大是為了保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的損傷，高溫脅迫初期出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，可能使SOD活性下降，但隨著進(jìn)入適應(yīng)性階段，SOD活性逐步上升。

綜上所述，高溫脅迫下，不結(jié)球白菜SOD、POD活性升高，以抵御高溫脅迫所帶來的活性氧、自由基的威脅，葉綠素含量會(huì)降低，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量會(huì)增加，從而減少高溫脅迫對植物造成的傷害。

3.4 熱激蛋白、熱激轉(zhuǎn)錄因子與植物耐熱性

溫度是影響植物正常生長的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。高溫會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生熱激反應(yīng)，誘導(dǎo)熱激轉(zhuǎn)錄因子和下游的熱激蛋白等相關(guān)基因表達(dá)，這是植物對高溫脅迫的分子響應(yīng)［36-37］。HSP通過參與蛋白質(zhì)的正確折疊實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的保護(hù)，HSF則在這個(gè)過程中起信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵作用。Tian等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PtsHSP17.2基因煙草與野生型植物相比，在熱脅迫下葉綠素含量、相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的變化較小，抗氧化物酶活性和脯氨酸含量在熱脅迫下明顯增強(qiáng)，這證明過表達(dá)的PtsHSP17.2基因提高了煙草對高溫的耐受性［38］。另外，Sedaghatmehr等在擬南芥的熱脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)體金屬蛋白酶TtsH6缺失可以促進(jìn)HSP21蛋白在高溫脅迫后期的積累，并提高植物對高溫的耐受性［39］。RNA-seq分析結(jié)果顯示AsHSP16.5調(diào)控生長素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，如熱休克因子和其他轉(zhuǎn)錄因子等，進(jìn)而增強(qiáng)水稻的耐熱性［40］。雷明娜等的研究表明，AtsHSP17.4還可與過氧化氫酶發(fā)生互作，增強(qiáng)過氧化氫酶的活性［41］。在正常脅迫條件下，組成型AsHSP17的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出對高溫的敏感性增強(qiáng)，葉片葉綠素含量降低和光合作用降低［42］。Poonia等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaHsfA6b的轉(zhuǎn)基因大麥株系表現(xiàn)出較好的耐熱性，TaHsfA6b基因的組成性過表達(dá)上調(diào)了主要熱休克蛋白和其他非生物應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)［43］。Schramm等研究證實(shí)，HsfA3是由DREB2A轉(zhuǎn)錄控制的，對耐熱性的建立很重要［44］。

本研究中，HSP基因家族中的HSP17.3、HSP21以及HSF基因家族中的HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2、HSFA8在耐熱品種SHI中的表達(dá)模式與熱敏品種矮腳黃中存在明顯差異。HSP57-1、HSP17.3、HSP57-2、HSFA6b-1、HSFA3、HSFA6b-2和HSF4a在耐熱品種SHI中的表達(dá)量比熱敏品種矮腳黃相對更高。以上結(jié)果表明，HSF基因家族中的HSFA6b-1、HSFA6b-2、HSFA3、HSFA4a基因以及HSP基因家族中的HSP57-1、HSP57-2、HSP17.3基因可能參與了不結(jié)球白菜對高溫脅迫的響應(yīng)過程。總體來說，HSF基因在2個(gè)品種之間的表達(dá)量差異提示SHI能更快激活下游HSP等抗逆基因的表達(dá)，HSP基因的高表達(dá)則有利于維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性從而提高耐熱性。本研究的結(jié)果為后續(xù)開展不結(jié)球白菜耐高溫的分子機(jī)制以及培育耐熱品種奠定了一定的基礎(chǔ)。

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