基于RAPD的MCID法快速鑒定不結(jié)球白菜品種和遺傳多樣性分析

摘要：不結(jié)球白菜是長江中下游地區(qū)蔬菜周年供應的主栽品種，在種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用過程中，品種鑒定的難度隨著市場上品種的增多而增加。利用基于DNA分子標記的人工繪制品種鑒別圖（manual cultivar identification diagram，MCID）方法對筆者所在單位收集和保存的34份不結(jié)球白菜種質(zhì)材料進行鑒定，同時進行NTSYS-pc遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，利用篩選出的5對RAPD引物擴增出的多態(tài)性譜帶即可構(gòu)建34份不結(jié)球白菜的品種鑒定圖，該圖可以快速地篩選出某品種鑒定所需要的引物及需要參考的特征性譜帶，具有較高的可操作性和實用性。聚類結(jié)果表明，34份不結(jié)球白菜種質(zhì)材料與品種的聚類模式基本符合其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)和遺傳背景。研究結(jié)果可為不結(jié)球白菜品種鑒定和種質(zhì)創(chuàng)新提供了科學依據(jù)，對不結(jié)球白菜種質(zhì)資源的保護、研究及品種的早期鑒定具有重要意義。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜；RAPD；人工繪制植物品種鑒別圖（MCID）；品種鑒定

中圖分類號：S634.303 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0162-07

收稿日期：2023-09-22

基金項目：蘇州市科技局農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目（編號：SNG2020065）；江蘇省省級種質(zhì)資源庫項目（編號：太湖地區(qū)特色作物JS-ZW-K18）；蘇州市級種質(zhì)資源保護項目。

作者簡介：劉照坤（1988—），男，山東鄆城人，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事不結(jié)球白菜種質(zhì)資源保護、新品種選育及栽培技術(shù)研究。E-mail：saaslzk@qq.com。

不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis），別稱小白菜或青菜，為十字花科蕓薹屬一年或二年生蔬菜作物，原產(chǎn)于我國。生產(chǎn)中選用適宜品種的不結(jié)球白菜，可做到四季供應，在蔬菜周年供應中占有十分重要的地位［1］。近年來，不結(jié)球白菜在日本、美國及歐洲一些國家被廣泛引種，已逐漸成為世界性蔬菜。

不結(jié)球白菜栽培歷史悠久，起源于我國長江中下游太湖地區(qū)一帶，在長期自然選擇和人工選擇的演化過程中，形成豐富的遺傳資源［2］。伴隨不結(jié)球白菜栽培面積的迅速擴大，品種日益增多，不結(jié)球白菜優(yōu)良種質(zhì)材料與市售品種在某些植物學特征特性、風味特征上表現(xiàn)出很高的相似性。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法難以有效鑒別品種類型，同時品種命名方式多樣，往往存在同名異種或同種異名現(xiàn)象，這增加了種質(zhì)資源保護和品種鑒定的難度。如市場上常把棵型直立、葉色深綠的不結(jié)球白菜種子作為蘇州青品種進行銷售，但田間表現(xiàn)和品質(zhì)與典型蘇州青相差較大，擾亂了種業(yè)市場，影響不結(jié)球白菜種業(yè)健康發(fā)展。因此，本研究嘗試建立不結(jié)球白菜不同品種材料的快速可靠鑒定技術(shù)體系，對于遺傳資源的研究保護、苗期鑒定具有重要意義。

早期的品種鑒定方法如形態(tài)學鑒定和同工酶鑒定等易受外部環(huán)境、取材部位、人為因素等影響，而DNA分子標記技術(shù)建立在分子水平上，不受外界環(huán)境、作物發(fā)育階段、取樣部位等因素的影響，且檢出的多態(tài)性位點是無限的，鑒定結(jié)果具有高度的可靠性和可重復性，鑒別力強。在眾多分子標記技術(shù)中，基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)以分析程序簡便快捷、周期性短、所需費用低等優(yōu)勢，已被普遍應用于指紋圖譜構(gòu)建、基因快速定位、遺傳多樣性分析和品種分類等研究［3］。林建麗等利用RAPD技術(shù)分析21份白菜類蔬菜種質(zhì)資源的基因組DNA，通過系統(tǒng)聚類分析將其分為2類10組，結(jié)果表明，蕪菁和白菜的親緣關(guān)系較遠［4］。韓建明等對國內(nèi)外不同類型的不結(jié)球白菜的遺傳多樣性進行RAPD分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通白菜的遺傳多樣性最大，不同生態(tài)區(qū)域遺傳多樣性存在差異［5］。但目前關(guān)于利用RAPD分子標記技術(shù)鑒定不結(jié)球白菜種質(zhì)資源與品種的研究較少。

人工繪制品種鑒別圖（manual cultivar identification diagram，MCID）法是近幾年廣泛應用的基于RAPD分子標記技術(shù)的人工繪制品種鑒別示意圖的方法，該方法可根據(jù)PCR擴增后的多態(tài)性條帶，實現(xiàn)品種間的區(qū)分鑒定。不同于利用計算機軟件繪制數(shù)字化指紋圖譜并用統(tǒng)計學軟件進行聚類分析的方法，MCID法更直觀顯現(xiàn)出區(qū)分品種的引物，且工作量小，實用性強。目前，該方法已成功在番茄、冬瓜、蘿卜、青花菜、石榴、枇杷、茶樹、蘋果、梨、桃、葡萄等植物上被應用［6-16］，重復性極好，然而，該技術(shù)在不結(jié)球白菜品種鑒定上仍未見報道。

本研究通過MCID法，對34個不結(jié)球白菜種質(zhì)材料與品種進行鑒定，同時進行遺傳多樣性分析，旨在為不結(jié)球白菜的品種鑒定與種質(zhì)資源利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為不結(jié)球白菜葉片，2022年11月采集于蘇州市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所基地，選取每個品種的幼葉，置于冰盒內(nèi)帶回實驗室用液氮進行速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存待用。34個不結(jié)球白菜品種及來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

利用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取34個不結(jié)球白菜葉片的DNA，利用NanoDropND-2 000 超微量蛋白核酸測定儀（Eppendorf公司，德國）測定DNA樣品濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量。

1.2.2 引物篩選

試驗所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，采用退火溫度梯度法對35個長度為11個堿基的隨機引物進行篩選，從中得到5個引物（表2）。引物篩選條件：進行連續(xù)3次梯度PCR， 選擇譜帶清晰、PCR產(chǎn)物重復出現(xiàn)、質(zhì)量好的譜帶指紋。

1.2.3 PCR擴增與檢測

PCR反應體系（25 μL）：2×PCR Master Mix（上海萊楓生物科技有限公司）12.5 μL，10 μmol/L引物各1.0 μL，90 ng模板DNA，最后用雙蒸水補至25 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，35～45 ℃復性70 s，72 ℃ 延伸2 min，42個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳30～50 min，紫外燈下觀察拍照。

1.2.4 DNA指紋圖譜統(tǒng)計分析以及品種鑒別的人工繪圖法

采用PCR擴增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定的引物對34個不結(jié)球白菜品種進行鑒定，鑒定方法參考Lin等的MCID法［14］。首先統(tǒng)計某一引物PCR擴增的34個品種的電泳圖，在相同的分子量片段處統(tǒng)計特征性譜帶的有無，將該處有擴增譜帶的品種歸類為一組，沒有譜帶的歸類為另一組，根據(jù)該引物其他特征性譜帶進行分組或利用更多的引物逐步進行鑒別；隨后按此方式根據(jù)其他引物擴增的多態(tài)性譜帶對各小組品種進行鑒別，直至所有品種被單獨鑒別開為止；最后，根據(jù)鑒別結(jié)果人工繪制鑒別圖，并在MCID中標記每一步所用的引物及多態(tài)性譜帶大小（bp）。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對選中的每個引物進行3次PCR擴增檢測，選取穩(wěn)定的條帶進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。擴增分離結(jié)果采用0、1統(tǒng)計方法：同一分子量處，有條帶記為1，無條帶記為0，在Excel中統(tǒng)計擴增出的特異性條帶數(shù)目，獲得數(shù)據(jù)庫。利用NTSYS-pc 2.10e軟件得到遺傳相似系數(shù)矩陣，進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類圖，分析品種間的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

提取34個不結(jié)球白菜葉片的DNA，采用核酸蛋白測定儀測定DNA樣品濃度，確定達到試驗要求后，利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，部分結(jié)果見圖1，可以看出，DNA條帶清晰，符合后續(xù)試驗要求。

2.2 不結(jié)球白菜資源品種鑒定

本試驗采用5條引物擴增出的特異條帶成功地將34個不結(jié)球白菜品種逐一區(qū)分。首先依據(jù)引物Y3在350、300、180 bp處擴增出的3條特異條帶的有無（圖2），將34個不結(jié)球白菜分為7組，特異性條帶的有無分別用“+”和“-”表示（圖3）。其中品種5通過180 bp（-）、300 bp（+）、350 bp（+）直接從34個品種中被鑒別出來；品種33通過180 bp（+）、300 bp（-）、350 bp（+）也與其他品種區(qū)別開來；第3組為180 bp（-）、300 bp（-）、350 bp（+），包括品種12、32；第4組為180 bp（+）、300 bp（+）、350 bp（-），包括編號為2、6、7、8、13、15、16、26、28、29的10個不結(jié)球白菜品種；第5組為180 bp（-）、300 bp（+）、350 bp（-），包括品種19、20、21；第6組為180 bp（-）、300 bp（-）、350 bp（-），包括編號為3、9、18、22、23、24、27、30、31、34的10個品種；第7組為180 bp（+）、300 bp（-）、350 bp（-），包括編號為1、4、10、11、14、17、25的7個品種。

繼續(xù)利用更多穩(wěn)定、特異的引物對未區(qū)分開的品種進行鑒定，其中第3組的2個品種可以通過引物Y22在1 000 bp處擴增出的特異片段的有無區(qū)別開來。第4組的10個品種可以利用引物Y15在480、550、720 bp處擴增出的3條特異條帶的有無分為4個亞組，第1亞組為480 bp（-）、550 bp（+）、720 bp（+），包括編號為13、26和29的3個品種，繼續(xù)利用引物Y34在270 bp處擴增出的條帶的有無把品種26鑒定出來，余下2個品種13和29可以通過引物Y22在720 bp處擴增出的條帶的有無區(qū)分開；第2亞組為480 bp（+）、550 bp（+）、720 bp（+），品種2被單獨鑒別出來；第3亞組為480 bp（-）、550 bp（-）、720 bp（+），包括編號8、15、16和28的品種，繼續(xù)用Y34擴增出的270 bp條帶分為2組，其中品種8利用270 bp條帶被單獨區(qū)分開，

其余3個品種無270 bp條帶被分為一組，繼續(xù)用引物Y22擴增出的2個特異條帶可將3個品種區(qū)分開來，通過大小為580、1 000 bp的2個片段條帶的有無將15、16、28號品種分別區(qū)分開；第4亞組為 480 bp（-）、550 bp（-）、720 bp（-），包括品種6、7號，用引物Y34擴增出的270 bp條帶進行區(qū)分，270 bp（+）為6號，無此條帶為7號；同理，第5、6、7組分別用引物Y15、Y22、Y34、Y18等擴增出的特異條帶依次進行鑒別，直至將每個品種都區(qū)分開。最后，根據(jù)每一步獲得的鑒別結(jié)果人工繪制不結(jié)球白菜品種鑒定圖，將每一步用到的引物及所利用的多態(tài)性譜帶的大小同時標記到相應位置上，即MCID圖。

2.3 品種鑒定結(jié)果的驗證

為進一步驗證MCID法鑒定不結(jié)球白菜品種的可靠性及可利用性，隨機從不同組中選取編號為2、5、8、15、16的5個品種進行驗證，從MCID中可以看到，通過引物Y3、Y15、Y34和Y22擴增的特異條帶可以區(qū)別這5個品種。驗證結(jié)果如圖4所示，可以看出，通過Y3引物在180 bp和350 bp處擴增產(chǎn)生的特異條帶的有無可將5號品種與其他4個品種區(qū)別出來，通過Y15引物擴增出的480 bp和550 bp特異條帶的有無將2號品種區(qū)分出來，進一步用Y34引物擴增出的270 bp條帶將8號品種分離出來，最后利用Y22引物擴增出的580 bp條帶將品種15和16區(qū)分開。以上隨機驗證結(jié)果證明，優(yōu)化的RAPD技術(shù)體系具有穩(wěn)定性和可靠性，且MCID具有較高的可行性與實用性。

2.4 聚類分析

對34份不結(jié)球白菜種質(zhì)資源和品種的遺傳多樣性進行分析。由聚類結(jié)果（圖5）可知，各品種間遺傳相似系數(shù)的變化范圍是0.71～1.00。在遺傳距離0.74處，34份不結(jié)球白菜種質(zhì)資源和品種被分為3個類群，類群Ⅰ包括蘇州青、上海青、矮腳黃、耐熱類青菜等23個品種，數(shù)量最多；類群Ⅱ包括蘇州地方特色品種黃葉香青菜和中八葉等4個品種；類群Ⅲ包含黃心烏、五月慢、高梗白、紫色青菜等7個品種，分類結(jié)果大致符合品種自身的特征特性，表明各類群存在一定的親緣關(guān)系，各品種間存在著遺傳多樣性。

早薹蘇州青和四九菜心因其抽薹性早，遺傳關(guān)系較近。蘇州青類型中，A4蘇州青和KT-1蘇州青由收集的蘇州園區(qū)外跨塘地方品種提純復壯而來，蘇青14號是以蘇青2號為母本選育而來的品種，親緣關(guān)系較近，聚類在一起。AX02蘇州青棵型直立，葉柄稍扁，與上海青、黑矮青遺傳距離較近。大葉蘇州青是蘇州青類型中較耐熱的品種，葉色較其他蘇州青稍淺，與上海青、華王青梗菜等聚類在一起，在今后育種中可作為耐熱材料進行目標選育親本。B25蘇州青為蘇州青類型中抽薹稍晚的材料，M14青梗菜與四月慢主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)相似，應為近似品種，親緣關(guān)系較近；但耐抽薹材料春綠3號、五月慢2個農(nóng)藝性狀相似的近緣品種卻被聚合在類群Ⅲ，表明四月慢、五月慢可能來源不同，遺傳關(guān)系稍遠。類群Ⅱ包括蘇州地方特色品種香青菜中的3個類型，結(jié)果表明，黑葉香青菜雖與黃葉香青菜、繡花筋香青菜主要分布區(qū)域不同，但親緣關(guān)系仍相近；中八葉棵型踏地、葉柄扁平、葉面皺縮呈泡狀，聚類結(jié)果顯示與香青菜可能有近緣關(guān)系。類群Ⅲ中高梗白（腌菜）與紫色青菜田間表現(xiàn)均為葉片開展、葉柄細長、粗纖維較多；黃心烏和黑心烏來源于安徽，遺傳關(guān)系較近。

3 討論與結(jié)論

不結(jié)球白菜屬異花授粉植物，在自然環(huán)境下通過天然雜交形成符合各地消費習慣的地方品種群，長江中下游地區(qū)作為我國不結(jié)球白菜重要的起源地和消費地區(qū)，在長期的繁育過程中形成了大量的優(yōu)異地方種質(zhì)資源和品種，品種鑒定是種質(zhì)資源研究、利用的前提。形態(tài)學標記易受生長環(huán)境、田間觀測期以及人為主觀因素影響，難以對近似品種進行有效鑒定，因此，準確實用的植物品種鑒定成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的重要技術(shù)難題。分子標記技術(shù)因不受環(huán)境和人為主觀因素影響， 克服了傳統(tǒng)

鑒定技術(shù)的缺點，而更加準確、可靠。目前，已有隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）［5］、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）［17-18］、簡單重復序列見擴增（inter-simple sequence repeat，ISSR）［19］等多種DNA分子標記技術(shù)應用于不結(jié)球白菜品種間遺傳多樣性分析和品種鑒定，為不結(jié)球白菜的遺傳進化、品種分類提供了重要的分子證據(jù)，但是利用DNA分子標記獲得的指紋圖譜只適用于少數(shù)品種的區(qū)分鑒定，用NTSYS-pc軟件可計算遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)，根據(jù)UPGMA方法可構(gòu)建聚類樹狀圖，但無法轉(zhuǎn)化成鑒定品種的實用工具。本研究利用MCID方法將RAPD分子標記信息轉(zhuǎn)化為可視化、實用性強的圖表，可有效鑒定大量品種資源，且鑒定結(jié)果重復性好。

筆者利用基于RAPD分子標記的MCID法，用5對引物成功將34份已知的不結(jié)球白菜種質(zhì)資源與品種進行鑒定，從MCID中可以明晰不同資源之間進行區(qū)分依據(jù)的引物和特異條帶，表現(xiàn)出較強的實用性。該方法類似圖書館檢索系統(tǒng)，便于查閱鑒定品種所需的相關(guān)信息，查找對應的那對引物擴增的幾個條帶的有無，進而進行針對性的品種鑒定。MCID法提高了引物的利用率，可以用少量的引物將大量的資源與品種區(qū)分開來。在已知品種的情況下，向前回溯查找相應引物，根據(jù)特征性條帶的大小和有無等信息，可清晰完整地展現(xiàn)所有品種如何被區(qū)分開。當有新的不結(jié)球白菜品種或種質(zhì)資源加入時，可直接利用現(xiàn)有的5對引物對該品種進行PCR擴增分析，如發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有34個不結(jié)球白菜有1個或多個差異性譜帶，則可以把該品種補充到該MCID中去；若發(fā)現(xiàn)新的品種難以用5對引物與現(xiàn)有34個品種區(qū)分開，則需要添加新的引物對新添加品種進行區(qū)分鑒定，該方法工作量小、效率高且長期有效，且可以使不結(jié)球白菜MCID品種鑒定系統(tǒng)更加完善，鑒定范圍進一步擴大，成為不結(jié)球白菜品種鑒定的工具之一。

統(tǒng)計5對引物在34個不結(jié)球白菜種質(zhì)資源與品種上擴增的特異性條帶，利用相關(guān)軟件對其進行遺傳多樣性分析，從聚類分析圖中發(fā)現(xiàn)，華王青梗菜與皇冠青梗菜的相似系數(shù)接近于1，難以區(qū)分；蘇州青類型的資源與品種聚類在類群Ⅰ的第1亞組，遺傳關(guān)系較近，且與上海青類型在同一類群；蘇州地方品種香青菜資源和中八葉被分在了類群Ⅱ，但在親緣關(guān)系上，黃葉香青菜與黑葉香青菜的親緣關(guān)系亦較近，繡花筋香青菜次之，中八葉較遠。研究結(jié)果表明，基于RAPD的MCID法可預測不結(jié)球白菜品種間的親緣關(guān)系或遺傳距離，推測結(jié)果符合品種自身特征特性。

本研究利用MCID法對不結(jié)球白菜品種進行區(qū)分鑒定，該方法具有快速、簡便、可重復的優(yōu)點，可推測品種間親緣關(guān)系遠近和遺傳多樣性。研究結(jié)果表明，MCID不僅能為植物品種或材料鑒定提供幫助，還能為種質(zhì)資源研究、品種權(quán)保護、實際生產(chǎn)提供幫助，為不結(jié)球白菜種質(zhì)資源保護、鑒定和利用提供理論依據(jù)。

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