摘要：在百日草（Zinnia elegans）S5頭狀花序形態(tài)和子房細胞學觀察的基礎上，通過不同配比農(nóng)桿菌重懸液、真空處理方法和頭狀花序發(fā)育時期對非組培的花序浸染法進行百日草轉化技術適用性探索。結果表明，S5花序發(fā)育的外部形態(tài)和細胞學觀察發(fā)現(xiàn)小花蕾7及以后發(fā)育時期的心皮處于開放狀態(tài)。農(nóng)桿菌重懸液為1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10%蔗糖 + 0.01 mg/L 6-BA（OD600 nm=0.4）處理蕾3頭狀花序得到0.35%的轉化率。真空斷續(xù)處理有利于轉化率的提高，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理蕾5至蕾7頭狀花序，收獲其中的小花蕾7至蕾9的轉化率可達3.23%～5.00%。

關鍵詞：百日草（Zinnia elegans）； 花序浸染； 遺傳轉化； 真空處理； 花蕾時期

中圖分類號：S681.9 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）10-0081-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.10.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Based on the observation of the head inflorescence morphology and ovary cytology of Zinnia elegans S5， the applicability of the transformation technology of Zinnia elegans was explored by using different ratios of Agrobacterium suspension， vacuum treatment method and non-tissue culture inflorescence infection method during the development of the head inflorescence. The results showed that the external morphology and cyt_{0uHpllynNjZN10rC7cUg/w==}ological observation of S5 inflorescence development found that the carpels of small flower bud 7 and later development stages were in an open state. The bud 3 capitate inflorescence was treated with the Agrobacterium suspension of 1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10% sucrose + 0.01 mg/L 6-BA （OD600 nm=0.4）， the obtp9/Sg4UpYPDyoqbOmp2rsQ==aining 0.35% conversion rate. The vacuum intermittent treatment was beneficial to the improvement of the conversion rate. The better treatment combination was vacuum intermittent 2 min + 30 s treatment bud 5 to bud 7 capitulum. The conversion rate of small bud 7 to bud 9 could reach 3.23%～5.00%.

Key words： Zinnia elegans； inflorescence dipping； genetic transformation； vacuum treatment； bud period

轉基因方法組織培養(yǎng)轉化操作復雜、技術性高，而花序浸染法因避開組織培養(yǎng)的轉化階段，被廣泛應用于擬南芥［1-3］、油菜［4］、白菜［5］等植物中。影響花序浸染轉化的主要因素有花蕾發(fā)育時期、重懸液配方及真空處理等。心皮開放的蕾期是農(nóng)桿菌獲得轉化率較高的關鍵階段，擬南芥只有在浸染6～11 d后開花的花蕾才產(chǎn)生轉化植株［6］，番茄［7］和油菜［4］約 8 d后開花的花蕾分別獲得0.10%和0.50%的轉化率。合適的重懸液也是有效提高花序浸染轉化率的重要因素，重懸液主要成分一般由表面活性劑、糖類、生長調節(jié)素組成，擬南芥［3，8，9］、蘿卜［10］和油菜［11］使用表面活性劑0.05%的Silwet L-77的轉化率最佳，菊科的萬壽菊使用0.02%的Silwet L-77的轉化率最高［12］。擬南芥［8］、甘藍型油菜［11］和芥菜［13］使用蔗糖濃度為5%，番茄［7］和萬壽菊［12］使用蔗糖濃度為15%均獲得較高的轉化率。農(nóng)桿菌重懸液與組織細胞接觸是轉化的重要影響因素，真空處理可以使農(nóng)桿菌重懸液更容易滲透至組織內部，目前此方法主要應用在擬南芥［8］、白菜［14，15］、水稻［16］等植物。

百日草（Zinnia elegans）為菊科百日草屬一年生草本花卉，花色變化豐富且鮮明，在園林綠化中應用廣泛。百日草育種主要通過常規(guī)選育和雜交育種，傳統(tǒng)育種周期長，存在遠緣雜交不親和的限制，目前百日草還未有轉化體系，花序浸染法作為一種非組培的轉化途徑，對縮短育種年限，打破生殖隔離，創(chuàng)造新品種具有重要意義。本試驗以百日草S5為材料，探究不同蕾期時間、重懸液的配比、真空處理時間對花序浸染的影響，以期建立一種可行、簡便的轉化方法，為進一步獲得百日草新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2013年3月至2020年11月在華中農(nóng)業(yè)大學花卉基地與園藝植物國家教育部重點實驗室進行，百日草花序浸染轉化技術研究所用材料為華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院百日草課題組經(jīng)過多年純化選育出的純合平瓣可育系S5。

1.2 方法

1.2.1 百日草花序發(fā)育時期形態(tài)學及細胞學的觀察試驗 選擇3株生長健壯整齊的S5，每天上午10：00觀察和測量記錄第一個頭狀花序橫徑大小，至第一輪小花展開?；?（開花第3天）花序（頭狀花序開花第3天稱為TH3）由外向內剝取1～11輪小花（外圍第一輪小花稱為花3（H3），向內第四輪小花稱為蕾1（L1），1～11輪小花依次稱為H3-H1、L1-L8）制作石蠟切片，觀察子房心皮開合狀態(tài)。

1.2.2 不同配比濃度的農(nóng)桿菌重懸液對轉化效率的影響試驗 選擇處于蕾3頭狀花序（距離開花3 d的頭狀花序稱為TL3）為處理對象，采用試驗設計見表1，收集攜帶質粒pBI121的不同OD600 nm的農(nóng)桿菌菌體，溶解于不同濃度Silwet L-77、蔗糖和OD600 nm配比的重懸液中，分別點滴在TL3頭狀花序上，每種重懸液處理花序各10個，點滴的菌液量以有菌液滴落為宜。遮陰24 h后套袋授粉。分批采收成熟的種子，播種T0代種子，提取單株DNA，以野生植株DNA為陰性對照，以NptⅡ載體農(nóng)桿菌為陽性對照，以引物NptⅡ-Pl（5′-GACAATCGGCTGCTCTGA-3′）、NptⅡ-P2（5′-AACTCCAGCATGAGATCC-3′）和引物GUS-P1（5′-CACACCGATACCATCAGCGATC-3′）、GUS-P2（5′-GTGTGGCTATGGTAGTCGCTAG-3′）分別進行PCR擴增，檢測NptⅡ和GUS基因，并統(tǒng)計T1代的轉化率。

1.2.3 真空處理和花苞蕾期對轉化效率的影響試驗 設置不同頭狀花序蕾期、真空處理方法以及小花蕾期的不同處理組合對轉化效率的影響（表2），每處理5個花苞，重復4次。具體的操作方法：選擇不同蕾期頭狀花序，直徑在8～12 mm，分別按設計進行處理，使用1/2 MS+Silwet L-77（0.03%）+蔗糖（10%）+6-BA（0.01 mg/L）重懸OD600 nm=0.4的攜帶35S-DsRed2載體農(nóng)桿菌菌體，用注射器針頭插入子房所在位置深約1.5 cm，緩慢注入直至頭狀花序四周有重懸液滲出為止。將整株植物放入真空干燥箱，壓強為-25 kPa，分別真空處理1 min和2 min后，恢復常壓30 s，再抽真空處理30 s，記為處理真空斷續(xù)1 min+30 s和2 min+30 s。真空處理后只對設計蕾期L7、L9的小花授粉。待種子成熟按小花蕾期采收種子。播種T0代種子，待第3對真葉完全展開時，在黑暗環(huán)境下進行熒光檢測，以野生植株為對照，記錄有紅色熒光的百日草。使用引物DsRed2-F（5′-ACAGAA CTCGCCGTAAAGAC-3′）、DsRed2-R（5′-CCGTCC TCGAAGTTCATCAC-3′）對DsRed2基因進行PCR擴增，采用同“1.2.2”的PCR檢驗方法驗證轉化植株。

2 結果與分析

2.1 百日草花序發(fā)育時期形態(tài)學及細胞學的觀察結果分析

形態(tài)觀測表明，S5從現(xiàn)蕾到開花約需16 d，該過程中頭狀花序直徑與距離開花天數(shù)存在高度線性關系（R2為0.98），TL7至TL3頭狀花序花蕾直徑為8～12 mm。不同時期的花蕾呈現(xiàn)出相應的形態(tài)特征，除花蕾逐漸變大外，總苞片邊緣顏色變深（圖1A、圖1B），TL7花蕾頂端微開可觀察到內部小花苞片顏色，即透色（圖1C），TL5總苞片半包裹最外輪小花（圖1D），而TL3總苞片就只包裹到基部（圖1E），TH1最外輪小花花瓣完全展開，丫狀柱頭露出（圖1F）?？梢愿鶕?jù)花序的外部形態(tài)特征推測蕾期，用以選擇適宜的浸染花蕾時期。

TH3頭狀花序不同輪次的小花發(fā)育切片細胞學觀察表明，L6及之前時期的小花心皮處于閉合狀態(tài)（圖2A、圖2B），L7及以后時期的小花心皮處于開放狀態(tài)（圖2C）。

2.2 不同配比濃度的農(nóng)桿菌重懸溶液對T1代轉化效率的影響

由表1可知，出現(xiàn)轉化植株的有處理2和處理8，均為表面活性劑0.03% Silwet L-77的重懸液。較適宜的重懸液配比為組合2：1/2 MS + 0.03% Silwet L-77+10%蔗糖+0.01 mg/L 6-BA，OD600 nm=0.4。T1代的PCR分子檢測組合處理2和處理8分別獲得2株和1株轉化植株，轉化率分別為0.35%和0.31%（圖3A、圖3B）。GUS組織染色檢測（圖3C、圖3D、圖3E）發(fā)現(xiàn)陽性株葉片的不同部位呈現(xiàn)藍色斑塊，說明成功轉化GUS基因能在T1代植物體表達。

2.3 真空處理和花苞蕾期對轉化效率的影響

由表2可以看出，不同處理組合種子發(fā)芽率為64.52%～81.82%，出現(xiàn)轉化植株的有4個處理組合，共有6棵轉化植株，其中，轉化率較高的組合（5.00%）為真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花。經(jīng)過PCR鑒定出明亮條帶（圖4）；用手持熒光燈篩選轉化植株，植株呈現(xiàn)紅色熒光，說明成功轉化的T1代植株紅色熒光基因能夠在植物體表達（圖5）。

3 討論

3.1 心皮開放是浸染的關鍵時期

本研究中百日草S5細胞學觀察發(fā)現(xiàn)，處于L6及以前時期的小花心皮處于開放狀態(tài)，處于L7及以后時期的小花心皮處于開放狀態(tài)。同時農(nóng)桿菌侵染TL5至TL7頭狀花序的L7、L9的小花也獲得了較高的轉化率。據(jù)報道，心皮開放的時期隨物種不同而不同，白菜［17］為蕾15及以后時期、擬南芥［6］為蕾6至蕾11、番茄［7］和油菜［4］為蕾8及以后時期的小花。百日草是頭狀花序，從外輪到內輪小花數(shù)量減少，TL5至TL7的L7及以后時期小花位于頭狀花序的外輪，占整個頭狀花序數(shù)量比例高，且種子飽滿。

3.2 重懸液配方會影響轉化率

百日草花序浸染法較適宜的重懸液配方為1/2 MS + Silwet L-77（0.03%）+蔗糖（10%）+ 6-BA（0.01 mg/L）、OD600 nm=0.4，轉化率為0.35%。在Silwet L-77濃度的選擇上，不同物種的耐受性不同，擬南芥［8］適宜的濃度較高，為0.05%，獲得0.6%的轉化率；菊科萬壽菊適宜的濃度較低，為0.02%［12］。農(nóng)桿菌需要糖類物質提供養(yǎng)分和滲透壓［8，13］，本研究蔗糖濃度為10%和15%可獲得轉化植株，與番茄［7］所需10%和萬壽菊［12］所需15%蔗糖濃度相一致。

3.3 真空處理影響轉化率

本研究發(fā)現(xiàn)，TL3花序浸染法不適合真空處理，而TL5至TL7適合真空處理轉化，且真空斷續(xù)2 min+30 s的轉化率高于真空斷續(xù)1 min+30 s，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理TL5至TL7頭狀花序的L7至L9小花，轉化率達3.23%～5.00%，最高轉化率的組合為真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花。出現(xiàn)這種結果的原因可能是TL3頭狀花序時期小花之間空隙較大，與重懸液可以充分接觸，真空處理反而會對小花產(chǎn)生傷害，而TL5至TL7頭狀花序的小花通過真空處理可促進帶農(nóng)桿菌的重懸液更容易滲透至組織內部［1，2，18］，提高轉化效率。小白菜真空處理25 min，轉化率達0.1～0.3%［5，14］，秈稻真空斷續(xù)處理15 min+3 min，轉化率達3.5～6.5%［16］，菜薹花序浸染也使用真空斷續(xù)處理5 min+5 min，轉化率達0.1%［19］，大白菜真空斷續(xù)處理1 min+30 s，轉化率達2.11%［20］。也有真空滲透轉化使番茄幼苗生長全部死亡的報道［7］。

4 小結

百日草花序浸染法是一種成功高效獲得轉化植株的方法，本研究結果表明，重懸液、心皮開放時期、頭狀花序蕾期、真空處理影響花序浸染轉化率，其中1/2 MS + 0.03% Silwet L-77 + 10%蔗糖 + 0.01 mg/L 6-BA、OD600 nm=0.4是適宜的農(nóng)桿菌重懸液配方，L7及以后時期的小花心皮處于開放狀態(tài)，是農(nóng)桿菌侵染的關鍵時期，TL3花序浸染法不適合真空處理，而TL5至TL7適合真空處理轉化，較好的處理組合是真空斷續(xù)2 min+30 s處理TL5至TL7頭狀花序的小花，L7至L9的轉化率可達3.23%～5.00%，其中真空處理2 min+30 s條件下的TL7頭狀花序的L7小花轉化率為5.00%。

參考文獻：

［1］ BECHTOLD N，ELLIS J，PELLETIER G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants［J］.C R Acad Sci Paris，1993，316（10）：1194-1199.

［2］ BECHTOLD N，PELLETIER G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration［J］.Methods in molecular biology，1998，82：259-266.

［3］ CLOUGH S J，BENT A F. Floral dip： A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana［J］.The plant journal，1998，16（6）：735-743.

［4］ HU D，BENT A F，HOU X L，et al. Agrobacterium-mediated vacuum infiltration and floral dip transformation of rapid-cycling Brassica rapa［J］.BMC plant biology，2019，19（1）：246.

［5］ XU H J，WANG X F，ZHAO H，et al. An intensive understanding of vacuum infiltration transformation of pakchoi （Brassica rapa ssp. chinensis）［J］.Plant cell reports，2008，27（8）：1369-1376.

［6］ DESFEUX C，CLOUGH S J，BENT A F. Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method［J］.Plant physiology （Rockville），2000，123（3）：895-904.

［7］ SHARADA M S，KUMARI A，PANDEY A K，et al. Generation of genetically stable transformants by Agrobacterium using tomato floral buds［J］.Plant cell，tissue and organ culture （PCTOC），2017，129（2）：299-312.

［8］ TAGUE B W. Germ-line transformation of Arabidopsis lasiocarpa［J］.Transgenic research，2001，10（3）：259-267.

［9］ MARTINEZ-TRUJILLO M，LIMONES-BRIONES V，CABRERA-PONCE J L，et al. Improving transformation efficiency of Arabidopsis thaliana by modifying the floral dip method［J］.Plant molecular biology reporter，2004，22（1）：63-70.

［10］ CURTIS I S，NAM H G. Transgenic radish （Raphanus sativus L. longipinnatus Bailey）by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency［J］.Transgenic research，2001，10（4）：363-371.

［11］ VERMA S S，CHINNUSAMY V，BANSA K C. A simplified floral dip method for transformation of Brassica napus and B.carinata［J］.Journal of plant biochemistry and biotechnology，2008，17：197-200.

［12］ CHENG X，HUANG C L，ZHANG X H，et al. Establishment of transgenic marigold using the floral dip method［J］.Acta physiologiae plantarum，2019，41：147.

［13］ 代法國，胡宗利，陳國平，等.一種獲得轉基因芥菜的簡便方法［J］.生命科學研究，2011，15（1）：19-23.

［14］ QING C M，F(xiàn)AN L，LEI Y，et al. Transformation of pakchoi （Brassica rapa L. ssp.chinensis） by Agrobacterium infiltration［J］.Mol Breed，2000，6（1）：67-72.

［15］ 徐恒戩.利用真空滲入法獲得轉基因抗蟲白菜及其轉化機理的研究［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2004.

［16］ LIN J，ZHOU B，YANG Y，et al. Piercing and vacuum infiltration of the mature embryo： NnJRr8zVXG5Bd/wmyJ1HSg==A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of indica rice［J］.Plant cell reports，2009， 28（7）：1065-1074.

［17］ 韓 笑.白菜浸花法轉基因技術研究［D］.山東濟寧：曲阜師范大學，2012.

［18］ 付紹紅.floral-dip法轉化甘藍型油菜有關影響因素研究［D］.成都：四川農(nóng)業(yè)大學，2005.

［19］ 宗 梅，韓 碩，郭 寧，等.利用真空滲透和CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得非轉基因菜薹突變體［J］.生物技術通報，2022，38（10）：159-163.

［20］ 張廣輝，鞏振輝，薛萬新，等.大白菜和油菜真空滲入遺傳轉化法初報［J］.西北農(nóng)業(yè)大學學報，1998（4）：6-9.

收稿日期：2023-07-26

基金項目：國家自然科學基金項目（3197180437）

作者簡介：潘雨荷（1999-），女，河南南陽人，在讀碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種，（電話）18613773226（電子信箱）3207938742@qq.com；通信作者，葉要妹，教授，博士，主要從事園林植物栽培與育種研究，（電子信箱）yymld@mail.hzau.edu.cn。