月季水通道蛋白基因家族的生物信息學(xué)特征及干旱下的表達(dá)分析

摘要：水通道蛋白（AQP）是高度多樣化的內(nèi)在蛋白家族，可運(yùn)輸水和中性溶質(zhì)，在植物發(fā)育和脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。然而關(guān)于月季（Rosa chinensis）AQP的組成和生物學(xué)功能仍知之甚少，以月季品種坦尼克為試驗(yàn)材料，基于全基因組分析，對(duì)月季AQP家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，并分析相關(guān)基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，共鑒定出61個(gè)AQP編碼基因的非冗余成員，其中57個(gè)可定位于9條染色體上。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，月季AQP（RsAQP）分為4個(gè)亞家族，包括21個(gè)質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIP）、19個(gè)液泡膜內(nèi)在蛋白（TIP）、16個(gè)NOD樣內(nèi)在蛋白（NIP）和5個(gè)小堿性內(nèi)在蛋白（SIP），所有RsAQP都包含共同的高度保守基序、跨膜區(qū)域及多種順式作用元件，表明RsAQP具有潛在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。RNA-Seq表達(dá)模式分析結(jié)果表明，PIP1表達(dá)水平普遍高于其他亞群；qRT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，7個(gè)PIP1亞群成員中，6個(gè)基因（RsPIP1-1、RsPIP1-2、RsPIP1-3、RsPIP1-4、RsPIP1-6、RsPIP1-7）在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，以RsPIP1-6表達(dá)水平最高、契合度最高，推測(cè)RsPIP1-6可能是月季耐旱的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：月季；水通道蛋白；質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIP）；全基因組；干旱脅迫

中圖分類號(hào)：S685.120.1""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0015-08

水資源短缺造成的干旱脅迫是影響全球植物生長(zhǎng)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素^［1］。全球約25%耕地面積處于半干旱或嚴(yán)重干旱中，且由于人類行為與植被減少導(dǎo)致的氣候變暖及荒漠化加劇，這一問題正在不斷惡化^［2］。干旱脅迫會(huì)損傷質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致植物體內(nèi)滲透壓失衡、水分流失加速，從而影響植物養(yǎng)分?jǐn)z取、光合進(jìn)程及同化物分配等^［3］。滲透壓和徑向水傳輸主要取決于水通道蛋白（AQP）的活性，AQP屬于古老的主要內(nèi)在蛋白（MIP）超家族，廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)^［4］。越來越多的證據(jù)表明，AQP可有效運(yùn)輸水分和其他小分子底物，當(dāng)植物處于非生物脅迫環(huán)境時(shí)，尤其是干旱脅迫時(shí)，AQP會(huì)快速響應(yīng)并調(diào)節(jié)水分的跨膜運(yùn)輸，且可通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)、減少活性氧積累以有效降低膜損傷^［5］；此外，AQP在種子萌發(fā)、組織擴(kuò)張、生殖生長(zhǎng)、果實(shí)成熟、水分轉(zhuǎn)移和維持植物細(xì)胞水分穩(wěn)態(tài)方面亦發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用^{［4，6］}。

在大多數(shù)植物物種中，AQP由4個(gè)單體組成，每個(gè)單體包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1～TM6）和5個(gè)連接環(huán)（LA～LE），均位于胞內(nèi)或胞外膜的兩側(cè)，通過2個(gè)Asn-Pro-Ala多肽（NPA）基序折疊、連接形成狹窄的通道從而控制水的滲透性，這在水分子跨膜過程中起著至關(guān)重要的作用^［4-6］。AQP根據(jù)基因序列同源性和亞細(xì)胞定位可分為8類，包括液泡膜內(nèi)在蛋白（TIP）、質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIP）、小堿性內(nèi)在蛋白（SIP）、類結(jié)節(jié)26-內(nèi)在蛋白（NIP）、混合內(nèi)在蛋白（HIP）、Glp-F型內(nèi)在蛋白（GIP）、巨型內(nèi)在蛋白（LIP）和未分類內(nèi)在蛋白（XIP）^［7］。其中，PIP是成員數(shù)量最多的亞科，根據(jù)PIP的N端和C端的長(zhǎng)度可分為PIP1和PIP2這2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育亞群，PIP表達(dá)水平受各種生理和環(huán)境壓力因素等復(fù)合調(diào)節(jié)，包括植物激素和非生物脅迫，尤其是在干旱和鹽脅迫環(huán)境中^［8］。

月季（Rosa chinensis）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）多年生植物，其可連續(xù)開花，是全世界栽培歷史最為悠久、種植面積最大的花卉種類之一^［9］；月季花香濃郁、花型洋溢、色澤高雅，目前切花月季生產(chǎn)已占國內(nèi)花卉生產(chǎn)的80%以上^［10］。此外，月季可作為植物源香氣和精油的重要花卉，兼具觀賞價(jià)值和工業(yè)價(jià)值，已被廣泛應(yīng)用于園林、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。月季花朵蒸騰表面積較大，對(duì)干旱反應(yīng)敏感，在月季種植、運(yùn)輸及切花過程中易受到干旱因素影響，當(dāng)處于干旱脅迫時(shí)植株枯萎迅速，色澤暗淡^［11］。然而，目前關(guān)于月季AQP基因家族的報(bào)道較少，且AQP如何響應(yīng)干旱的內(nèi)在生理機(jī)制亦不清楚。本研究對(duì)月季AQP基因家族進(jìn)行全基因組分析，系統(tǒng)表征其進(jìn)化關(guān)系、結(jié)構(gòu)特征、啟動(dòng)子分析和染色體分布，檢測(cè)不同組織中RsAQP的表達(dá)量，研究結(jié)果將有助于揭示月季的耐旱機(jī)制以及為未來月季的基因工程改良提供理論支持。

1"材料與方法

1.1"試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法

試驗(yàn)2023年3—7月于廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝培養(yǎng)室中進(jìn)行。供試月季（Rosa chinensis）品種為坦尼克，來自江蘇省月季種質(zhì)創(chuàng)新與栽培中心。

1.2"月季AQP基因的全基因組分析

1.2.1"月季AQP基因家族成員的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

從TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）和薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.rosaceae.org）分別獲取擬南芥（Arabidopsis thaliana，簡(jiǎn)稱At）和月季（Rosa chinensis，簡(jiǎn)稱Rs）的基因組序列和基因注釋文件。采用Pfam（http：//pfam.sanger.ac.uk/）篩選包含Asn-Pro-Ala（NPA）域的候選AQP，采用遞次命名法，將其命名為RsAQP，并將RsAQP結(jié)構(gòu)域信息保存為隱藏馬爾可夫格式（HMM，PF00230），然后使用HMMER（v3.03）對(duì)HMM進(jìn)行搜索和檢索序列，并采用SMART4（http：//smart.embl.de/）和Batch-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）重復(fù)篩選以去除AQP保守結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白質(zhì)。隨后，采用Clustal W6進(jìn)行多序列比對(duì)，并導(dǎo)入所有AtAQP、RsAQP序列，采用鄰接法生成系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值^［12］。

1.2.2"RsAQP染色體定位、蛋白質(zhì)性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子元件分析

采用Mapinspect軟件繪制RsAQP家族成員的遺傳圖譜（http：//www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html）。采用基因結(jié)構(gòu)在線平臺(tái)（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析RsAQP基因家族成員的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和外顯子特征。采用ExPASy平臺(tái)工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析RsAQP蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)（aa）、分子量（MW）、理論等電點(diǎn)（pI）等?；赑lantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/plantcare/html/）中獲得了每個(gè)RsAQP中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游總共1 500 bp的基因組DNA序列^［13］，用于分析RsAQP啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。利用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對(duì)保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3"RsAQP基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取與表達(dá)分析

利用RsAQP家族成員的氨基酸序列在月季參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（https：//lipmbrowsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/）進(jìn)行Blast比對(duì)，下載獲得的默認(rèn)格式文件轉(zhuǎn)換為fastq格式，再將fastq通過Trim Galore軟件（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/）進(jìn)行質(zhì)控。質(zhì)控后的clean reads序列采用RNA-Seq數(shù)據(jù)量化軟件Kallisto（0.43.1版本）進(jìn)行定量，定量獲取的數(shù)值以TPM表示，通過TBtool（shttps：//github.com/CJ-Chen/TBtools）進(jìn)行熱圖可視化^［14］。

1.4"月季相關(guān)RsAQP的篩選及qRT-PCR分析

1.4.1"供試月季植物的培養(yǎng)方法

將2月齡的月季植株在人工氣候室中進(jìn)行土壤培養(yǎng)，按照50%土壤含水率進(jìn)行干旱脅迫處理（DS），對(duì)照（CK）土壤含水率則為80%。取樣時(shí)采用PBS緩沖液進(jìn)行快速?zèng)_洗并液氮速凍保存于-80 ℃環(huán)境以用于植株RNA提取。

1.4.2"月季RNA的提取及qRT-PCR分析

將月季樣品（250 mg）采用液氮快速研磨，按照RNAprep Pure Plant Kit提取試劑盒（NO.RN0902）相關(guān)說明書提取樣品總RNA，采用PrimeScrip^TM"RT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（NO.RR047A）將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，將cDNA采用無菌水稀釋100倍為cDNA的第一鏈，以作為后續(xù)qRT-PCR熒光定量的模板。從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中選取6個(gè)基因，采用Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），以GAPDH作為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照由玉婉等所述^［15］，使用賽默飛QuantStudi^TM"6 Flex熒光定量PCR儀的CFX Connect實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。用2^-ΔΔCT法計(jì)算基因的表達(dá)量。

1.5"數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS 14.0進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，相關(guān)圖形采用相應(yīng)在線繪圖工具、R軟件及Origin 10進(jìn)行繪制。

2"結(jié)果與分析

2.1"RsAQP家族成員鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了系統(tǒng)地揭示月季水通道蛋白（RsAQP）與擬南芥水通道蛋白（AtAQP）成員的進(jìn)化關(guān)系，基于氨基酸序列的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。通過對(duì)RsAQP和AtAQP之間蛋白質(zhì)序列的同源比較分析，61個(gè)RsAQP根據(jù)它們與AtAQP的分組分為4個(gè)不同的亞家族，包括質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（RsPIP）、泡膜內(nèi)在蛋白（RsTIP）、類結(jié)節(jié)26-內(nèi)在蛋白（RsNIP）和小堿性內(nèi)在蛋白（RsSIP）。其中，RsPIP是數(shù)量最多的亞家族，包含21個(gè)成員，其可進(jìn)一步分為2個(gè)亞群（RsPIP1、RsPIP2），包含7個(gè)RsPIP1成員和14個(gè)RsPIP2成員。此外，有19個(gè)成員歸屬于RsTIP，5個(gè)成員歸屬于RsSIP，RsTIP、RsSIP分別有5個(gè)和2個(gè)亞群。

2.2"RsAQP家族的理化性質(zhì)特征分析

根據(jù)TAIR數(shù)據(jù)庫中模式植物擬南芥的分類，并采用遞次命名法進(jìn)行相應(yīng)命名，從月季基因組數(shù)據(jù)庫中識(shí)別出61個(gè)非冗余和完整的水通道蛋白成員（表2）?；贓xPASy分析可知，PIP具有較長(zhǎng)的蛋白長(zhǎng)度、較大的分子量和較高的不穩(wěn)定指數(shù)（IC），SIP具有較高的等電點(diǎn)（pI），TIP在蛋白長(zhǎng)度、分子量、pI、IC及親水指數(shù)上波動(dòng)較大。整體而言，RsAQP的蛋白長(zhǎng)度為122～553個(gè)氨基酸，RsAQP成員分子量范圍為12.757～61.491 ku，理論等電點(diǎn)范圍為4.96～10.07；此外，IC為 16.56～44.72，大部分成員（58個(gè)成員，占比95.08%）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（IC＜40.00）。此外，親水指數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，除RsNIP6-3外的所有蛋白都具有疏水性質(zhì)。

2.3"RsAQP的基因結(jié)構(gòu)和保守域分析

61個(gè)RsAQP的外顯子-內(nèi)含子特征分析結(jié)果表明，內(nèi)含子數(shù)量范圍為0～7，同一亞家族大多具有相似的基因結(jié)構(gòu)（圖2-A、圖2-B）。具體而言，RsSIP亞家族包含2個(gè)內(nèi)含子；除了RsPIP1-7和RsPIP2-10分別有2個(gè)和1個(gè)內(nèi)含子外，其他RsPIP亞家族均具有3個(gè)內(nèi)含子；類似地，除了RsTIP1-5、RsTIP1-6、RsTIP2-6沒有內(nèi)含子外，其他RsTIP均具有2個(gè)或1個(gè)內(nèi)含子。而RsNIP亞家族結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，內(nèi)含子數(shù)量從1個(gè)到7個(gè)不等。

從61個(gè)RsAQP中共生成了15個(gè)保守基序（圖2-C），并且同一亞科中的基序組成高度相似。其中，基序1、4存在于絕大多數(shù)（58個(gè)）RsAQP成員中，表明這些基序是RsAQP的基本基序。然而，一些基序存在特異性，只在特定的亞科中。例如，基序7、10和15僅存在于RsPIP中，而基序9、12分別獨(dú)特地分布在RsNIP、RsTIP中，這些特殊基序可能是RsPIP、RsTIP和RsNIP的特征域。此外，一些基序涵蓋在不同的亞科中；例如，可以在RsPIP、RsTIP和RsNIP中發(fā)現(xiàn)基序2、5和6，而基序3和8都分布在RsPIP和RsTIP中。

2.4"RsAQP啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)分析

由圖3可知，各種順式作用元件，包括應(yīng)激、發(fā)育和激素反應(yīng)元件，廣泛分布在RsAQP基因的啟動(dòng)子區(qū)域。通過計(jì)算不同順式元件的數(shù)量，結(jié)果表明光響應(yīng)元件在RsAQP啟動(dòng)子中出現(xiàn)頻率最高，其次是MeJA響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件。特別地，防御和應(yīng)激反應(yīng)元件分布在所有RsAQP亞家族中，傷口反應(yīng)元件僅存在于RsPIP和RsTIP亞家族的啟動(dòng)子中，而參與種子特異性調(diào)節(jié)的元件僅存在于RsSIP中，RsNIP和RsSIP中沒有任何參與細(xì)胞周期調(diào)控的元件。這些結(jié)果表明不同類型的RsAQP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在差異，反映了RsAQP功能的多樣性。此外，在RsAQP啟動(dòng)子中也檢測(cè)到其他參與防御和應(yīng)激的順式元件，例如MBS（CAACTG）、ABRE（ACGTG）和ABA（TAACCA），這表明這些水通道蛋白成員可能受到月季多種內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，包括干旱和脫落酸，這需要在進(jìn)一步的研究中通過試驗(yàn)具體驗(yàn)證。

2.5"RsAQP的染色體定位分析

由圖4可知，通過MapChart分析發(fā)現(xiàn)，除RsSIP2-3、RsNIP4-2、RsNIP4-3及RsNIP4-4外，共有57個(gè)RsAQP（占比93.44%）成功定位在月季的9條染色體上，且每條染色體上至少分布了2個(gè)成員。有趣的是，一些RsAQP呈集簇狀分布于某些染色體區(qū)域，尤其是2號(hào)、4號(hào)和6號(hào)染色體上。其中，6號(hào)染色體擁有最多的RsAQP基因，為12個(gè)，其次是4號(hào)（11個(gè)）和5號(hào)（11個(gè)）染色體，發(fā)現(xiàn)的RsAQP基因數(shù)量最少是在7號(hào)和8號(hào)染色體上，各為2個(gè)。

2.6"RsAQP的時(shí)空表達(dá)模式分析

由圖5可知，61個(gè)RsAQP基因在不同組織（根、莖、葉）和不同時(shí)間（0、24 h）的Heatmap表達(dá)譜中，總體而言，RsPIP和RsTIP在所有組織中的表達(dá)水平整體高于RsNIP、RsSIP。對(duì)于RsTIP亞家族，RsTIP1-1、RsTIP1-2、RsTIP1-3、RsTIP1-4、RsTIP2-2及RsTIP2-3在根、莖、葉中均表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，而其他RsTIP成員的表達(dá)水平均整體較低。大多數(shù)RsPIP在月季的不同組織中表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄水平，尤其是RsPIP1亞群。此外，RsPIP2-1、RsPIP2-2、RsPIP2-3、RsPIP2-4及RsPIP2-5在0 h具有較高的表達(dá)水平，且均以根系表達(dá)水平高于其他組織，而在24 h時(shí)上述基因在不同組織中的表達(dá)趨勢(shì)不變，但表達(dá)水平整體降低。

2.7"基于RT-qPCR分析的月季根系PIP1亞群基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)

根據(jù)月季RNA-Seq數(shù)據(jù)可知，根系組織中的表達(dá)水平整體較高，且PIP1亞群具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，特別是7個(gè)RsPIP1基因（RsPIP1-1、RsPIP1-2、RsPIP1-3、RsPIP1-4、RsPIP1-5、RsPIP1-6、RsPIP1-7），通過qRT-PCR進(jìn)一步確定它們?cè)谠录卷憫?yīng)干旱脅迫中的表達(dá)模式。由圖6可知，除RsPIP1-5在干旱處理（DS）和對(duì)照（CK）中的表達(dá)水平無明顯差異外，其他6個(gè)基因的表達(dá)水平均整體以DSgt;CK，尤其是RsPIP1-6基因。RsPIP1-6基因在CK條件下不同時(shí)間點(diǎn)（0、6、12、24 h）表達(dá)水平均較低；而在DS條件下，與 0 h 相比，其他時(shí)間（6、12、24 h）下RsPIP1-6表達(dá)量顯著提高。

3"討論

水通道蛋白（AQP）作為一類多功能蛋白，參與維持植物細(xì)胞水分穩(wěn)態(tài)及其他生理活動(dòng)，如脅迫反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)元素分配、重金屬區(qū)室化、氣孔運(yùn)動(dòng)等，尤其是非生物脅迫耐受性^［4，16］。AQP基因的生物信息探索是未來研究基因功能分析的重要起點(diǎn)，目前通過基因組測(cè)序已經(jīng)在許多植物中鑒定出AQP，甘薯（Ipomoea batatas）AQP基因家族有46個(gè)成員^［17］、蘋果樹（Malus domestica）42個(gè)^［18］、龍眼樹（Dimocarpus longan）35個(gè)^［19］、海刀豆（Canavalia rosea）37個(gè)^［12］。然而，關(guān)于月季AQP家族基因組成和分子特征還尚不清楚。本研究中，通過對(duì)月季AQP編碼基因進(jìn)行全基因組分析，鑒定出61個(gè)AQP基因。一般而言，擁有更多數(shù)量的AQP表明其具有更高的進(jìn)化和更細(xì)致的功能劃分^［20］。根據(jù)與擬南芥水通道蛋白（AtAQP）進(jìn)行同源性對(duì)比，RsAQP家族可分為4個(gè)亞家族（PIP、TIP、NIP和SIP）。然而在月季中未發(fā)現(xiàn)AtNIP3-1的相似同源基因，這可能是月季在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中導(dǎo)致RsNIP3發(fā)生丟失的緣故。

本研究中，在月季中PIP亞科的基因數(shù)量顯著高于其他亞科，這表明PIP具有更復(fù)雜的進(jìn)化過程。從進(jìn)化的角度來看，基因數(shù)量的增加可能是由于基因復(fù)制事件，包括片段和串聯(lián)復(fù)制^［21］。本研究中，RsAQP的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與其相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)和保守基序具有密切關(guān)系，基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明每個(gè)亞科在擬南芥和月季中都表現(xiàn)出相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，即除了RsTIP1-5、RsTIP1-6、RsTIP2-6沒有內(nèi)含子外，其他RsAQP都含有1～7個(gè)內(nèi)含子，這與香石竹（Dianthus caryophyllus）的內(nèi)含子特征^［22］相似。內(nèi)含子特征與基因進(jìn)化有關(guān)，更多和更長(zhǎng)的內(nèi)含子往往存在于高表達(dá)的基因中^［23］，外顯子和內(nèi)含子的增加或丟失可能是染色體重排或融合的結(jié)果，并可能導(dǎo)致多個(gè)基因家族的功能多樣化^［24］。

本研究中，啟動(dòng)子順式元件作用分析結(jié)果表明，RsAQP基因啟動(dòng)子包含響應(yīng)多種激素、應(yīng)激和發(fā)育的順式元件（圖3）。在番茄、擬南芥和海刀豆（Canavalia rosea）中也觀察到類似的結(jié)果^［5］，但仍然存在一定差異，這與植物基因復(fù)制頻率、環(huán)境誘導(dǎo)及功能基因調(diào)控特異性有關(guān)^［20］。本研究中，RsAQP在染色體連鎖群中的簇狀分布呈串聯(lián)重復(fù)，如6號(hào)染色體上的RsPIP2-1、RsPIP2-2、RsPIP2-3和RsPIP2-4，這可能是進(jìn)化過程中發(fā)生基因復(fù)制的結(jié)果。串聯(lián)重復(fù)是自然界生物體中常見的現(xiàn)象，例如蘆筍中富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域同時(shí)具有串聯(lián)基因和跨多條染色體的重復(fù)^［25］。保守基序分析結(jié)果表明，所有RsAQP蛋白都具有典型的Asn-Pro-Ala（NPA）結(jié)構(gòu)域，基序1和4皆分布在4個(gè)亞家族中且高度保守，表明它們是AQP家族的特征域。

AQP基因的表達(dá)受植物中各種脅迫源的調(diào)控，例如干旱、鹽分和寒冷^［26］。本研究中，轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析結(jié)果表明，月季PIP和大多數(shù)TIP基因在不同時(shí)間點(diǎn)及不同組織中均具有較高的表達(dá)水平，尤其是在PIP1亞群中。這與相關(guān)研究結(jié)果趨于一致：非生物脅迫下，在西番蓮（Passiflora edulis）中大多數(shù)PIP亞家族成員與其他植物物種的AQP表現(xiàn)出高度相似性^［27］，即非生物脅迫指示基因往往為PIP、TIP亞家族成員，而生物脅迫往往誘導(dǎo)SIP、NIP亞家族成員發(fā)生上調(diào)表達(dá)^［4］，如擬南芥根系中的AtPIP2在鹽脅迫下顯著下調(diào)表達(dá)^［28］，而水稻OsPIP2在干旱脅迫下發(fā)生上調(diào)表達(dá)^［29］。對(duì)于干旱脅迫而言，根系比其他器官更敏感，因此，本研究基于實(shí)時(shí)熒光定量（qRT-PCR）分析了根系PIP1亞群對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明，6個(gè)來自PIP1亞群的基因（RsPIP1-1、RsPIP1-2、RsPIP1-3、RsPIP1-4、RsPIP1-6、RsPIP1-7）在干旱脅迫下均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，尤其是RsPIP1-6；表明RsPIP1-6在月季響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4"結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從月季（Rosa chinensis）基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出61個(gè)AQP，可分為4個(gè)亞家族，包括21個(gè)質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIP）、19個(gè)液泡膜內(nèi)在蛋白（TIP）、16個(gè)NOD樣內(nèi)在蛋白（NIP）和5個(gè)小堿性內(nèi)在蛋白（SIP），其中除RsSIP2-3、RsNIP4-2、RsNIP4-3及RsNIP4-4外，其他57個(gè)RsAQP呈簇狀分布于9條染色體上?；蚪Y(jié)構(gòu)與保守基序分析結(jié)果表明，所有RsAQP都包含共同的高度保守基序、跨膜區(qū)域；啟動(dòng)子分析結(jié)果表明，RsAQP包含應(yīng)激、發(fā)育和激素反應(yīng)等多種順式作用元件，表明RsAQP具有潛在的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。基于RNA-Seq數(shù)據(jù)表達(dá)模式分析結(jié)果表明，PIP的表達(dá)水平普遍高于TIP、NIP和SIP，尤其表現(xiàn)在PIP1亞群；RT-qPCR分析結(jié)果表明，7個(gè)PIP1亞群基因中，6個(gè)（RsPIP1-1、RsPIP1-2、RsPIP1-3、RsPIP1-4、RsPIP1-6、RsPIP1-7）在干旱脅迫下上調(diào)表達(dá)，以RsPIP1-6表達(dá)水平最高、契合度最佳，表明RsPIP1-6是耐旱的關(guān)鍵候選基因。本研究結(jié)果為揭示RsAQP的進(jìn)化和功能提供了理論依據(jù)，也為月季的基因工程育種提供了潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］王"彬，陳敏氡，林"亮，等. 植物干旱脅迫的信號(hào)通路及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2020，40（10）：1792-1806.

［2］于曉晶，張麗霞，周天軍，等. 干旱事件對(duì)全球干旱區(qū)生態(tài)系統(tǒng)脅迫作用的長(zhǎng)期變化［J］. 中國科學(xué)（地球科學(xué)），2023，53（1）：151-166.

［3］王"建，趙"單. 叢枝菌根真菌與綠色木霉對(duì)干旱脅迫下蘋果樹苗生長(zhǎng)、生理特征及水分利用的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（4）：164-170.

［4］Wang Y，Zhao Z J，Liu F，et al. Versatile roles of aquaporins in plant growth and development［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（24）：9485.

［5］Ren J H，Yang X X，Ma C Y，et al. Meta-analysis of the effect of the overexpression of aquaporin family genes on the drought stress response［J］. Plant Biotechnology Reports，2021，15（2）：139-150.

［6］包珠拉太，高"麗，王鎖民. 植物水通道蛋白及其生理功能［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（7）：1171-1178.

［7］Xu Y，Hu W，Liu J H，et al. An aquaporin gene MaPIP2-7 is involved in tolerance to drought，cold and salt stresses in transgenic banana （Musa acuminata L.）［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2020，147：66-76.

［8］王"星，張紀(jì)龍，馮秀秀，等. 植物質(zhì)膜水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及逆境脅迫響應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制［J］. 遺傳，2017，39（4）：293-301.

［9］王昊寧，周"佩，劉"燕，等. 月季TIFY基因家族的全基因組分析［J］. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，56（6）：990-997，1060.

［10］賈"顏，李"茜，李新藝，等. 含ACC脫氨酶的植物根際促生菌對(duì)月季切花品質(zhì)與生理的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，50（16）：147-153.

［11］賈曉麗，陳忠萍，吳圓圓，等. 五種月季品種的抗旱性比較與研究［J］. 北方園藝，2020（14）：71-81.

［12］Lin R Y，Zheng J X，Pu L，et al. Genome-wide identification and expression analysis of aquaporin family in Canavalia rosea and their roles in the adaptation to saline-alkaline soils and drought stress［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：333.

［13］Lescot M，Déhais P，Thijs G，et al. PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences［J］. Nucleic Acids Research，2002，30（1）：325-327.

［14］Chen C J，Chen H，Zhang Y，et al. TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

［15］由玉婉，張"雨，孫嘉毅，等. “月月粉”月季NAC家族全基因組鑒定及皮刺發(fā)育相關(guān)成員的篩選［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（24）：4895-4911.

［16］Maurel C，Boursiac Y，Luu D T，et al. Aquaporins in plants［J］. Physiological Reviews，2015，95（4）：1321-1358.

［17］原增艷. 甘薯水通道蛋白基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)分析［J］. 分子植物育種，2022，20（5）：1452-1461.

［18］Liu H L，Yang L L，Xin M M，et al. Gene-wide analysis of aquaporin gene family in Malus domestica and heterologous expression of the gene MpPIP2；1 confers drought and salinity tolerance in Arabidposis thaliana［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（15）：3710.

［19］趙鵬程，徐小萍，張春渝，等. 龍眼Aquaporin家族的全基因組鑒定及其在體細(xì)胞胚發(fā)生早期的表達(dá)［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2021，27（4）：1001-1012.

［20］Dong J H，Niu S C，Qian J，et al. Identification of aquaporin gene family in response to natural cold stress in Ligustrum×vicaryi Rehd［J］. Forests，2022，13（2）：182.

［21］Bancroft I. Duplicate and diverge：the evolution of plant genome microstructure［J］. Trends in Genetics，2001，17（2）：89-93.

［22］Kong W L，Bendahmane M，F(xiàn)u X P. Genome-wide identification and characterization of aquaporins and their role in the flower opening processes in carnation （Dianthus caryophyllus）［J］. Molecules，2018，23（8）：1895.

［23］Ren X Y，Vorst O，F(xiàn)iers M W E J，et al. In plants，highly expressed genes are the least compact［J］. Trends in Genetics，2006，22（10）：528-532.

［24］Raturi G，Kumawat S，Mandlik R，et al. Deciphering the role of aquaporins under different abiotic stress conditions in watermelon （Citrullus lanatus）［J］. Journal of Plant Growth Regulation，2023，42（5）：3137-3149.

［25］Die J V，Castro P，Millán T，et al. Segmental and tandem duplications driving the recent NBS-LRR gene expansion in the Asparagus genome［J］. Genes，2018，9（12）：568.

［26］Feng Z J，Xu S C，Liu N，et al. Identification of the AQP members involved in abiotic stress responses from Arabidopsis［J］. Gene，2018，646：64-73.

［27］Song S，Zhang D H，Ma F N，et al. Genome-wide identification and expression analyses of the aquaporin gene family in passion fruit （Passiflora edulis），revealing PeTIP3-2 to be involved in drought stress［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（10）：5720.

［28］Boursiac Y，Chen S，Luu D T，et al. Early effects of salinity on water transport in Arabidopsis roots.Molecular and cellular features of aquaporin expression［J］. Plant Physiology，2005，139（2）：790-805.

［29］Sun J Y，Liu X S，Khan I U，et al. OsPIP2；3 as an aquaporin contributes to rice resistance to water deficit but not to salt stress［J］. Environmental and Experimental Botany，2021，183：104342.