甘藍(lán)型油菜BnaC03g56680D基因的生物信息及亞細(xì)胞定位分析

摘要：2C型蛋白磷酸酶在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和植物生長發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，有關(guān)甘藍(lán)型油菜PP2C家族的系統(tǒng)分析尚未見諸報(bào)道。本研究對BnaC03g56680D基因進(jìn)行了全面分析。BnaC03g56680D基因的cDNA序列全長423 bp，編碼140個(gè)氨基酸，包含PP2C-like結(jié)構(gòu)域，其相對分子質(zhì)量為15 765.96 u，理論等電點(diǎn)為4.96，屬于穩(wěn)定的親水性蛋白。其二級結(jié)構(gòu)主要呈現(xiàn)為無規(guī)則卷曲，不含有跨膜結(jié)構(gòu)域與信號肽，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，屬于非分泌蛋白。該基因啟動子中含激素誘導(dǎo)相關(guān)元件與干旱脅迫響應(yīng)元件。此外，ABA、PEG、甘露醇的高水平誘導(dǎo)均導(dǎo)致BnaC03g56680D的表達(dá)上調(diào)，說明其可能在植物的抗逆過程中發(fā)揮重要功能。本研究不僅有助于解析2C型蛋白磷酸酶在植物生物學(xué)中的作用機(jī)制，還為未來基因工程和植物育種提供了潛在的目標(biāo)和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜；生物信息學(xué)；基因克??；PP2C；BnaC03g56680D

中圖分類號：S565.401""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0038-06

油菜是湖南地區(qū)的主要油料作物，其種植面積和產(chǎn)量在我國均居領(lǐng)先地位^［1］。國家統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2021年我國油菜種植面積為699.2萬hm²，占自產(chǎn)油料作物面積53.36%，是油料作物之首。油菜根據(jù)其植物學(xué)和生物學(xué)特性，分為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）、白菜型油菜（Brassia campestris L.）和芥菜型油菜（Brassica juncea L.）3類^［2］。其中，甘藍(lán)型油菜作為我國重要的油料作物之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值^［3］。然而，隨著世界氣候與生態(tài)環(huán)境日益惡化，保護(hù)甘藍(lán)型油菜的生存環(huán)境變得艱難，特別是在干旱和半干旱地區(qū)，干旱和鹽堿化對其影響最為顯著^［4］。同時(shí)，由于我國人口眾多，對菜籽油的需求不斷增加，導(dǎo)致我國菜籽油每年仍需進(jìn)口^［5］。因此，提高甘藍(lán)型油菜產(chǎn)量對于確保油料作物供應(yīng)和促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。

2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2Cs，PP2Cs），是一類依賴于Mg²⁺/Mn²⁺的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，能夠去除蛋白質(zhì)的磷酸基團(tuán)，動態(tài)調(diào)控蛋白磷酸化狀態(tài)，在植物生長、發(fā)育以及對非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［6-9］。PP2C還參與多種植物信號通路的調(diào)控，包括脫落酸（ABA）信號通路、植物激素赤霉素（GA）信號通路以及蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)等，這些信號通路對植物的生長和發(fā)育至關(guān)重要^［10-12］。多種植物中已鑒定出PP2C基因家族成員，如黃瓜（56個(gè)）、林地草莓（62個(gè)）、擬南芥（80個(gè)），蒺藜苜蓿（94個(gè)），玉米（103個(gè)）^［13-17］。多項(xiàng)研究表明，PP2C在植物的抗逆性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在干旱和鹽堿等不利環(huán)境下。例如，小麥中的TaPP2C158可以直接與TaSnRK1.1相互作用并使其去磷酸化，從而使TaSnRK1.1-TaAREB3信號通路失活，阻斷干旱脅迫響應(yīng)^［18］。棉花的GhDRP1基因可能通過調(diào)節(jié)ABA信號通路和類黃酮生物合成途徑參與干旱脅迫響應(yīng)^［19］。在水稻中，OsPP65通過調(diào)節(jié)茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）信號通路以及調(diào)節(jié)棉子糖家族低聚糖代謝途徑來負(fù)調(diào)控滲透脅迫和鹽脅迫耐受性^［20］。另外，白樺BpPP2C1過表達(dá)植株可能通過減少氧應(yīng)激損傷，表現(xiàn)出明顯的耐鹽性^［21］。

本研究成功從甘藍(lán)型油菜XY15中克隆得到BnaC03g56680D基因的完整cDNA序列。通過生物信息學(xué)方法，對該基因編碼蛋白的氨基酸組成、理化性質(zhì)、親疏水性、亞細(xì)胞定位以及三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測。這項(xiàng)研究不僅對培育抗逆新品種具有重要意義，同時(shí)也可以為揭示甘藍(lán)型油菜抗逆基因的功能機(jī)制提供有力支持。

1"材料與方法

1.1"材料

本研究于2022年在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物表觀遺傳調(diào)控與發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。供試材料甘藍(lán)型油菜湘油15號（XY15），常規(guī)種植于該實(shí)驗(yàn)室。

1.2"引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫Genoscope網(wǎng)站（https：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/）設(shè)計(jì)基因克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（表1），由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.3"甘藍(lán)型油菜RNA的提取

使用Trizol法提取甘藍(lán)型油菜XY15葉片組織的RNA。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，并用BioTek Epoch酶標(biāo)儀測定其濃度。質(zhì)量較好的產(chǎn)物用于后續(xù)目的基因擴(kuò)增及反轉(zhuǎn)錄。

1.4""BnaC03g56680D基因的克隆及載體構(gòu)建

甘藍(lán)型油菜湘油15號于光照氣候培養(yǎng)箱中培育，直至長出真葉，生長條件為24 ℃，光照16 h，黑暗 8 h。取適量真葉葉片，利用Trizol提取總RNA。使用購自諾唯贊公司的試劑盒HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到BnaC03g56680D基因的cDNA。在Snap Gene軟件中進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，分別在BnaC03g56680D的正向引物5′端和反向引物的3′端添加載體pCAMBIA1300-eGFP的同源臂。以cDNA為模板，采用15 μＬ的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit （D2111-02）試劑盒回收純化目的片段，利用同源重組法將目的片段構(gòu)建至pCAMBIA1300-eGFP載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，將菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板中，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測，選取陽性單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送至武漢金開瑞生物工程有限公司測序。

1.5"實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了研究BnaC03g56680D的表達(dá)模式，分別用200 mmol/L NaCl、200 g/L聚乙二醇（PEG）6000、200 μmol/L 甘露醇、100 μmol/L ABA和 100 μmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）處理正常生長3周齡的甘藍(lán)型油菜XY15幼苗。在0、3、6、9、12 h采集幼苗的葉片組織作為樣品。以油菜葉片cDNA為模板，持家基因Actin作為內(nèi)參，以克隆得到的BnaC03g56680D序列為參考，使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行qPCR引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1。試驗(yàn)設(shè)置３次生物學(xué)重復(fù)和３次技術(shù)重復(fù)。利用2^-ΔΔCT法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算出基因的相對表達(dá)量^［22］。使用Graphpad軟件作圖，以0 h的表達(dá)量作為對照，使用單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析。

1.6"BnaC03g56680D亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建pCAMBIA1300-35S：：BnaC03g56680D-eGFP載體完成后，采用瞬時(shí)表達(dá)法，將含有pCAMBIA1300-35S：：BnaC03g56680D-eGFP的重組質(zhì)粒和pCAMBIA1300-eGFP質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌注射至正常生長4周齡的本氏煙草的下表皮^［23］。煙草暗培養(yǎng)36 h后，以含有35S：：GFP質(zhì)粒的本氏煙草葉片為對照，并結(jié)合細(xì)胞核染料DAPI在熒光顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位情況。

1.7""BnaC03g56680D基因的生物信息學(xué)分析

通過ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；并使用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）工具分析蛋白結(jié)構(gòu)域；采用TMHMM Server v.2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）分析編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP 5.0 Server進(jìn)行信號肽預(yù)測；用在線工具Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析亞細(xì)胞定位情況；通過SPOMA及 SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。使用在線工具PlantCare（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析油菜BnaC03g56680D基因啟動子區(qū)域的順式作用元件。

2"結(jié)果與分析

2.1"BnaC03g56680D基因的克隆以及載體構(gòu)建

在甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫Genoscope中獲得BnaC03g56680D基因的cDNA序列全長為423 bp，共編碼140個(gè)氨基酸。經(jīng)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄后，獲得帶有同源臂的目的片段。利用同源重組酶進(jìn)行同源重組，將目的片段構(gòu)建到pCAMBIA1300-eGFP載體中，隨后進(jìn)行產(chǎn)物檢測和測序。測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)任何突變，由此得到了完整的重組質(zhì)粒。

2.2"BnaC03g56680D基因生物信息學(xué)分析

2.2.1"理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位分析

BnaC03g56680D蛋白化學(xué)式為C690H1 084N184O216S11，由140個(gè)氨基酸組成。其中纈氨酸（Val）含量最高，占總氨基酸比例的10.0%（圖1）。該蛋白的相對分子質(zhì)量為 15 765.96 u。理論等電點(diǎn)為4.96，偏酸性。脂肪系數(shù)為83.43，不穩(wěn)定系數(shù)為18.65，說明該蛋白在體外能夠穩(wěn)定存在。ProtScale預(yù)測為親水性蛋白（圖2）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，BnaC03g56680D主要分布于細(xì)胞核中。

2.2.2"BnaC03g56680D蛋白結(jié)構(gòu)分析

分析BnaC03g56680D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其保守結(jié)構(gòu)域第2～134位的氨基酸屬于PPM-type phosphatase-like超家族（圖3-A）。第5～53位及第88～125位為PP2C-like超家族。通過SOPMA在線工具對BnaC03g56680D的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，其二級結(jié)構(gòu)組成豐富，包括51.43%的無規(guī)則卷曲、30.71%的α-螺旋、5.71%的β-轉(zhuǎn)角和12.14%的延伸鏈（圖3-B）。使用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)3級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和模型構(gòu)建（圖3-C），全球模型質(zhì)量估計(jì)GMQE為0.83，表明模型具有高可信度。細(xì)胞膜或質(zhì)膜上發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)通常包含跨膜區(qū)域，這些區(qū)域連接著細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境并在維持蛋白質(zhì)位置和穩(wěn)定性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，部分跨膜區(qū)域還具有信號傳遞功能^［24］。結(jié)果表明，BnaC03g56680D缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白。通過SignalP 5.0 Server在線工具進(jìn)行信號肽預(yù)測，BnaC03g56680D不包含信號肽，因此可歸類為非分泌蛋白。

2.2.3"啟動子順式作用元件分析

對起始密碼子上游2 000 bp啟動子區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，該啟動子不僅包含了真核生物啟動子核心元件TATA-box和CAAT-box，還檢測到其他10種元件，其中包括光響應(yīng)型、激素響應(yīng)型和逆境響應(yīng)型元件。值得注意的是，其中ARE順式作用調(diào)節(jié)元件數(shù)量最多，表明其在無氧誘導(dǎo)調(diào)節(jié)中起著重要作用。相比之下，逆境響應(yīng)型元件較少，僅包括1個(gè)MBS元件，可能與干旱脅迫有關(guān)。綜合分析結(jié)果表明，該啟動子的元件種類豐富，具備積極響應(yīng)激素誘導(dǎo)和逆境脅迫的潛力。

2.3"實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)分析了BnaC03g56680D在各種非生物脅迫條件下的相對表達(dá)水平，結(jié)果（圖

5）顯示，在ABA誘導(dǎo)下，BnaC03g56680D的表達(dá)量顯著增加，在PEG和甘露醇模擬的干旱脅迫條件下，其表達(dá)量也有所上升。相比之下，在鹽脅迫條件下，其表達(dá)水平相對較低，而在MeJA誘導(dǎo)下，表達(dá)水平顯著下降。這種降低可能是因?yàn)樵搯幼尤狈⑴c茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用元件。然而，在不同激素誘導(dǎo)和干旱脅迫條件下，BnaC03g56680D都能夠在短時(shí)間內(nèi)迅速作出反應(yīng)，這與啟動子順式作用元件分析的結(jié)果一致。

2.4"亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)在線預(yù)測結(jié)果，BnaC03g56680D位于細(xì)胞核中。利用煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)法將已驗(yàn)證的35S：：pCAMBIA-1300-eGFP 載體通過農(nóng)桿菌注射于本氏煙草葉片， 暗培養(yǎng)36 h后撕下葉片下表皮， 并在熒光顯微鏡下結(jié)合DAPI染色進(jìn)行觀察。

pCAMBIA-1300-eGFP空載體中熒光信號同時(shí)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中可見，而BnaC03g56680D-GFP融合蛋白的熒光信號僅在細(xì)胞核中觀察到（圖6）。結(jié)合DAPI染色的結(jié)果表明，BnaC03g56680D蛋白在細(xì)胞核內(nèi)執(zhí)行特定功能。試驗(yàn)結(jié)果與初步預(yù)測相符。

3"討論與結(jié)論

盡管甘藍(lán)型油菜擁有高產(chǎn)和抗倒伏的特性， 但隨著人口的增加和環(huán)境條件的惡化，油菜籽總產(chǎn)量大大低于谷類，難以滿足市場需求^［25］。在面對非生物脅迫時(shí)，油菜的生物量、根系生長、葉片數(shù)、比葉面積、光合作用和葉綠素含量明顯減少。特別是在開花期受到脅迫時(shí)，可能導(dǎo)致開花時(shí)間提前，降低種子的油脂和脂肪酸含量，嚴(yán)重制約了油菜籽的生長和發(fā)育，從而最終影響了產(chǎn)量和品質(zhì)，對全球食品安全構(gòu)成威脅^［26］。PP2C基因廣泛分布于不同植物物種中，其家族成員通過調(diào)控多種信號通路及細(xì)胞內(nèi)外離子平衡來響應(yīng)不同的逆境脅迫^［27］。在常見的擬南芥、水稻、小麥等植物中研究表明，PP2C常作為負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)節(jié)干旱、低溫、鹽等脅迫^［28-30］。BnaC03g56680D編碼的蛋白含有PP2C-like結(jié)構(gòu)域，且位于細(xì)胞核內(nèi)。研究表明，核內(nèi)蛋白可以通過調(diào)控蛋白磷酸化狀態(tài)或與其他蛋白質(zhì)互作，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而調(diào)控基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞核內(nèi)的生物學(xué)過程^［31］。因此，BnaC03g56680D可能具有類似于PP2C的功能，通過去磷酸化作用調(diào)控下游靶蛋白的活性，從而影響植物的生長和發(fā)育。此外，基于啟動子順式作用元件及多種脅迫下的相對表達(dá)水平分析，BnaC03g56680D可能還參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)。在干旱脅迫下，它可能通過調(diào)控ABA信號通路，影響植物的耐受性。本研究結(jié)果為深入研究甘藍(lán)型油菜BnaC03g56680D基因表達(dá)調(diào)控及抗逆機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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