基于轉(zhuǎn)錄組測序分析沙門氏菌感染對番鴨法氏囊的影響

摘要：為探討沙門氏菌感染對番鴨的影響，擬通過轉(zhuǎn)錄組測序技術分析沙門氏菌感染番鴨后不同時間法氏囊組織的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用腸炎沙門氏菌感染14 d雛番鴨，感染后1、3、10 d采集試驗組和對照組法氏囊組織樣本，提取RNA，利用Illumina測序平臺進行測序，通過生物信息學分析鑒定不同時間點轉(zhuǎn)錄組變化、信號通路和功能。結(jié)果表明，在番鴨感染沙門氏菌1、3、10 d分別發(fā)現(xiàn)9、97、4個差異基因（Plt;0.05，|log2 fold change|gt;1）。GO分析結(jié)果表明，3個時間點中這些差異基因在生物學進程、分子功能、細胞部分均有富集。KEGG分析結(jié)果表明，感染1 d時，差異基因主要富集于集合管的酸分泌、霍亂弧菌感染、癌癥通路中；感染3 d時，差異基因主要富集于代謝信號通路、脂肪細胞脂解的調(diào)控及IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡；感染10 d，差異基因主要富集在亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多種疾病的神經(jīng)退行性途徑。其中，沙門氏菌感染1 d的差異基因ATP6V0A4，沙門氏菌感染3 d的差異基因IL-15、PTGS2、IGHV3-23主要參與了這些信號通路，提示這些基因可能在番鴨沙門氏菌感染過程中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：沙門氏菌；番鴨；法氏囊；轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號：S858.32""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0179-07

沙門氏菌是一種常見的食源性人畜共患致病菌，該菌引起的沙門氏菌病對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。沙門氏菌感染番鴨、引起發(fā)病的情況也多有報道，如2010年貴州省貴陽市某番鴨養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)番鴨在15日齡時發(fā)病，經(jīng)實驗室診斷為細小病毒和沙門氏菌混合感染^［1］。2012年，貴州省習水縣報道一番鴨場引進的雛番鴨在7日齡時發(fā)生鴨沙門氏菌感染^［2］。2014年，福建某番鴨場發(fā)生疑似沙門氏菌病，經(jīng)細菌分離與鑒定確定為沙門氏菌感染^［3］。2022年，在廣西一養(yǎng)殖場番鴨出現(xiàn)大批死亡，經(jīng)診斷為沙門氏菌與鴨疫里默氏菌混合感染^［4］。但沙門氏菌的發(fā)病機制不完全清楚，有研究表明，腸炎沙門氏菌感染雛鴨的法氏囊和胸腺病理變化不明顯，脾臟壞死明顯^［5］。但也有報告稱，分離出的沙門氏菌HP-2感染雛鴨的脾臟和胸腺沒有嚴重損傷，僅肝臟和心臟表面覆蓋大量黃白色物質(zhì)^［6］。

法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，在禽類的免疫反應中具有重要作用，在快速生長期切除法氏囊，會降低沙門氏菌的抗體反應^［7］。鴨感染腸炎沙門氏菌后，對其法氏囊進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，法氏囊濾泡內(nèi)淋巴細胞明顯減少^［8］。RT-PCR方法檢測沙門氏菌感染鴨免疫器官的分布和細菌載量的試驗表明，沙門氏菌感染后24～36 h，脾臟、血液和哈德氏腺中含有高濃度的細菌載量，而法氏囊和胸腺中細菌載量較低^［9］。以上結(jié)果說明，沙門氏菌感染會影響鴨法氏囊的病理變化和免疫反應。

目前，雖然多有番鴨感染沙門氏菌的報道，但主要限于對細菌的分離鑒定及診斷等病例報道，相關機制研究較少，本研究通過對感染沙門氏菌的番鴨法氏囊組織的轉(zhuǎn)錄組測序，分析感染不同時間番鴨法氏囊組織中的基因變化情況，以期為番鴨的沙門氏菌感染分子機制研究奠定基礎。

1"材料與方法

1.1"試驗動物及分組

1.1.1"番鴨沙門氏菌人工感染

本研究于2022年6—7月在江蘇省家禽科學研究所實驗動物房進行，試驗結(jié)束后對實驗動物房進行徹底消毒，所有試驗用品和動物廢料進行高壓消毒后廢棄。取鴨腸炎沙門氏菌菌株50336 1 μL（來自于揚州大學），加入至添加有5%血清的TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。1 000 r/min離心 10 min 后去上清，采用生理鹽水將沉淀稀釋為 10⁹"CFU/mL，每羽番鴨皮下注射0.5 mL，對照組鴨注射相同劑量的生理鹽水。

1.1.2"分組和樣品采集

在沙門氏菌人工感染的1、3、10 d，每組隨機選取4羽鴨空腹稱重后屠宰，采集法氏囊組織，用于轉(zhuǎn)錄組測序，對照組分別為 FC-1 組（FC1、FC2、FC3、FC4），F(xiàn)C-2組（FC5、FC6、FC7、FC8），F(xiàn)C-3組（FC9、FC10、FC11、FC12），感染組分別為FE-1組（FE1、FE2、FE3、FE4），F(xiàn)E-2組（FE5、FE6、FE7、FE8），F(xiàn)E-3組（FE9、FE10、FE11、FE12）。

1.2"轉(zhuǎn)錄組上機測序樣品的制備

高通量轉(zhuǎn)錄組測序委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。轉(zhuǎn)錄組測序流程如下：使用Trizol試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取總RNA，在Agilent 2100生物分析儀上評估RNA質(zhì)量（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA），并使用無RNase瓊脂糖凝膠進行電泳。提取總RNA后，采用Oligo（dT）富集真核細胞mRNA，使用NEBNext Ultra RNA文庫制備試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。純化的雙鏈cDNA片段末端修復，添加A堿基，并連接到Illumina測序儀器，采用AMPure XP珠（1.0X）純化連接反應，通過瓊脂糖凝膠電泳和聚合酶鏈反應（PCR）進行大小選擇，使用Illumina Novaseq 6000對所得cDNA文庫進行測序。

1.3"轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理與分析

由Illumina Novaseq 6000測序獲得Raw Reads或Raw Data，隨后對Raw Reads進行質(zhì)控（QC），確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到Clean Reads，采用tophat/bowtie2將Clean Reads比對到參考序列［Ensembl：Muscovy Duck（domestic type）CaiMos1.0］。比對完通過統(tǒng)計Reads在參考序列上的分布情況及覆蓋度，進行第二次質(zhì)控。隨后再進行基因表達、基因結(jié)構優(yōu)化、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)及編碼能力預測、SNP檢測等一系列后續(xù)分析，并從基因表達結(jié)果中，篩選出樣品間差異表達的基因，基于差異表達基因，進行聚類分析、GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析。

將差異表達基因（DEG）列表提交至Blast 2GO軟件包進行GO分析，確定和比較基因的功能。GO中差異基因Plt;0.05被認為是顯著富集。Unigenes的KEGG通路分析采用在線KEGG Automatic Annotation Server （KAAS；http：//www.genome.jp/kegg/kaas/）分析軟件分析。在所有的檢驗中，P值的計算采用Benjamini-corrected modified Fisher^，s精確檢驗，并且Plt;0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2"結(jié)果與分析

2.1"測序數(shù)據(jù)概況

由表1可知，通過轉(zhuǎn)錄組測序每個個體獲得的Raw Reads數(shù)在37 916 022～60 898 084之間，經(jīng)過濾得到的Clean Reads數(shù)在37 630 284～60 426 566之間，過濾率為99.0%以上，對比到基因組上的比對率為86.32%以上，Q30在90.0%以上，說明所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量佳。

2.2"沙門氏菌感染番鴨不同時間組差異分析

由表2可知，沙門氏菌感染番鴨后1 d，感染組和對照組間的差異基因為9個，其中上調(diào)基因8個，下調(diào)基因1個；感染后3 d，感染組和對照組間的差異基因為97個，其中，上調(diào)基因86個，下調(diào)基因11個；感染后10 d，感染組和對照組間的差異基因為4個，全為上調(diào)基因。

2.3"沙門氏菌感染番鴨差異基因概況

由表3可知，沙門氏菌感染番鴨1 d，感染組與對照組間排名前10的差異基因主要包括：細胞代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)相關的基因CTBP2、PDK4、ATP6V0A4、KLF15；與細胞免疫相關的基因IGLV3-19和KLRB1，以及與細胞周期相關的基因ZBTB16。沙門氏菌感染番鴨3 d，感染組和對照組間排名前10的差異基因主要包括與代謝相關的基因PLIN1、FABP4、SGPP2、DHRS4；與細胞免疫調(diào)節(jié)相關的基因IL15、IGHV3-23、PTGS2、ATP6V1G3，與細胞增殖、分化有關的MC5R、BLVRB基因。在沙門氏菌感染番鴨 10 d，感染組與對照組間的差異基因TECTA與聽力損傷有關，MSTRG.5870、ENSCMMG00000013903、MSTRG.4971為新發(fā)現(xiàn)基因，功能未知。

2.4"沙門氏菌感染番鴨不同組間差異基因GO分析

由表4可知，沙門氏菌感染番鴨1、3、10 d排名前10的GO條目，差異基因在生物學進程、分子功能、細胞部分均有富集，其中，沙門氏菌感染番鴨 1 d， 生物學進程中富集條目有代謝過程、 生物學過程調(diào)節(jié)和生物學調(diào)節(jié)等；分子功能中富集條目有結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和催化活性條目等；細胞部分中富集條目為細胞解剖學實體和含蛋白質(zhì)復合物。沙門氏菌感染3 d，生物學進程中富集的條目有細胞過程、代謝過程、生物學調(diào)節(jié)等；分子功能中富集的條目有結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運活性；細胞部分中富集的條目為細胞解剖學實體和含蛋白質(zhì)復合物。沙門氏菌感染番鴨10 d，生物學進程中富集條目有細胞過程、多細胞生物過程、生物學黏附等；分子功能中富集的條目為結(jié)合；細胞部分富集的條目為細胞解剖學實體。

2.5"沙門氏菌感染番鴨不同組間差異基因KEGG分析

由表5可知，沙門氏菌感染番鴨1 d，ATP6V0A4參與了排名前10的信號通路中集合管的酸分泌、霍亂弧菌感染、急性髓細胞白血病、幽門螺桿菌感染中上皮細胞信號傳導、突觸囊泡周期、類風濕性關節(jié)炎多個信號通路，CTBP2參與了癌癥途徑、Notch信號通路和慢性粒細胞白血病通路，ZBTB16參與癌癥途徑和氧化磷酸化信號通路。沙門氏菌感染番鴨3 d，在排名前10的信號通路中參與代謝通路的基因最多，為14個，其次為脂肪細胞脂解的調(diào)控通路，為4個。與免疫相關的信號通路有：IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡、類風濕性關節(jié)炎、PPAR信號通路、NF-kB信號通路、致病性大腸桿菌感染、P13K-Akt信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用，參與的基因包括IL-5、IGHV3-23、HBAD、Atp6v1g3、FABP4、PLIN1、PTGS2、CLDN10、DDIT4；參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用的差異基因為CHRNB4和MC5R。沙門氏菌感染番鴨10 d，涉及的信號通路僅有3條，分別為亨廷頓舞蹈癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多種疾病的神經(jīng)退行性途徑，差異基因均為MSTRG.5870。

3"討論

通過鼠傷寒沙門氏菌LPS誘導雛雞急性法氏囊萎縮的研究表明，LPS刺激可導致法氏囊炎癥變化、結(jié)構破壞；轉(zhuǎn)錄組分析表明，LPS刺激早期誘導的雛雞法氏囊微觀形態(tài)變化可能受到LPS/TLR4/MAPK信號途徑中下游活化的轉(zhuǎn)錄分子CNN1、E2F1和HRAS的調(diào)節(jié)^［10］。鼠沙門氏菌感染雞后，雞法氏囊中TLR4和相關免疫細胞的表達發(fā)生改變^［11］。腸炎沙門氏菌感染雞后不同時間盲腸組織的轉(zhuǎn)錄組學研究表明，在感染后1、3、7、14 d差異表達的基因分別為529、1 477、476、432個。1 d時，差異表達基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體互作、吞噬體、PPAR信號通路；3 d差異表達基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體互作、Toll樣受體信號通路、視黃醇代謝信號通路；7 d差異表達基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞黏附分子、α-亞麻酸代謝信號通路，14 d差異表基因主要富集在組氨酸代謝、MAPK信號通路^［12］。RNA-seq 技術檢測雞腸炎沙門氏菌抗性相關基因的研究表明，抗性組和抗病組相比共有137個差異基因，抗病組和易感組相比共有176個差異基因，對照組和易感組相比共有270個差異基因。差異基因主要富集在炎癥因子與其受體相互作用，NOD樣受體信號通路、JAK-STAR信號通路、P13K-Akt信號通路^［13］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學測序的方法檢測番鴨感染鴨疫里默氏菌后不同時間的基因表達變化結(jié)果表明， 在感染的1、3、10 d， 差異基因分別為9、97、4個，富集的信號通路包括：Notch信號通路、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡、PPAR信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、P13K-Akt信號通路等免疫相關信號通路，但未富集到TLR、NOD等信號通路，對腸炎沙門氏菌的免疫反應存在差異可能與物種、組織以及沙門氏菌菌株的不同有關。

沙門氏菌感染番鴨后1 d，差異基因中參與信號通路最多的為ATP6v0A4基因，研究發(fā)現(xiàn)，該基因突變導致原發(fā)性常染色體隱性遺傳性遠端腎小管酸中毒^［14-15］。信號通路分析表明，該基因還參與霍亂弧菌、幽門螺桿菌感染等與免疫相關的信號通路，本研究首次在番鴨沙門氏菌感染中發(fā)現(xiàn)該差異基因，提示該基因在番鴨沙門氏菌的感染過程中也發(fā)揮重要作用。沙門氏菌感染3 d，差異基因主要參與代謝通路、脂肪細胞脂解的調(diào)控、PPAR信號通路等代謝相關的信號通路，且參與代謝通路的差異基因最多，提示番鴨感染沙門氏菌后可能會引起其代謝的改變。另外，差異基因還參與多條與免疫相關的信號通路，差異基因主要包括IL-15、PTGS2、IGHV3-23等。IL-15是趨化因子家族的一種細胞因子，可誘導B細胞、T細胞和NK細胞的增殖和分化^［16-18］，還與IL-12協(xié)同刺激NK細胞產(chǎn)生 IFN-r^［19］，還能夠刺激巨噬細胞、NK細胞、T細胞和B細胞分泌細胞因子，并且自身具有促炎特性^［20］。研究表明，IL-15的表達在組織被破壞和感染的條件下上調(diào)^［21-22］。且IL-15參與NK和T細胞介導的大腸埃希氏菌感染^［23-24］"。內(nèi)源性IL-15還通過激活NK細胞和產(chǎn)生IFN-r，在早期預防霍亂鏈球菌感染方面具有重要作用^［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-15為參與番鴨感染沙門氏菌3 d差異前10位KEGG中的一個重要基因，參與了IgA小腸免疫網(wǎng)絡、類風濕關節(jié)炎、TNF信號通路，在鴨的沙門氏菌感染過程中可能發(fā)揮重要作用。有研究表明，LPS誘導的PTGS2（前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2）通過NF-kB調(diào)節(jié)炎性反應^［26］，本研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了TNF信號通路和NF-kB信號通路，提示PTGS2可能是通過這2種信號通路參與番鴨沙門氏菌感染后的炎性反應過程。研究表明，在新冠肺炎病人中，IGHV3-23（免疫球蛋白重量變量3家族成員23）作為B細胞的受體發(fā)揮作用^［27］；且IGHV3-23的突變與B細胞慢性淋巴細胞白血病有關^［28］，本研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了番鴨的IgA腸道網(wǎng)絡、類風濕關節(jié)炎、NF-kb信號通路、大腸桿菌感染、P13K-Akt信號通路等信號途徑，提示該基因在番鴨的沙門氏菌感染過程中具有重要作用。PLIN1、脂滴包被蛋白1，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解、細胞代謝及線粒體功能中發(fā)揮作用^［28］。在沙門氏菌感染番鴨10 d，僅涉及3個信號通路，1個差異基因，且差異基因功能未知，提示番鴨沙門氏菌感染10 d時已基本恢復健康。

綜上，本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術檢測了沙門氏菌感染番鴨1、3、10 d法氏囊組織中基因表達情況，獲得了個體的測序數(shù)據(jù)，分別篩選出9、97、4個差異基因，說明在沙門氏菌感染番鴨3 d時，感染與抗感染反應最強。其中，ATP6V0A4可能通過參與細菌感染、炎性相關信號通路，IL15、PTGS2、IGHV3-23 等可能通過參與代謝通路和免疫反應相關信號通路調(diào)節(jié)沙門氏菌感染番鴨過程中，研究結(jié)果可為番鴨的沙門氏菌感染與抗感染機制研究提供理論參考。

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