摘要:近期,水稻無融合生殖研究取得了系列進(jìn)展。通過對水稻減數(shù)分裂基因和配子發(fā)育相關(guān)基因的編輯或表達(dá)調(diào)控,初步實(shí)現(xiàn)了水稻雜交種的自交傳代,為一系法雜交水稻成功實(shí)現(xiàn)奠定了重要基礎(chǔ)。本文對三系法、兩系法、智能不育系及一系法4種雜交水稻制種技術(shù)的歷史、現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,重點(diǎn)介紹了各技術(shù)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展及各自的優(yōu)缺點(diǎn),并對各育種技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望,為后續(xù)創(chuàng)制優(yōu)良雜交水稻種子繁殖體系及進(jìn)一步發(fā)揮雜交水稻潛力提供參考。
關(guān)鍵詞:雜交水稻;細(xì)胞質(zhì)雄性不育系;光/溫敏核雄性不育系;智能不育系;無融合生殖
中圖分類號(hào):S511.035.1" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
文章編號(hào):1002-1302(2024)19-0001-07
收稿日期:2024-03-19
基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):32200690)
作者簡介:張 超(1988—),男,山東濟(jì)寧人,博士,講師,碩士生導(dǎo)師,主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail:chaozhang@yzu.edu.cn。
通信作者:于恒秀,博士,教授,主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail:hxyu@yzu.edu.cn。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一,全球超過1/2的人口以稻米為主食[1]。人口的持續(xù)增加、耕地面積的不斷減少及極端氣候的頻繁出現(xiàn),使糧食安全面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。中國雜交水稻種植面積占比超過50%,占全國水稻總產(chǎn)量的60%以上,為我國乃至世界糧食增產(chǎn)做出了卓越貢獻(xiàn)[2-3]。雜交水稻是利用雜種優(yōu)勢提高產(chǎn)量的成功應(yīng)用,也是解決日益嚴(yán)重的糧食短缺危機(jī)的關(guān)鍵技術(shù)之一。
雜種優(yōu)勢廣泛存在于生物界,它指2個(gè)不同遺傳背景的親本雜交產(chǎn)生的雜種F1代在抗逆性、抗病性、適應(yīng)性、生長勢、產(chǎn)量和品質(zhì)等方面優(yōu)于親本的現(xiàn)象。雜種優(yōu)勢在作物改良方面的利用對提高產(chǎn)量具有顯著的效果。20世紀(jì)50年代,半矮稈基因sd1的鑒定利用和半矮稈作物品種培育促成了第1次“綠色革命”,這解決了發(fā)展中國家的糧食短缺問題[4]。1926年,美國農(nóng)學(xué)家Jones率先提出了水稻具有雜種優(yōu)勢的理論,雜種優(yōu)勢的利用被認(rèn)為是“第二次綠色革命”。雜交水稻能獲得比常規(guī)水稻高15%以上的產(chǎn)量優(yōu)勢[5-6]。
1963年,Henry Beachell于印度尼西亞首次成功培育出雜交水稻,隨后日本新城長友在1968年育成了具有Chinsurah Boro Ⅱ細(xì)胞質(zhì)的不育系臺(tái)中65,率先實(shí)現(xiàn)了粳型雜交水稻的3系配套。但由于親緣關(guān)系太近而優(yōu)勢較弱等問題,未能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用[7]。20世紀(jì)60年代,袁隆平鑒定了1個(gè)雄性不育野生稻品系,該品系攜帶野生稻敗育細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因(cytoplasmic male sterility-wild abortion,CMS-WA)。如今CMS-WA已經(jīng)滲入到各種水稻背景中,產(chǎn)生了許多CMS系,并在這些系的基礎(chǔ)上開發(fā)了“三系”雜交育種系統(tǒng)[8-9]。1973年,石明松在湖北仙桃發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)光敏感雄性核不育水稻農(nóng)墾58S,拉開了基于光溫敏核不育基因(photoperiod/ thermo-sensitive genic male sterile,PTGMS)的“兩系”雜交稻系統(tǒng)的發(fā)展序幕[10]。目前,雜交水稻種子生產(chǎn)主要以三系法和兩系法為主要繁殖體系。此外,近些年發(fā)展的水稻智能不育系及無融合生殖技術(shù)為雜交水稻育種提供了更多可能性,并指出了新的發(fā)展方向。
1 水稻三系法雜交育種技術(shù)研究現(xiàn)狀
三系法雜交水稻技術(shù)又被稱為“第一代雜交水稻技術(shù)”,該技術(shù)體系由細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系組成。雄性不育系的雄性生殖器官發(fā)育不正常,花粉敗育,但其雌性生殖器官發(fā)育正常,可接受外來正常花粉受精結(jié)實(shí)。保持系的細(xì)胞質(zhì)基因正常,花粉可育,能夠自交結(jié)實(shí)繁殖,將保持系花粉授給不育系后產(chǎn)生的后代為不育系。恢復(fù)系具有能夠恢復(fù)不育系細(xì)胞質(zhì)雄性不育的核基因,與不育系雜交后產(chǎn)生的雜交種正??捎?,可應(yīng)用于大面積水稻生產(chǎn)[11-12]。
細(xì)胞質(zhì)雄性不育系受到細(xì)胞質(zhì)不育基因和對應(yīng)的細(xì)胞核基因的共同控制,通常是由于編碼細(xì)胞毒性蛋白的異常線粒體基因干擾了植物正常代謝,產(chǎn)生多種異常生理反應(yīng),導(dǎo)致花粉敗育[13-15]。CMS根據(jù)不育機(jī)制和恢保關(guān)系的不同主要分為野生稻敗育細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS-WA)、紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS-HL)及包臺(tái)型細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS-BT),其中CMS-HL和CMS-BT是配子體不育型,CMS-WA是孢子體不育型[16-17]。
CMS-WA是最早被發(fā)現(xiàn)并利用的一類不育胞質(zhì)類型,由線粒體基因WA352控制。該基因在花藥絨氈層特異表達(dá),所編碼的蛋白可與核編碼的線粒體跨膜蛋白COX11互作,抑制COX11清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的功能。受到活性氧損害的絨氈層細(xì)胞程序性死亡提前,產(chǎn)生花粉敗育表型[18]。水稻CMS-HL的不育基因是orfH79,而CMS-BT的不育基因是orf79。這2個(gè)基因都與線粒體嵌合基因atp6-orf79轉(zhuǎn)錄本相關(guān),其序列相似性達(dá)到98%[16]。orf79與復(fù)制的atp6基因(B-atp6)共轉(zhuǎn)錄。其編碼具有細(xì)胞毒性的多肽。免疫印記分析表明,ORF79蛋白在小孢子內(nèi)特異性積累,導(dǎo)致CMS-BT小孢子敗育[19]。orfH79有2種存在方式,一種是與atp6共轉(zhuǎn)錄形成的融合轉(zhuǎn)錄本,另一種為orfH79的單獨(dú)轉(zhuǎn)錄本[16,19-20]。關(guān)于CMS-HL的不育機(jī)制尚不完全明確。彭曉玨等利用原核系統(tǒng)證明微量的ORFH79天然蛋白強(qiáng)烈抑制了細(xì)菌生長,為思考水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理提供了研究線索[21]。Wang等發(fā)現(xiàn),ORFH79通過與電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ的亞基互作,影響了線粒體功能,導(dǎo)致花粉敗育[22]。
保持系具有與CMS系相同的核基因,但不具有異常線粒體基因,表現(xiàn)為可育,通過自交可以繁殖保持系。保持系對不育系的異花授粉可以繁殖不育系[11-12,23]?;謴?fù)系包含特定的育性恢復(fù)(Restorer of fertility,Rf)基因,其可通過作用于CMS基因的RNA或蛋白質(zhì)抑制相應(yīng)CMS基因功能,因此CMS的育性能夠在CMS系和恢復(fù)系的雜交種中得到恢復(fù)[12,24],例如CMS-WA基因育性可被Rf3和Rf4恢復(fù)。有研究表明,Rf3可能在WA352翻譯或翻譯后水平發(fā)揮作用,而Rf4在WA352的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用[18,23,25]。CMS-BT基因育性可被Rf1a和Rf1b恢復(fù)。RF1A與RF1B均定位于線粒體,二者分別通過核酸內(nèi)切及mRNA降解途徑抑制ORF79的蛋白含量[19]。CMS-HL基因育性可被Rf5和Rf6恢復(fù)。RF5參與融合轉(zhuǎn)錄本atp6-orfH79的剪接,而RF6可促進(jìn)該轉(zhuǎn)錄本的加工過程,從而恢復(fù)花粉育性[26-27]。獲得的三系雜交種具有明顯的雜種優(yōu)勢[23,28-29]。
南優(yōu)2號(hào)是我國第1個(gè)大面積推廣應(yīng)用的雜交水稻組合,由CMS-WA衍生而來,于1973年被發(fā)現(xiàn),具有明顯的雜種優(yōu)勢[30]。1980年,由謝華安等研發(fā)的汕優(yōu)63是我國推廣面積最大的雜交水稻組合,大面積生產(chǎn),產(chǎn)量達(dá)到600 kg/667 m2[31]。由于雜交水稻在生產(chǎn)上具有明顯的產(chǎn)量優(yōu)勢,在我國迅速推廣,應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)[11,32-33]。目前,我國推廣面積較大的雜交稻還有汕優(yōu)64、威優(yōu)64、汕優(yōu)2號(hào)、岡優(yōu)22、汕優(yōu)6號(hào)、威優(yōu)6號(hào)、Ⅱ優(yōu)838、D優(yōu)63、汕優(yōu)10號(hào)(國家水稻數(shù)據(jù)中心),這些品種的種植面積都超過了600萬hm2。
三系法雜交水稻在產(chǎn)量上取得了巨大的成功,但可培育為不育系的水稻種質(zhì)資源較少,不育系選育效率低。受恢保關(guān)系制約,三系法配組不自由,雙親間遺傳差異小,導(dǎo)致水稻雜種優(yōu)勢難以充分利用。此外,部分不育系的育性受溫度影響發(fā)生波動(dòng)[9,32-34],這限制了三系法雜交水稻的產(chǎn)量提高及進(jìn)一步推廣。
2 水稻兩系法雜交育種技術(shù)研究現(xiàn)狀
“第二代雜交水稻技術(shù)”是以依賴于光溫敏核不育系的“兩系雜交水稻”[3-4,9,32,34]。PTGMS育性受光照時(shí)長或溫度的影響,隨環(huán)境條件進(jìn)行轉(zhuǎn)換,可育條件下自交繁殖不育系,不育條件下與大多數(shù)常規(guī)水稻品種(兩系恢復(fù)系)雜交生產(chǎn)具有雜種優(yōu)勢的雜交種。根據(jù)影響其育性轉(zhuǎn)換的主要因素不同,通常將PTGMS分為2類,即光敏核不育(photoperiod-sensitive genic male sterile,PGMS)和溫敏核不育(thermo-sensitive genic male sterile,TGMS)。
PGMS的育性受到光周期的影響,一般可分為長光敏核不育型和短光敏核不育型。長光敏核不育型表現(xiàn)為在長日照條件下雄性不育,在短日照條件下育性恢復(fù)正常,短光敏核不育型則相反。典型的PGMS還受到溫度的負(fù)向互作。在我國各水稻研究中心,農(nóng)墾58S(NK58S)被廣泛用于將PGMS性狀轉(zhuǎn)移到粳稻和秈稻優(yōu)良品種(系)中。目前認(rèn)為控制粳稻農(nóng)墾58突變?yōu)镹K58S雄性不育的光敏核不育基因主要有pms1、pms2和pms3。有研究指出,pms1是不完全顯性基因,編碼1個(gè)長鏈非編碼RNA,在幼穗中表達(dá)量較高,是miRNA2118的作用靶標(biāo)。miRNA2118可以識(shí)別并剪切pms1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PMS1T,從而形成21 nt的phasiRNA(phased small-interfering RNAs)。NK58S在pms1基因上存在單堿基突變,導(dǎo)致在長日照條件下phasiRNA在水稻幼穗內(nèi)大量積累,從而造成雄性不育[35]。pms2基因尚未克隆,其不育機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。Ding等克隆了pms3,其編碼1個(gè)長度為1 236 bp的長非編碼RNA(lncRNA)-LDMAR。由于在NK58S的LDMAR中發(fā)生了G到C的突變,改變了其RNA 2級(jí)結(jié)構(gòu),并造成LDMAR的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度升高,導(dǎo)致在長日照條件下轉(zhuǎn)錄本減少,從而造成花藥程序化死亡提前,出現(xiàn)在長日照條件下雄性不育的現(xiàn)象[23,36]。pms3在秈稻中的等位基因p/tms12-1不同于在粳稻NK58S中調(diào)控光敏核雄性不育基因,p/tms12-1在秈稻培矮64S(PA64S)背景中調(diào)控溫敏雄性不育,野生型P/TMS12-1是一個(gè)非編碼RNA基因,它的原始轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過至少2次加工產(chǎn)生1個(gè)小RNA。突變型p/tms12-1在該小RNA上產(chǎn)生單堿基突變(與pms3一致),導(dǎo)致p/tms12-1溫敏不育[37]。R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子CSA調(diào)控水稻糖的分配,在水稻花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在秈稻及粳稻背景下,csa的花粉在短日照條件下表現(xiàn)不育,長日照條件下表現(xiàn)為可育。短日照條件下,CSA基因的表達(dá)量更高。CSA的同源基因MYB5和MYB8在長日照條件下具有更高的表達(dá)量。因此,CSA及其同源基因在不同光照條件下的功能互補(bǔ)可能是csa光敏不育的原因[39]。
TGMS的育性受到環(huán)境溫度的影響。TMS5編碼1個(gè)保守的RNA酶ZS1(RNaseZS1)。RNaseZS1能剪切并降解3個(gè)泛素核糖體L40融合蛋白基因UbL40mRNA。而在tms5突變體中,RNaseZS1功能缺失,不能對UbL40mRNA進(jìn)行切割降解。高溫導(dǎo)致UbL40mRNA過度積累,使花粉發(fā)育受阻,花粉敗育[40-41]。水稻tms10高溫下表現(xiàn)為雄性不育,低溫條件下雄性可育。與其同源蛋白的雙突變體tms10 tms10l在高溫及低溫條件下均表現(xiàn)為不育。TMS10L可在常溫下互補(bǔ)TMS10的功能,從而使tms10突變體在常溫下表現(xiàn)雄性可育[42]。組蛋白結(jié)合蛋白OsMS1的自然等位基因OsMS1wenmin1可引起水稻溫敏雄性不育。高溫可導(dǎo)致OsMS1wenmin1的蛋白含量降低,且減低幅度大于OsMS1[43]。高溫敏感調(diào)控基因OsTMS19編碼五肽重復(fù)(pentatricopeptide repeat,PPR)蛋白。在高溫及長光照條件下,ostms19花藥中積累過多的活性氧,破壞了花粉內(nèi)壁的形成,造成雄性不育。這種活性氧的動(dòng)態(tài)平衡與育性轉(zhuǎn)換的關(guān)系在其他PTGMS中也存在,表明活性氧的調(diào)控可能是水稻PTGMS育性轉(zhuǎn)換的普遍機(jī)制[44]。唐杰等鑒定到育性受光溫影響的雄性不育突變體tms3650,但控制該性狀的基因尚未克隆,不育機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[45]。
相對于三系法雜交水稻,兩系法雜交水稻不需要保持系來繁殖雄性不育系,這大大簡化了雜交育種的程序。此外,PTGMS系的雄性不育由隱性核基因控制,它們可以與任何攜帶野生型育性基因的植株雜交,以恢復(fù)雜種的生育能力,這使得雜交組配更加自由,促使大多數(shù)種質(zhì)資源的雜種優(yōu)勢得到開發(fā)利用[9,32,34,46]。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心提供的數(shù)據(jù),2017—2021年期間通過國家審定的水稻品種中,兩系法雜交水稻占比57.3%。但是,PTGMS的育性容易受到環(huán)境影響,在不可預(yù)測的環(huán)境條件下,光溫敏不育系面臨育性轉(zhuǎn)換臨界溫度不穩(wěn)定的問題,特別是不能穩(wěn)定保持的環(huán)境溫度容易導(dǎo)致PTGMS種子和雜交種子的生產(chǎn)失敗,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來損失[47-48]。
3 水稻“智能不育系”育種技術(shù)研究現(xiàn)狀
利用基因工程技術(shù)改造普通核不育系,是進(jìn)一步利用水稻雜種優(yōu)勢的新型育種技術(shù)體系。普通核不育系僅由1對隱性基因控制,任何品系都能轉(zhuǎn)育成為不育系,任何品系都能作為普通核不育系的恢復(fù)系。同時(shí),普通核不育系花粉敗育徹底,不育性穩(wěn)定[49]。普通核不育系和父本能夠不斷擴(kuò)大遺傳差異,同時(shí)本身可以結(jié)合任何優(yōu)良基因,聚合各種優(yōu)良性狀,不受遺傳背景限制,能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)育種,因此又稱為智能不育系。由于純合隱性雄性不育系的完全敗育難以在生產(chǎn)中大量繁殖,限制其在雜種優(yōu)勢利用中的應(yīng)用價(jià)值。1993年,Williams等提出一種轉(zhuǎn)基因保持系的新策略,即通過用雄性育性恢復(fù)基因和花粉致死基因連鎖表達(dá)轉(zhuǎn)化隱性雄性不育植物,從而創(chuàng)建水稻保持系,通過保持系的自交可以繁殖雄性不育系和保持系種子[50]。2002年,Perez-Prat等提出了引入第3個(gè)標(biāo)記基因的想法,即用育性恢復(fù)基因、選擇標(biāo)記基因(種子顏色基因)和花粉致死基因,這3個(gè)基因構(gòu)建緊密連鎖表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化雄性不育突變體,以產(chǎn)生保持系。保持系自交授粉的后代將產(chǎn)生比例為 1 ∶1 的雄性不育系種子和帶顏色保持系種子,兩者可以通過顏色選擇標(biāo)記進(jìn)行分選,雄性不育系可以用于配置雜交種[51]?;谏鲜鱿敕ǎ?006年Dupont Pioneer率先在玉米中開發(fā)了雄性不育系種子生產(chǎn)技術(shù)(the seed production technology,SPT)。利用雄性不育的育性恢復(fù)基因Ms45、花粉特異啟動(dòng)子PG47控制的玉米編碼α-淀粉酶基因ZmAA1和紅色熒光蛋白基因DsRed2這3個(gè)基因緊密連鎖的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化玉米雄性不育突變體ms45,從而生產(chǎn)保持系。Ms45可以恢復(fù)雄性不育突變體ms45的雄性育性?;ǚ厶禺悊?dòng)子PG47控制下的Zm-aa1用來防止花粉中的淀粉積累,從而特異性地使攜帶轉(zhuǎn)基因成分的花粉失活,使只有非轉(zhuǎn)基因花粉才能參與受精結(jié)實(shí)。紅色熒光蛋白基因DsRed2用作識(shí)別后代是否攜帶轉(zhuǎn)基因成分的顏色篩選標(biāo)記[52]。雜合轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)雄性育性并產(chǎn)生1 ∶1的不帶轉(zhuǎn)基因的可育花粉粒和帶轉(zhuǎn)基因的不育花粉粒。由于轉(zhuǎn)基因不影響雌性器官的育性,轉(zhuǎn)基因植物自花授粉產(chǎn)生2種種子。一種是攜帶轉(zhuǎn)基因且被標(biāo)記為紅色熒光的種子,為保持系;另一種是非轉(zhuǎn)基因沒有顏色的種子,為雄性不育系,這2種種子可以通過熒光機(jī)械化分選。SPT技術(shù)自2012年起已經(jīng)在美國被應(yīng)用于玉米雜交種生產(chǎn),且生產(chǎn)的雜交玉米被美國、澳大利亞和日本的監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)證為非轉(zhuǎn)基因玉米[53]。盡管SPT技術(shù)最早是在玉米中開發(fā)的,但它對于不易人工去雄的作物,如水稻、小麥、油菜等具有兩性花的作物更有適用性。
2010年,Wang等在水稻中采用了相同的方法,將花粉特異啟動(dòng)子PG47驅(qū)動(dòng)下的玉米α-淀粉酶基因Zm-aa1、糊粉酮特異性LTP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的紅色熒光蛋白DsRed2與水稻Ms26基因(OsCYP704B2)緊密相連,轉(zhuǎn)化進(jìn)粳稻背景下的Oscyp704b2雄性不育突變體中[54]。由此產(chǎn)生了攜帶單拷貝轉(zhuǎn)基因插入的保持系,保持系自交產(chǎn)生了比例為1 ∶1的帶熒光種子和不帶熒光種子,表明該技術(shù)在水稻生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。然而,由于水稻種子具有穎殼,給利用紅色熒光標(biāo)記進(jìn)行水稻種子分選帶來難度[55]。2014年,于恒秀等提出利用對除草劑敏感性差異建立雜交水稻種子繁殖體系,利用水稻中OsCYP81A6基因的功能喪失會(huì)破壞水稻對磺酰脲類除草劑如苯達(dá)松的抗性這一原理,將OsCYP81A6基因的RNA干擾結(jié)構(gòu)與水稻隱性雄性核不育基因的育性恢復(fù)基因和花粉致死基因緊密連鎖構(gòu)建成連鎖結(jié)構(gòu),再轉(zhuǎn)入相應(yīng)的雄性不育系中獲得保持系,保持系自交后代只需要噴灑磺酰脲類除草劑如苯達(dá)松就可以將可育株去除,篩選出雄性不育株[56]。同時(shí),在載體構(gòu)建時(shí)可以引入對另一類除草劑具有抗性的基因(如BAR基因),通過施用另一類除草劑噴施來提高保持系的制種產(chǎn)量[57]。
2016年,Chang等利用源自甲基磺酸乙酯(EMS)誘變的秈稻品種黃華占(HHZ)的隱性雄性不育突變體Osnp1(Oryza sativa No Pollen 1)和相應(yīng)的育性恢復(fù)基因OsNP1構(gòu)建了新核雄性不育系繁殖體系。HHZ是一個(gè)半矮稈、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)秈稻品種,在我國廣泛種植。OsNP1編碼絨氈層退化和花粉外壁形成所需的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶,Osnp1突變體在不同環(huán)境條件下均呈現(xiàn)穩(wěn)定的雄性不育。將OsNP1基因、由花粉特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Zm-aa1以及由糊粉特異性LTP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的紅色熒光蛋白DsRed連鎖表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入Osnp1突變體中,通過篩選和鑒定獲得了一個(gè)名為Zhen18B的保持系,該保持系攜帶有單拷貝轉(zhuǎn)基因[58]。Zhen18B在形態(tài)、生長發(fā)育和結(jié)實(shí)方面與HHZ沒有差異,但自交產(chǎn)生的種子為1 ∶1的帶熒光轉(zhuǎn)基因種子和不帶熒光非轉(zhuǎn)基因種子,帶熒光種子為保持系Zhen18B,而不帶熒光種子為雄性不育系,命名為Zhen18A。在以Zhen18A為母本與其他水稻種質(zhì)的雜交試驗(yàn)中,約85%的單株產(chǎn)量超過親本[59]。這些結(jié)果證明該系統(tǒng)在雜交水稻生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。
2021年,李莉等利用基因編輯技術(shù)敲除細(xì)胞色素P450羥化酶編碼基因CYP703A3,成功獲得了雄性不育突變體931103a3。突變體931103a3的花粉量顯著減少,僅觀察到少量皺縮的不育花粉粒。將花粉育性恢復(fù)基因CYP703A3、花粉致死基因orfH79和選擇標(biāo)記基因DsRed2構(gòu)建的三元素連鎖表達(dá)載體通過幼穗愈傷組織轉(zhuǎn)化進(jìn)突變體931103a3,通過鑒定篩選獲得了保持系9311-3B。通過自交保持系9311-3B,產(chǎn)生了含轉(zhuǎn)基因成分的保持系9311-3B和不含轉(zhuǎn)基因成分的雄性不育系9311-3A,且兩者比例為1 ∶1。以9311-3A為母本與優(yōu)良品種雜交,與對照相比產(chǎn)量增加了13%以上[60-61]。
唐曉燕團(tuán)隊(duì)利用干擾技術(shù),降低糖代謝相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)水平,使含有干擾載體的種子胚乳皺縮,重量變輕,但NMS種子胚乳正常且較重。通過重量分選機(jī),可以輕松、準(zhǔn)確地將保持系種子從NMS種子中分選出來,從而獲得純凈、飽滿的NMS種子。該系統(tǒng)以種子重量為篩選機(jī)制較之前用DsRed2的篩選機(jī)制,避免了因熒光信號(hào)弱而無法分選保持系種子與雄性不育系種子的問題。同時(shí)基于重量的分選機(jī)器較基于熒光的分選機(jī)器更為常見且成本低,工作效率更高[62]。此外,Pak等利用CRISPR/Cas9技術(shù)在中花11號(hào)(ZH11)中敲除OsOPR7基因,獲得了雄性不育突變體,經(jīng)過篩選得到了能夠通過外源施加茉莉酸甲酯恢復(fù)育性的雄性不育系[63]。
智能不育系以普通核不育系為基礎(chǔ),通過基因工程技術(shù)創(chuàng)制遺傳工程雄性不育系,完美解決了純雄性不育無法商業(yè)化生產(chǎn)的問題,具有育性穩(wěn)定和組配自由的優(yōu)點(diǎn),且生產(chǎn)的種子不含有轉(zhuǎn)基因成分,是創(chuàng)制優(yōu)良雜交水稻種質(zhì)、提高水稻產(chǎn)量的重要技術(shù)。
4 無融合生殖水稻的興起
一系法雜交水稻主要利用水稻無融合生殖,即不經(jīng)過減數(shù)分裂和雌雄配子融合而產(chǎn)生種子的繁殖方式。二倍體無融合生殖可使世代更迭但不會(huì)改變基因型,后代的遺傳構(gòu)成與母本相同,因此可以固定雜種優(yōu)勢,育成性狀不分離的雜交種。
2016年,Mieulet等在水稻中將3個(gè)減數(shù)分裂關(guān)鍵基因REC8、PAIR1和OSD1通過CRISPR/Cas9基因編輯產(chǎn)生的突變體兩兩雜交,成功地將減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪z分裂,創(chuàng)制出MiMe(Mitosis instead of Meiosis)材料,為在水稻中引入無融合生殖建立了基礎(chǔ)[64]。2018年,Khanday等發(fā)現(xiàn)AP2家族轉(zhuǎn)錄因子BBM1在受精后的胚胎發(fā)生過程中發(fā)揮中作用,卵細(xì)胞中異位表達(dá)BBM1基因可以觸發(fā)水稻孤雌生殖。將BBM1基因的異位表達(dá)與MiMe結(jié)合,可以得到雜交種子的克隆后代,且可進(jìn)行多代穩(wěn)定遺傳[65]。2019年,Wang等在水稻雜交種中同時(shí)編輯單倍體誘導(dǎo)基因OsMTL和MiMe相關(guān)基因,獲得了無融合生殖的Fix(fixation of hybrids)材料,獲得了雜交水稻的克隆種子,但克隆種子誘導(dǎo)率和結(jié)實(shí)率均偏低[66]。2022年,Vernet等優(yōu)化轉(zhuǎn)基因策略,獲得了克隆種子誘導(dǎo)率超過95%的無融合生殖株系[67]。2023年,王克劍團(tuán)隊(duì)利用擬南芥卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子pDD45驅(qū)動(dòng)BBM4,發(fā)現(xiàn)BBM4卵細(xì)胞異位表達(dá)植株可以誘導(dǎo)孤雌生殖,獲得了無融合生殖的Fix2植株。Fix2植株結(jié)實(shí)率與野生型相同,但克隆種子誘導(dǎo)率偏低(3.2%)[68]。2024年,Dan等在MiMe材料中利用擬南芥卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子AtDD45驅(qū)動(dòng)BBM1基因,在高結(jié)實(shí)率的情況下(6816%),獲得的克隆種子比率高達(dá)90.79%。該研究發(fā)現(xiàn),異位表達(dá)BBM1基因并結(jié)合MiMe會(huì)產(chǎn)生多胚現(xiàn)象(1粒種子含有多個(gè)胚)及孤雌生殖頻率的隔代遺傳現(xiàn)象,相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[69]。
5 展望
三系法和兩系法作為目前雜交水稻育種的主要手段,還有較大的改進(jìn)空間。三系法雜交水稻的育性受到恢保關(guān)系的制約,可供選擇的恢復(fù)系及保持系較少,雜交組合的選擇自由度低。兩系法育性轉(zhuǎn)換溫度偏高或不穩(wěn)定而導(dǎo)致的育性波動(dòng)是制約其可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前,光溫敏核不育系的不育基因資源來源相對單一,需要發(fā)掘更多的光溫敏核不育系,拓寬光溫敏不育系種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。最近的研究表明,一些水稻花粉育性調(diào)控基因的弱等位突變體表現(xiàn)為溫敏不育,這為兩系法雜交水稻的發(fā)展提供了新的思路[70-72]。
智能不育系在理論創(chuàng)新和技術(shù)儲(chǔ)備上都已達(dá)到實(shí)用化的程度。由于水稻種子有穎殼包裹,常用的紅色熒光篩選機(jī)制在水稻中的精準(zhǔn)度并不理想,容易在普通核不育系中混入含轉(zhuǎn)基因成分的保持系種子。另外,熒光分選機(jī)械的分選效率較低、操作復(fù)雜。因此,研發(fā)一臺(tái)高精度、高效率、操作簡便的分選機(jī)械是推動(dòng)以熒光分選為基礎(chǔ)的智能不育系系統(tǒng)發(fā)展的基礎(chǔ)。除了熒光分選機(jī)制以外,其他篩選機(jī)制例如基于種子重量和除草劑抗性等也是在構(gòu)建NMS系統(tǒng)時(shí)的優(yōu)良選擇。其中種子重量的變化對后代發(fā)育是否有影響還需進(jìn)一步研究,而除草劑的使用在田間生產(chǎn)中較為常見,不會(huì)影響水稻產(chǎn)量,且在苗期就可以實(shí)現(xiàn)分選。施用化學(xué)藥劑使雄性不育株恢復(fù)育性是創(chuàng)制不育系的創(chuàng)新思路,但化學(xué)復(fù)雄如何能不影響雜交后代種子的發(fā)芽率以及藥劑殘留是否會(huì)對人體健康產(chǎn)生影響,這都是需要考慮和解決的問題。
一系法的發(fā)展,是科學(xué)與工程結(jié)合的典范?;蚓庉嬍侄蔚膭?chuàng)新和作物功能基因組學(xué)的發(fā)展,使成功培育一系法雜交水稻逐漸成為可能。當(dāng)前,MiMe體系已經(jīng)非常成熟,獲得不重組的二倍體配子的效率達(dá)到 100%。孤雌生殖基因的發(fā)掘及改良(比如與MiMe結(jié)合后的實(shí)際效應(yīng))是一系法雜交水稻研究的重點(diǎn)。已有研究指出,克隆種子的比例與結(jié)實(shí)率存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,且克隆種子比例在代際之間存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象[69]。這些是一系法走向商業(yè)化應(yīng)用需要解決的問題。
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