孕穗期低溫脅迫下寒地水稻轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：為了明確寒地水稻孕穗期低溫應(yīng)答機(jī)制，以孕穗期耐冷性差異較大的龍粳25、龍粳11水稻品種為材料，對(duì)幼穗穎花開展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究。結(jié)果表明，在龍粳11中共檢測(cè)到9 468個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），在龍粳25中共檢測(cè)到6 784個(gè)DEG。其中3 508個(gè)DEG為二者共同表達(dá)，3 276個(gè)DEG在龍粳25中特異表達(dá)。GO富集分析表明，龍粳25、龍粳11的共有DEG主要富集在生物進(jìn)程調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、非生物刺激應(yīng)答等類別中，KEGG通路主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳代謝、淀粉蔗糖代謝等途徑。而龍粳25的特有DEG多富集在生物進(jìn)程調(diào)控、非生物刺激應(yīng)答、氧化還原反應(yīng)進(jìn)程等類別，KEGG通路主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、苯丙烷合成等途徑。綜上表明，寒地水稻對(duì)孕穗期的低溫應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜過程，包含多個(gè)代謝調(diào)控途徑及多個(gè)相應(yīng)基因。

關(guān)鍵詞：寒地；水稻；轉(zhuǎn)錄組；孕穗期低溫

中圖分類號(hào)：S511.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）19-0034-07

收稿日期：2023-10-31

基金項(xiàng)目：黑龍江省博士后面上資助項(xiàng)目（編號(hào)：LBH-Z21027）；黑龍江省省屬科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：CZKYF2023-1-C007、CZKYF2021-2-C002）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新跨越工程重大需求科技創(chuàng)新攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：CX23ZD01）；黑龍江省自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年項(xiàng)目（編號(hào)：YQ2021C033）。

作者簡(jiǎn)介：郭震華（1985—），男，內(nèi)蒙古集寧人，博士，副研究員，主要從事水稻分子育種研究。E-mail：hljsdsgzh@163.com。

通信作者：劉傳雪，碩士，研究員，主要從事水稻育種研究，E-mail：liuchuanxue2007@163.com；馮延江，博士，研究員，主要從事水稻育種栽培研究，E-mail：zixuanfeng2008@163.com。

水稻是全世界最重要的糧食作物之一^［1］，全球一半以上的人口以水稻為主食。水稻起源地多為熱帶或亞熱帶地區(qū)，因此對(duì)低溫十分敏感。通常認(rèn)為，秈稻低于18 ℃，粳稻低于15 ℃，就會(huì)對(duì)其正常生長(zhǎng)造成不利影響^［2］。目前，水稻冷害已然成為世界性問題，其中尤以日本、韓國(guó)及我國(guó)東北稻區(qū)最為突出^［3］。黑龍江省地處我國(guó)最北部，屬于寒地稻作區(qū)，是世界水稻栽培的北限，年平均氣溫為全國(guó)最低；低溫冷害是限制黑龍江水稻安全生產(chǎn)的重要因素。

水稻在全生育期內(nèi)都可能受到低溫冷害的威脅。孕穗期是花粉形成的關(guān)鍵時(shí)期，若遭受低溫會(huì)直接影響花粉發(fā)育，造成花粉不育或花粉管無法萌發(fā)，導(dǎo)致結(jié)實(shí)率下降，最終造成水稻減產(chǎn)^［4］。具體來說，以減數(shù)分裂期對(duì)低溫最為敏感；若此時(shí)遭遇低溫，水稻花粉壁上的絨氈層細(xì)胞不能正常降解，影響淀粉在花粉中的正常轉(zhuǎn)運(yùn)，花粉發(fā)育所需的能量供給不足，最終造成花粉敗育^［5-6］。

低溫脅迫除對(duì)結(jié)實(shí)率等直觀表型有影響外，對(duì)作物各方面生理功能都會(huì)造成一系列的影響，包括光合作用、能量代謝、滲透調(diào)節(jié)、過氧化物酶系統(tǒng)保護(hù)等^［7-8］。其中涉及到的不同代謝途徑中多個(gè)調(diào)控基因，均被報(bào)道在低溫脅迫應(yīng)答中起到不同的作用。Ctb1則是第1個(gè)通過圖位克隆得到的水稻孕穗期耐冷調(diào)控基因，該基因編碼1個(gè)F-box蛋白，通過與E3泛素連接酶亞基Skp1間的互作，來啟動(dòng)耐冷應(yīng)答反應(yīng)^［9］。Osmyb4被稱作水稻耐冷應(yīng)答的總開關(guān)，低溫脅迫下正向調(diào)控下游多個(gè)基因的表達(dá)^［10］。過氧化物酶基因OsPOX1、抗壞血酸過氧化物酶基因OsAPXa、過氧化氫酶基因OsCATC等均受低溫誘導(dǎo)^［11-13］。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是近年來在基因芯片、基因表達(dá)譜等技術(shù)上發(fā)展起來的新一代測(cè)序技術(shù)。與之前的測(cè)序方法相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序通量高，能夠快速全面地對(duì)某一物種的特定組織或器官在某一特定狀態(tài)下進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄本測(cè)序分析。目前此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用在多種作物中^［14-16］。在水稻低溫脅迫應(yīng)答方面，亦有眾多相關(guān)報(bào)道^［17-18］。本研究針對(duì)黑龍江的生態(tài)類型和氣候條件，以當(dāng)?shù)卦兴肫谀屠湫圆町愝^大的粳稻品種龍粳25（耐冷）、龍粳11（不耐冷）作為研究對(duì)象，通過在孕穗期低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，進(jìn)一步闡明黑龍江水稻孕穗期耐冷性的遺傳調(diào)控分子機(jī)制，探索發(fā)掘寒地水稻孕穗期耐冷調(diào)控基因，以期為后續(xù)耐冷分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所育成并提供的龍粳25、龍粳11，二者均為黑龍江省第三積溫區(qū)適宜種植品種，孕穗期耐冷性差異明顯。

1.2 材料種植

本研究采用盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所（下簡(jiǎn)稱水稻所）田間試驗(yàn)場(chǎng)。盆栽所需土壤均采自水稻所田間。土壤進(jìn)行干燥粉碎并過篩混勻后，裝入直徑34 cm、高35 cm的塑料桶中，每桶裝干土量約為12 kg。試驗(yàn)材料于2018年4月20日播種，待生長(zhǎng)到3葉1心時(shí)（5月15日），挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至塑料桶中，每桶均勻栽植15株。每品種分別種植12桶，各取6桶作為對(duì)照。生長(zhǎng)過程中，為保證各單株生育進(jìn)程一致，所有材料均不留分蘗，只留主莖。孕穗期判定依據(jù)Sato等的方法^［12］，略作改動(dòng)。當(dāng)劍葉與倒2葉的葉枕距達(dá)-4～0 cm時(shí)，即認(rèn)為其進(jìn)入孕穗期，并對(duì)該單株掛牌標(biāo)記。將同時(shí)進(jìn)入孕穗期的試驗(yàn)材料搬至光照培養(yǎng)箱（HPG-280，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）中，12 ℃低溫持續(xù)處理 2 d，相對(duì)濕度為75%，光—暗周期設(shè)定為8 h—16 h。低溫處理結(jié)束后，將試驗(yàn)材料移至正常環(huán)境生長(zhǎng)至成熟。收獲時(shí)計(jì)算結(jié)實(shí)率。

1.3 材料取樣及RNA抽提

取水稻穎花作為試驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。分別在未處理和低溫處理2 d的龍粳25、龍粳11中選取生育進(jìn)程一致的水稻主莖，剝出幼穗，取幼穗上1/3的穎花，從中挑取長(zhǎng)度為3～5 mm 的穎花，稱重約0.5 g，錫箔紙包裹，過液氮迅速冷凍，于-80 ℃保存，每處理重復(fù)3次。RNA抽提采用Trizol試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)）的，方法參照試劑盒提取說明，RNA的純凈和完整程度通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托北京百邁克生物技術(shù)有限公司（www.biomarker.com.cn）進(jìn)行。文庫(kù)構(gòu)建完成后，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后的文庫(kù)按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行pooling，用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)根據(jù)操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生 150 bp 的雙端reads。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)過濾及組裝

測(cè)序后下機(jī)產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（Raw Data）通常以FASTQ格式提供。過濾掉包含接頭的低質(zhì)量數(shù)據(jù)后即為可用數(shù)據(jù)（clean reads），通過Q20、Q30、GC 含量以及序列重復(fù)水平等參數(shù)來評(píng)估所得可用數(shù)據(jù)能否用于進(jìn)一步分析。以O(shè)ryza sativa L. ssp. japonica （Oryza sativa IRGSP-1.0）作為本試驗(yàn)水稻的參考基因組，通過TopHat2將可用數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上。以FPKM 值判定轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平。

1.6 差異表達(dá)基因的篩選及生物信息學(xué)分析

通過DEGseq2軟件分析基因表達(dá)水平。參數(shù)設(shè)置具體為|log₂ Fold Change （FC）|≥1，1 discovery rate （FDR）≤0.01。GO功能分類中基因以及基因數(shù)目的篩選是基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.geneontology.org/）的映射完成。GO功能富集是通過GOSeq R軟件包，以Wallenius 非中心超幾何分布檢驗(yàn)進(jìn)行分析。KEGG Pathway 的富集分析是通過KOBAS軟件（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進(jìn)行。GO及KEGG的富集標(biāo)準(zhǔn)皆為P≤0.01。

1.7 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

選用Thermo Fisher Scientific公司的Trizol試劑盒，分別對(duì)龍粳25、龍粳11在處理前（0 d）和處理后（2 d）的穎花進(jìn)行抽提RNA，穎花選取部位及方法同“1.3”節(jié)。純化后的RNA通過 HiScript Q RT SuperMix for qPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。選取表達(dá)差異大的基因，通過primer3軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），以actin為內(nèi)參。qRT-PCR反應(yīng)在ABI 7500 qPCR thermal cycler （Applied Biosystems Inc.，Carlsbad，CA，USA）儀器上運(yùn)行，重復(fù)3次，通過2^-ΔΔC_T法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量變化。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用WPS Office分析數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（α=0.05），用GraphPad Prism 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕穗期低溫下結(jié)實(shí)率變化

孕穗期低溫直接影響水稻的結(jié)實(shí)率。通過對(duì)龍粳25、龍粳11在孕穗期進(jìn)行12 ℃低溫處理2 d，由圖1可以看出，未經(jīng)過低溫處理時(shí)，龍粳25、龍粳11的結(jié)實(shí)率分別為94.5%、93.05%，二者間未有明顯差異。當(dāng)?shù)蜏靥幚? d后，龍粳25的結(jié)實(shí)率為89.27% 較對(duì)照未有明顯降低。而龍粳11在低溫處理2 d后，結(jié)實(shí)率降為37.85%，較對(duì)照呈極顯著降低?？梢钥闯?，龍粳25、龍粳11在正常環(huán)境中結(jié)實(shí)率沒有明顯差異，低溫是造成二者結(jié)實(shí)率差異的原因，并且龍粳25的孕穗期耐冷性要明顯強(qiáng)于龍粳11。

2.2 測(cè)序結(jié)果組裝分析

本研究通過對(duì)龍粳25、龍粳11低溫處理2 d的穎花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共構(gòu)建12個(gè)文庫(kù)，去掉raw reads，共得到689.23 Mb的clean reads，GC含量為54.52%～56.58%，Q30均高于91.10%，平均81.70%的clean reads比對(duì)到參考基因組上（表2）。以上結(jié)果表明，龍粳25、龍粳11的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)分析。

2.3 差異表達(dá)基因識(shí)別與分析

低溫處理下，基因的表達(dá)量會(huì)根據(jù)自身對(duì)低溫的敏感程度發(fā)生相應(yīng)變化，其差異表達(dá)程度可反映對(duì)低溫的敏感度。因此，在數(shù)據(jù)質(zhì)控分析之后，進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由圖2-a可知，以|log₂ FC|≥1，F(xiàn)DR≤0.01為篩選閾值，在龍粳11中，低溫處理2 d后共有9 468個(gè)DEG，其中包括上調(diào)表達(dá)基因 4 915 個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因4 553個(gè)。而在龍粳25中，低溫處理2 d后共有6 784個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生變化，其中包括上調(diào)表達(dá)基因3 499個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因 3 285 個(gè)（圖2-b）。進(jìn)一步通過韋恩圖（圖2-c）分析可以看出，龍粳25、龍粳11共有的DEG數(shù)目為3 508個(gè)，而龍粳25、龍粳11中特有的DEG分別為3 276、5 960個(gè)。結(jié)果表明，低溫處理2 d后，龍粳11的DEG數(shù)目明顯多于龍粳25，表明龍粳11對(duì)低溫更為敏感，低溫反應(yīng)更加明顯。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

通過分析DEG的韋恩圖，發(fā)現(xiàn)有3 508個(gè)DEG是龍粳25、龍粳11在低溫處理后共有的，而在龍粳25中有3 276個(gè)DEG是其低溫下特有的。為近一步明確其功能分類，對(duì)這些基因分別展開GO富集分析。通過對(duì)二者共有的DEG進(jìn)行GO分析，以KS≤0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，生物進(jìn)程、細(xì)胞組分、分子功能的GO功能類別明顯富集到的類別分為95、20、41條。圖3-a分別列出每個(gè)類別中含有基因數(shù)最多的前20條terms。生物進(jìn)程方面，主要富集在生物進(jìn)程調(diào)控（GO：0050789，631個(gè)DEG）、氧化還原反應(yīng)（GO：0055114，301個(gè)DEG）、非生物刺激應(yīng)答（GO：0009628，302個(gè)DEG）、蛋白磷酸化（GO：0006468，279個(gè)DEG）等類別中。細(xì)胞組分方面，主要富集在膜（GO：0016020，967個(gè)DEG）、細(xì)胞質(zhì)膜包圍的囊泡（GO：0016023，773個(gè)DEG）、原生質(zhì)膜（GO：0005886，427個(gè)DEG）、細(xì)胞核（GO：0005634，382個(gè)DEG）等類別中。在分子功能方面，主要富集在ATP結(jié)合功能（GO：0005524，439個(gè)DEG）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性（GO：0004674，211個(gè)DEG）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（GO：0005215，189個(gè)DEG）、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄（GO：0003700，156個(gè)DEG）等類別中。

由于龍粳25具有孕穗期強(qiáng)耐冷性，為了發(fā)現(xiàn)其低溫下特有的功能類別，對(duì)其特有的DEG進(jìn)行GO富集分析。同樣以KS≤0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，明顯富集到的生物進(jìn)程、細(xì)胞組分、分子功能的GO功能類別分別為67、24、32條。由圖3-b可見，在生物進(jìn)程方面，龍粳25特有基因多富集在生物進(jìn)程調(diào)控（GO：0019222，226個(gè)DEG）、非生物刺激應(yīng)答（GO：0009628，222個(gè)DEG）、氧化還原反應(yīng)（GO：0055114，215個(gè)DEG）、碳水化合物代謝過程（GO：0005975，176個(gè)DEG）等類別中。在細(xì)胞組分方面，龍粳25特有基因富集最多的前4條類別與龍粳25、龍粳11共有基因富集的類別相同，而所包含的基因數(shù)則分別為723、613、324、289個(gè)。在分子功能方面，龍粳25特有基因主要富集在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（GO：0004674，158個(gè)DEG）、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄（GO：0003700，90個(gè)DEG）、轉(zhuǎn)移酶活性/轉(zhuǎn)移糖基（GO：0016757，81個(gè)DEG）、血紅素結(jié)合部位（GO：0020037，69個(gè)DEG）等類別中。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

為近一步探明低溫對(duì)寒地水稻代謝途徑的影響，更加明確地闡釋DEG的生物學(xué)功能，對(duì)龍粳25、龍粳11低溫處理下共有的DEG以及龍粳25特有的DEG分別進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果表明，二者共有的3 508個(gè)DEG明顯富集到112個(gè)KEGG通路中。通過列出富集程度最高的前20個(gè)通路（圖4-a）可以看出，DEG主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075，46個(gè)DEG，富集因子1.81）、碳代謝（ko01200，44個(gè)DEG，富集因子1.61）、淀粉蔗糖代謝（ko00500，43個(gè)DEG，富集因子1.86）、苯丙烷合成（ko00940，35個(gè)DEG，富集因子1.61）、糖酵解/糖原異生通路（ko00010，33個(gè)DEG，富集因子2.67）等途徑。而在龍粳25特有的DEG中，共富集到110個(gè)KEGG通路中。同樣列出富集程度最高的前20個(gè)通路，DEG多富集在植物激素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075，41個(gè)DEG，富集因子1.94）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工（ko04141，34個(gè)DEG，富集因子1.61）、苯丙烷合成（ko00940，32個(gè)DEG，富集因子1.76）、氨基糖和核酸糖代謝（ko00520，21個(gè)DEG，富集因子1.87）、谷胱甘肽代謝（ko00480，17個(gè)DEG，富集因子2.10）等通路中（圖4-b）。綜合比較2個(gè)部分KEGG通路，發(fā)現(xiàn)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）在龍粳25、龍粳11共有DEG及龍粳25特有DEG中都被明顯富集到含DEG均為最多的通路，表明這條通路在寒地水稻低溫脅迫應(yīng)答中起著重要的作用。

2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)選取6個(gè)表達(dá)差異大的基因進(jìn)行qRT-PCR分析。分別以龍粳11未做低溫處理時(shí)的各個(gè)基因表達(dá)量作為對(duì)照（相對(duì)表達(dá)量為1），qRT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)過低溫處理后2個(gè)品種的6個(gè)基因表達(dá)均產(chǎn)生差異變化；與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比，雖然基因表達(dá)量的變幅與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果不盡一致，但變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果均一致，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性（圖5）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過RNA-seq技術(shù)對(duì)寒地水稻低溫下展開轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較2個(gè)品種低溫脅迫后的差異表達(dá)基因。研究結(jié)果表明，低溫脅迫后，龍粳11的DEG為9 468個(gè)，龍粳25為6 784個(gè)；低溫處理后，龍粳11的DEG明顯多于龍粳25，表明龍粳11對(duì)低溫更加敏感，而龍粳25對(duì)低溫則表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，這也可以從二者在低溫下的結(jié)實(shí)率得到驗(yàn)證。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，生物進(jìn)程調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、非生物刺激應(yīng)答、蛋白磷酸化等GO類別的反應(yīng)比較大。KEGG富集分析得出，檸檬烯和蒎烯的降解、糖酵解/糖異生、半乳糖代謝、（角質(zhì)、木質(zhì)、蠟質(zhì)）生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑在低溫脅迫后富集的程度最高。以上分析表明，低溫對(duì)寒地水稻的影響涉及到生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，包括各類復(fù)雜的新陳代謝變化。

本研究所用的材料為孕穗期耐冷的龍粳25和不耐冷的龍粳11，在探究寒地水稻特有的低溫應(yīng)答防御機(jī)制及相關(guān)基因時(shí)，龍粳25特有的DEG及其GO類別值得進(jìn)一步深入研究。本研究中，龍粳25富集到67條生物進(jìn)程、24條細(xì)胞組分、32條分子功能類別。由于生物進(jìn)程能夠直接反映生物體生長(zhǎng)發(fā)育情況，對(duì)此類別展開分析。氧化還原反應(yīng)進(jìn)程不但在二者共有的DEG中得到明顯富集，并且在龍粳25特有的DEG中也被明顯富集，表明此GO類別在寒地水稻低溫應(yīng)答中起重要作用。

植物體內(nèi)源激素雖然含量很低，但是在生物脅迫、非生物脅迫等眾多脅迫因子方面起到積極的防衛(wèi)作用^［19］。目前研究較多的激素包括脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、生長(zhǎng)素（IAA）、乙烯（ETH）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、細(xì)胞分裂素（CK）、油菜素內(nèi)酯（BR）等^［20］。而IAA、ABA、ETH等激素在水稻低溫應(yīng)答中起積極作用^［21-22］。本研究中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在龍粳11、龍粳25共有的DEG以及龍粳25特有的DEG都被明顯富集，且含有基因數(shù)也是最多的，表明此通路在寒地水稻低溫應(yīng)答中同樣起關(guān)鍵調(diào)控作用，這一結(jié)果也與前人研究結(jié)果^［23］一致。

低溫脅迫會(huì)對(duì)水稻植株的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生各種生理及分子調(diào)控機(jī)制方面的影響；水稻通過自身調(diào)整，盡可能適應(yīng)溫度脅迫，以保持其正常生長(zhǎng)^［24-25］。黑龍江地處寒稻作區(qū)，由于其特殊的地理環(huán)境及生態(tài)類型，低溫是寒地水稻正常生長(zhǎng)的重要限制因子^［26］。本研究以寒地水稻孕穗期耐冷差異明顯的品種龍粳25、龍粳11為研究材料，在前人對(duì)其結(jié)實(shí)率研究的基礎(chǔ)上，對(duì)低溫脅迫下穎花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。通過差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)龍粳11的DEG數(shù)量明顯多于龍粳25，表明龍粳11對(duì)低溫反應(yīng)更為敏感。GO、KEGG分析表明，氧化還原反應(yīng)進(jìn)程、低溫應(yīng)答、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等眾多GO類別及KEGG通路均參與到低溫脅迫應(yīng)答中。此外，通過qRT-PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證了RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，期待本研究結(jié)果對(duì)寒地水稻孕穗期耐冷的分子遺傳調(diào)控機(jī)理的解析有一定的推動(dòng)作用。

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