石榴TIFY基因家族的全基因組鑒定與表達分析

摘要：TIFY轉錄因子在植物生長發(fā)育和逆境響應中起重要作用。以石榴基因組數據為基礎，利用生物信息學方法，開展TIFY轉錄因子的鑒定，并進行蛋白理化性質、系統(tǒng)進化關系、保守基序、基因結構、表達模式、順式作用元件分析。結果表明，在石榴基因組中共鑒定到16個TIFY基因，可分為ZML、JAZ、TIFY、PPD這4個亞家族。PgTIFY基因結構存在明顯差異，其中ZML亞家族基因結構最復雜。表達分析結果表明，PgTIFY2、PgTIFY3、PgTIFY7、PgTIFY10、PgTIFY12在葉片中高表達；PgTIFY1、PgTIFY4、PgTIFY5、PgTIFY8、PgTIFY13、PgTIFY16在根中高表達；PgTIFY15、PgTIFY11在花中高表達。JAZ亞家族基因在鹽脅迫和ABA處理組織中差異表達。16個PgTIFY基因啟動子均含有低溫、干旱、缺氧等脅迫響應元件和茉莉酸甲酯、ABA、生長素、JA相關激素響應元件類型。推測PgTIFY基因家族可能在石榴果實發(fā)育、逆境響應、激素信號調控等方面發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：石榴；TIFY基因家族；表達分析；順式作用元件

中圖分類號：S665.401" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0041-10

收稿日期：2023-11-03

基金項目：國家自然科學地區(qū)基金（編號：42161015）；云南省教育廳科學研究基金（編號：2023J1115）。

作者簡介：李曉靜（1986—），女，河南洛陽人，博士，講師，主要從事果樹栽培學方面的教學與研究。E-mail：lanmeixj@163.com。

通信作者：岳亮亮，博士，助理研究員，主要從事植物學、生物地理學、濕地學、分子生態(tài)學方面的教學與研究。E-mail：yueliangliang@swfu.edu.cn。

石榴（Punica granatum L.）是千屈菜科石榴屬的果樹。石榴果實味美可口，含有豐富的維生素和酚類化合物。云南蒙自是我國石榴八大主產區(qū)之一。蒙自石榴因其個頭大、籽實飽滿、肉厚核小、晶瑩如珠、汁多蜜甜而備受推崇。然而，與其他果樹相似，石榴在栽培過程中經常面臨高鹽、干旱、營養(yǎng)不足、病菌感染等環(huán)境因素的影響。這些因素會限制石榴的生長和發(fā)育，對其產量和品質產生嚴重影響。因此，研究石榴中非生物脅迫響應基因，將有助于改良其脅迫耐受性，以應對日益嚴峻的環(huán)境挑戰(zhàn)。

轉錄因子是整個活細胞中的主要調節(jié)蛋白，它與目標基因兩側的DNA結合，在調節(jié)基因表達和植物對環(huán)境條件的反應方面發(fā)揮重要作用^［1］。TIFY是一個特殊的基因家族，參與植物防御和生長調節(jié)^［2］。TIFY基因家族含有1個高度保守的基序（TIF［F/Y］XG），可分為4個亞家族，即TIFY、JAZ、ZML、PPD亞家族。該家族除了TIFY亞家族只有TIFY結構域外，其他3個亞家族的成員都擁有一些額外的結構域。如ZML亞家族蛋白還擁有1個GATA鋅指DNA結構域和1個CCT結構域。JAZ亞家族蛋白有1個CCT結構域。而PPD亞家族蛋白在N端含有1個典型的PPD結構域^［2］。

Nishii等從擬南芥中鑒定出首個TIFY基因^［3］，隨后TIFY基因陸續(xù)在小麥^［4-5］、大豆^［6］、楊樹^［7］、桃^［8］、丹參^［9］、十字花科植物^［10-11］、西瓜^［12］、葡萄^［13］、木薯^［14］、玉米和番茄^［15］等植物中被鑒定出來。近期研究表明，TIFY基因家族參與眾多生物學過程，如開花時間^［16］、次生代謝物質的合成^［9］、茉莉酸信號轉導^{［13-14，17］}、鹽脅迫^{［4，6］}、重金屬脅迫^［18］等非生物脅迫過程。在番茄、玉米上有關TIFY基因家族的分析表明，TIFY基因參與了植物生殖、代謝、應激反應、細胞信號轉導等過程^［15］。在木薯上的研究表明，大多數JAZ亞家族基因對茉莉酸（JA）有響應，特別是MeJAZ1、MeJAZ13、MeJAZ14在滲透、鹽、鎘脅迫處理后，其表達水平上調^［14］。在西瓜基因組中，共鑒定到15個TIFY基因，包括PPD亞族1個、TIFY亞族2個、ZML亞家族4個、JAZ亞家族8個。定量表達分析結果表明，9個TIFY基因對JA、鹽、干旱脅迫有響應。其中，JA能激活8個基因，抑制1個基因，尤其是能夠誘導ClJAZ1、ClJAZ7的表達^［12］。

由此可見，TIFY在植物生長發(fā)育、代謝物調控、生物和非生物脅迫中具有重要作用。本研究以石榴基因組數據為基礎，采用生物信息學方法對TIFY基因家族進行鑒定，并進行系統(tǒng)進化關系、保守基序、基因結構、表達模式、順式作用元件分析，以期進一步了解TIFY基因在石榴生長發(fā)育和非生物脅迫中的作用，并為石榴育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2023年3月至2024年1月在紅河學院生物科學與農學學院實驗室完成。

1.2 數據下載

從NCBI下載突尼斯軟籽石榴（Punica granatum L.）基因組數據。利用PlantTFDB數據庫下載擬南芥^［19］、水稻^［20］、蘋果^［21］、葡萄^［13］TIFY蛋白序列，并根據相關參考文獻進行命名。

1.3 石榴TIFY基因家族成員的鑒定及蛋白理化性質分析

從Pfam數據庫下載TIFY-family模型，通過HMMER軟件篩選PgTIFY。利用SMART、Batch Web CD-Search Tool 在線軟件，將鑒定到的PgTIFY蛋白進行基因保守結構域預測。綜合所得結果，獲得石榴TIFY候選基因，并根據其在染色體上的位置進行命名。利用ExPASy對石榴TIFY家族成員進行蛋白理化性質分析。

1.4 系統(tǒng)進化樹的構建

利用Clustal W將石榴候選蛋白與擬南芥、蘋果、水稻、葡萄蛋白進行多序列比對，使用MEGA X軟件，采用NJ（neighbor-joining）法（Bootstrap=1 000）構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 石榴TIFY蛋白結構及保守基序分析

用MEME （http：//meme.sdsc.edu/meme/ meme-in.tro.html）在線軟件、TBtools分析石榴TIFY蛋白的motif模式，并進行可視化分析^［22］。參數設置：保守基序個數為10，保守基序最佳匹配長度為 6～100，其他參數設置為默認。

1.6 石榴TIFY基因家族基因結構分析

根據所得石榴TIFY基因蛋白序列和石榴GFF3數據，利用TBtools工具進行石榴TIFY基因結構分析。

1.7 石榴TIFY基因家族的表達分析

從NCBI下載石榴不同組織和不同發(fā)育階段的轉錄組數據^［23］、不同非生物脅迫處理的轉錄組數據^［24-25］。利用TBtools繪制基因表達熱圖。

1.8 石榴TIFY基因啟動子順式作用元件預測

通過基因組序列和結構注釋文件，提取TIFY基因上游2 kb序列作為啟動子區(qū)域，將啟動子序列提交PlantCare在線軟件，進行順式作用元件的預測，并通過TBtools軟件進行可視化分析。

2 結果分析

2.1 石榴TIFY基因家族成員的鑒定及蛋白理化性質分析

綜合Pfam、Batch Web CD-Search Tool、SMART的分析結果，共從石榴基因組中鑒定到16個TIFY蛋白。利用ExPASy在線軟件對其蛋白理化性質進行分析，結果如表1所示。PgTIFY蛋白長度為126 （PgTIFY15）～452 （PgTIFY3） aa不等；蛋白分子量為14.13（PgTIFY11）～47.04（PgTIFY3）ku。其等電點介于4.87～10.17之間，其中5個蛋白等電點lt;7，偏酸性；其余11個PgTIFY蛋白等電點gt;7，偏堿性。PgTIFY蛋白的不穩(wěn)定指數介于 38.78～83.03之間，脂肪族氨基酸指數在56.40～82.19之間，Gravy值在-0.869～-0.299范圍內變化，總平均親水性均小于0，表明PgTIFY蛋白均為親水性蛋白。

2.2 系統(tǒng)進化分析

為探索PgTIFY基因與其他植物中TIFY的進化關系，對擬南芥、石榴、水稻、蘋果、葡萄5個物種的92個TIFY序列進行系統(tǒng)進化分析，結果如圖1所示。TIFY蛋白可分為4個亞家族（ZML、PPD、JAZ、TIFY）。JAZ亞家族是最大的分支，有72個成員。在這個亞家族中，24個蘋果TIFY、11個葡萄TIFY、12個擬南芥TIFY、15個水稻TIFY、10個石榴TIFY聚在一起（圖1）。JAZ亞家族又可劃分為6個小亞族。ZML亞家族和PPD亞家族都有7個成員組成。TIFY亞家族的成員數目最少，為6個，分別由3個蘋果TIFY、1個葡萄TIFY、1個擬南芥TIFY、1個石榴TIFY組成。在ZML亞家族、PPD亞家族都不存在水稻的同源基因。為了解石榴TIFY基因的系統(tǒng)進化關系，構建進化樹，如圖2-A所示：16個PgTIFY蛋白可分為ZML亞家族（PgTIFY1、PgTIFY9、PgTIFY2、PgTIFY10）、PPD亞家族（PgTIFY12）、JAZ亞家族（PgTIFY4、PgTIFY6、PgTIFY7、PgTIFY8、PgTIFY11、PgTIFY5、PgTIFY13、PgTIFY14、PgTIFY15、PgTIFY16）、 TIFY亞家族（PgTIFY3）。JAZ亞家族又可以進一步劃分為6個小亞族，分別為JAZⅠ（PgTIFY14）、JAZⅡ（PgTIFY7）、JAZⅢ（PgTIFY15、PgTIFY4、PgTIFY11）、JAZⅣ（PgTIFY6）、JAZⅤ（PgTIFY8、PgTIFY13）、JAZⅥ（PgTIFY5、PgTIFY16）。

2.3 石榴TIFY蛋白保守結構域分析

通過MEME程序共獲得10個保守基序，結果如圖2-B、圖3所示。motif 1是所有PgTIFY蛋白共有的。如圖4-A所示，motif 1為TIFY結構域，如圖4-B所示，motif 2是Jas結構域，該結構域缺少末端保守的脯氨酸和酪氨酸，motif 2在除TIFY亞家族（PgTIFY3）外的所有蛋白中都存在。motif 3是GATA鋅指結構（圖4-C）。motif 4是CCT結構域（圖4-D），是ZML亞家族特有的基序。ZML亞家族（PgTIFY1、PgTIFY9、PgTIFY2、PgTIFY10）均含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 4、motif 5、motif 10。PgTIFY1與PgTIFY9在進化樹上親緣關系最近，兩者的motif 組成和順序完全相同，除含有ZML亞家族共同的保守序列外，兩者都含有motif 6、motif 9。PgTIFY2與PgTIFY10在進化樹上親緣關系最近，兩者的序列組成和順序完全相同。JAZⅥ亞家族（PgTIFY5、PgTIFY16）除含有motif 1、motif 2外，還含有motif 7。JAZV亞家族（PgTIFY8、PgTIFY13）均含有motif 1、motif" 2、motif" 8、motif 6。JAZⅢ亞家族（PgTIFY15、PgTIFY4、PgTIFY11）只含有motif 1、motif 2。PgTIFY3的結構最簡單，只含有motif 1、motif 8。同一亞家族內的motif組成和分布相對保守，但不同亞家族間存在顯著差異。

2.4 石榴TIFY基因家族內含子/外顯子結構分析

石榴TIFY基因外顯子/內含子結構分析結果如圖2-C所示。不同亞家族的PgTIFY在基因結構上存在差異，外顯子的數量和內含子的長度差異較大。如在JAZV亞家族中，PgTIFY8有5個外顯子；PgTIFY13有6個外顯子；JAZⅡ亞家族成員PgTIFY7有7個外顯子，JAZⅠ亞家族成員PgTIFY14有8個外顯子，在JAZⅢ亞家族中PgTIFY11、PgTIFY15有3個外顯子；而PgTIFY4只有1個外顯子。PPD亞家族成員PgTIFY12有9個外顯子。石榴ZML亞家族基因的外顯子數目最多，為10。同一亞家族中的一些成員具有相似的外顯子數，但外顯子長度不同，如PgTIFY1、PgTIFY9內含子/外顯子結構相似，PgTIFY2、PgTIFY10的內含子/外顯子結構相似。

2.5 石榴PgTIFY基因組織表達分析

利用轉錄組數據開展16個PgTIFY基因的表達分析，結果如圖5所示，16個PgTIFY基因在不同組織和器官中差異表達。13個PgTIFY基因在所有組織中都表達，3個基因在大多數的組織中不表達或低表達。PgTIFY2、PgTIFY3、PgTIFY7、PgTIFY10、PgTIFY12在葉片中高表達；PgTIFY1、PgTIFY4、PgTIFY5、PgTIFY8、PgTIFY13、PgTIFY16在根中高表達；PgTIFY15、PgTIFY11在花中高表達，在其他組織中不表達或低表達。

2.6 石榴PgTIFY基因誘導表達分析

不同誘導處理下PgTIFY基因的表達模式如圖6、圖7所示。NaCl處理后PgTIFY1、PgTIFY11、PgTIFY14、PgTIFY9幾乎在所有處理中都低表達，特別是PgTIFY11在葉片中不表達。PgTIFY5、PgTIFY6、PgTIFY16在大多數處理中高表達。大多數基因在根中的表達比在葉片中的表達高。不同濃度的脫落酸（ABA）處理后，PgTIFY基因的表達模式不同。PgTIFY1、PgTIFY2、PgTIFY9、PgTIFY11、PgTIFY14低表達。不同濃度的ABA處理后，PgTIFY3、PgTIFY7、PgTIFY10、PgTIFY12的表達變化不大。

2.7 石榴PgTIFY基因啟動子順式作用元件分析

利用石榴基因組數據，提取TIFY基因ATG上游2 000 bp的序列開展啟動子分析，結果如圖8所示。16個基因的啟動子含有豐富的順式元件，包括光響應元件、厭氧響應元件、低溫響應元件、激素響應順式元件、應激響應順式元件。推測PgTIFY基因可能受到ABA、茉莉酸甲酯、生長素、JA的強烈調控。此外在PgTIFY基因的啟動子區(qū)域發(fā)現了MYC順式元件和MYB（MBSI、MRE、MBS）的特異性結合位點，這些位點參與調節(jié)類黃酮的生物合成、光響應和各種脅迫。

3 討論和結論

隨著基因組測序技術的發(fā)展，在楊樹^［7］、玉米^［26］、番茄^［15］、葡萄^［13］、獼猴桃^［27］、蘋果^［21］、大麥^［28］等植物上都開展了TIFY基因家族的功能研究。石榴基因組測序的完成為開展石榴相關基因家族的研究提供了可能。本研究基于石榴基因組數據庫，開展TIFY基因家族生物信息學分析，共鑒定到16個TIFY基因，包括1個TIFY亞家族蛋白、10個JAZ亞家族蛋白、1個PPD亞家族蛋白、4個ZML亞家族蛋白。在楊樹^［7］、玉米^{［15，26］}、葡萄^［13］、西瓜^［12］、桃^［8］、蘋果^［21］上分別鑒定到24、47、19、15、16、30個TIFY基因。石榴TIFY基因的數目同葡萄^［13］、西瓜^［12］、桃^［8］相差不大，但比蘋果^［21］、玉米^{［15，26］}少很多。

TIFY是一個植物特異性轉錄因子家族，以TIFY結構域為特征^［2］。根據保守結構域的不同，TIFY轉錄因子被劃分為TIFY、JAZ、PPD、ZML這4個亞家族。然而，并非所有的亞家族都存在于每個物種中。例如，PPD亞家族在一些單子葉植物中不存在^［20］。本研究中構建的系統(tǒng)進化樹中，PPD亞家族就不包含水稻基因。同其他雙子葉植物上的研究結果一致，石榴TIFY被劃分為4個亞家族，但不同亞族在基因數量上差別較大。在葡萄中鑒定到2個TIFY亞家族基因、2個PPD亞家族基因、4個ZML亞家族基因、11個JAZ亞家族基因^［13］。在桃子中鑒定到1個TIFY亞家族基因、1個PPD亞家族基因、5個ZML亞家族基因、9個JAZ亞家族基因^［8］。在蘋果中鑒定到8個TIFY亞家族基因、2個PPD亞家族基因、2個ZML亞家族基因、18個JAZ亞家族基因^［21］。與葡萄、桃、蘋果上的研究結果一致，石榴的JAZ亞家族成員多于ZML亞家族。在石榴基因組中，共鑒定到10個JAZ亞家族基因、4個ZML亞家族基因、 1個PPD亞家族基因、1個TIFY亞家族基因。石榴中共鑒定到10個JAZ亞家族蛋白，該亞家族蛋白相似度較低，序列長度為126～385 aa。JAZ亞家族蛋白序列的多樣性在葡萄^［13］、蘋果^［21］上都有報道，推測JAZ亞家族基因在陸生植物進化過程中發(fā)生了分化，并經歷了大的突變。

內含子/外顯子基因結構多樣化的機制包括外顯子/內含子增減、外顯子化/假外顯子化、插入/刪除3種機制^［29］。同西瓜上的研究結果^［12］相似，ZML亞家族蛋白序列長且內含子的數目比其他亞家族多。此外，同一亞家族的基因結構相似，但內含子的數目不同，表明ZML亞家族在進化的過程中發(fā)生了內含子丟失事件，造成基因功能的差異。此外，JAZ亞家族內含子/外顯子結構差異更大。但PgTIFY5、PgTIFY16的內含子數目和長度相對保守，表明這2個基因的功能有可能相同。內含子/外顯子的丟失及其長度的差異，可能造成TIFY基因功能的差異。MEME分析共鑒定到10個motif，一些motif是亞家族特有的；motif的不同造成石榴TIFY基因功能的分化。

TIFY基因參與植物的多個生長發(fā)育過程，如調控植物的開花時間^［16］、次生代謝物質的合成^［9］和果實的發(fā)育等生物學過程^{［8，27］}。在桃上的研究結果表明，PpJAZ1、PpJAZ4、PpJAZ5受MeJA調控，并且與果皮色素含量正相關，而PpZML1、PpZML13與果皮色素含量負相關。MdJAZ9、MdJAZ10、MdJAZ18在根、莖、葉片、花中高表達，而在果實、種子中低表達^［8］。PgTIFY6、PgTIFY7、PgTIFY5、PgTIFY16是MdJAZ9、MdJAZ10、MdJAZ18的同源基因，在根、葉片、花中高表達，而在果實的不同組織和種子的不同發(fā)育階段低表達。MdJAZ5、MdJAZ6在花中不表達，而MdJAZ12、MdJAZ15在除果實外的其他組織中表達^［8］。PgTIFY5、PgTIFY16是同源基因，具有相似的表達趨勢，在根、授粉后50 d的果皮和花中高表達。PgTIFY2、PgTIFY10是同源基因，在果實的不同組織和不同發(fā)育時期組成性表達，在葉片中高表達。PgTIFY1、PgTIFY9是同源基因，在所有器官中低表達。同一個亞家族的基因具有相似的表達模式，這表明基因的功能相對保守。

此外，TIFY作為植物的特異轉錄因子，在調控植物應對不利環(huán)境中起關鍵作用^{［4，10-12，20］}。在小麥中，有5個JAZ基因在鹽脅迫下被誘導^［5］。在大豆中GmTIFY10e、GmTIFY10g受鹽脅迫誘導，將GmTIFY10e、GmTIFY10g在擬南芥和大豆中過表達，可以提高植株對鹽脅迫的耐受性^［6］。ZML亞家族基因PgTIFY1、PgTIFY9在所有處理和組織中都低表達。PgTIFY2、PgTIFY10在所有處理和組織中都中度表達。大多數的JAZ亞家族基因，在鹽脅迫處理和組織中高表達，且JAZ亞家族基因在根中高表達，在葉片中低表達；推測鹽脅迫處理后，根中的TIFY基因對NaCl更敏感^［25］。有趣的是，鹽脅迫處理后3 d，PgTIFY5、PgTIFY16在葉片和根中的表達降低，鹽脅迫處理后6 d表達量升高。總體而言，ABA處理抑制了PgTIFY基因的表達。相對而言，PgTIFY1、PgTIFY9在不同濃度ABA處理的樣品中表達量低，而JAZ亞家族基因在ABA處理的樣品中高表達；但隨著ABA濃度的增加，大多數基因表達量降低；特別是60 μmol/L ABA濃度下，大多數基因表達量最低。如PgTIFY4、PgTIFY5、PgTIFY6、PgTIFY8、PgTIFY13、PgTIFY15、PgTIFY16。PgTIFY8與PgTIFY13是同源基因，兩者的表達趨勢一樣，即30 μmol/L ABA濃度下，基因表達量最高，60 μmol/L ABA濃度下，基因表達量最低。PgTIFY1和PgTIFY9、PgTIFY2和PgTIFY10、PgTIFY5和PgTIFY16、PgTIFY8和PgTIFY13，這4對同源基因具有相同的表達趨勢，推測同源基因對之間的功能是相同的?；虻谋磉_結果同系統(tǒng)進化樹的結果相一致，證明該研究結果具有可靠性。

啟動子在植物適應環(huán)境中起重要作用。啟動子順式作用元件分析結果表明：石榴TIFY基因的啟動子上含有大量ABRE、TCA、GARE、MBS等參與激素信號轉導和脅迫的元件，但不同成員之間所含有的元件種類和個數均不同，推測PgTIFY響應激素的種類和程度不同，進而導致PgTIFY之間功能的差異。此外，16個PgTIFY基因均含有干旱脅迫、低溫脅迫、厭氧脅迫等脅迫響應元件。由此可見，PgTIFY基因家族成員可能在石榴逆境脅迫反應及激素信號調控等方面發(fā)揮重要作用。

本研究在石榴基因組中共鑒定到16個PgTIFY基因，16個PgTIFY蛋白可分為ZML（4個）、JAZ（10個）、TIFY（1個）、PPD（1個）亞家族。PgTIFY基因結構存在明顯差異，同一亞家族的基因具有較相似的基因結構和表達模式。PgTIFY基因在不同組織和發(fā)育階段樣品中差異表達。根和葉片中PgTIFY基因對鹽脅迫的敏感程度不同，根中的PgTIFY基因對鹽脅迫更敏感。鑒定出的16個PgTIFY基因存在一定的功能分化，具有明顯的組織和時空特異性。PgTIFY基因啟動子區(qū)域富含光、激素、脅迫等順式作用元件，推測其在石榴逆境響應和激素調節(jié)中具有重要調控作用。期待該研究結果可以為進一步明確TIFY家族基因在石榴中的功能特征和利用TIFY基因來改善石榴的品質提供理論參考。

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