不同谷子品種(系)抗旱性鑒定及抗旱機制

摘要：對36份適宜在承德地區(qū)種植的谷子品種（系）進行苗期和芽期抗旱性研究。首先，采用PEG-6000模擬干旱處理，根據(jù)種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)將36份谷子品種（系）劃分為3級，其中1級抗旱11個，2級抗旱20個，3級抗旱5個。干旱條件下，相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長、相對胚芽長與萌發(fā)抗旱指數(shù)呈極顯著正相關，因此這4個指標能作為萌芽期抗旱鑒定的生理指標。其次，在苗期采用反復干旱法，對芽期抗旱組中的5個品種（系）進行鑒定，抗旱性由強到弱依次為朝鮮小黃谷、濟優(yōu)5號、矮協(xié)1號、跑死馬、200732-1。最后，選取抗旱性較強的朝鮮小黃谷和跑死馬苗期材料進行干旱脅迫處理，然后再進行RNA-Seq轉錄組分析。結果顯示，朝鮮小黃谷、跑死馬中分別有 2 467、2 090個差異表達基因（differentially expression gene，DEG），2個品種中同時上調的基因621個，同時下調的基因289個。KEGG聚類分析結果顯示，干旱脅迫處理后，差異性表達基因參與信號轉導、氨基酸的生物合成、脂肪酸代謝、糖代謝、DNA復制修復等生物學過程，通過對轉錄組數(shù)據(jù)的分析，有助于闡明不同品種（系）對響應干旱脅迫的差異表達機理。

關鍵詞：谷子；芽期；苗期；抗旱性；轉錄組

中圖分類號：S515.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0089-07

收稿日期：2024-04-10

基金項目：河北民族師范學院青年基金（編號：QN2019003）；河北省高等學?？茖W技術研究項目（編號：ZD2022151）；承德市基礎研究項目（編號：202305B093）。

通信作者：祁東梅（1990—），女，河北灤平人，博士，講師，主要從事谷子功能基因方面的研究，E-mail：dmqikaka@163.com；共同第一作者：王玉芳（1985—），女，河北平泉人，博士，講師，主要從事谷子遺傳育種方面的研究，E-mail：496240836@qq.com。

通信作者：王春芳，博士，副教授，主要從事谷子遺傳育種和功能基因研究。E-mail：wangchunfang18@126.com。

干旱嚴重是影響農業(yè)發(fā)展的自然災害之一，解決作物的干旱問題，除了可以采用提高水分利用率、減少蒸發(fā)和地表流失等措施外，培育和選擇抗旱作物品種也是重要的措施^［1-2］。谷子（Setaria italica）是最古老的農作物之一，由狗尾草經人工馴化而來，廣泛種植于中國、印度、日本等國家^［3］。與其他禾谷類作物相比，谷子具有更加突出的耐干旱、耐貧瘠特點，谷子的抗逆特性使其成為重要的穩(wěn)產作物和救荒作物^［4］。鑒定和篩選出抗旱性強的谷子品種是谷子抗旱研究的前提，也是進行遺傳學研究和生產實踐改良的重要環(huán)節(jié)^［5］。

抗旱性是指植物通過形態(tài)、生理生化方面的改變，以適應干旱環(huán)境的特性。非生物逆境對不同作物以及同一作物的不同品種之間的影響不同，這主要取決于植物的適應和抵抗能力^［3］。目前，谷子抗旱鑒定有3個時期，分別為芽期鑒定、苗期鑒定和全生育期鑒定，當這3個時期水分供應不足時，就會嚴重影響谷子產量^［5］。其中，芽期供水狀況直接與谷子的齊苗、壯苗及最終的產量相關聯(lián)，更需要重視，并且芽期抗旱性鑒定具有試驗易操作、耗時短、可重復、條件可控性強特點^［6-7］。

在芽期抗旱性鑒定方面，裴帥帥等在芽期使用18% PEG溶液效果最好，隨著PEG濃度的增加，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和抗旱指數(shù)都呈下降趨勢^［8］。代小冬等通過對20份谷子品種進行干旱脅迫研究，發(fā)現(xiàn)各指標與萌發(fā)抗旱指數(shù)均呈正相關，在進行抗旱性評價時，1級指標是相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率，2級指標是活力抗旱指數(shù)，3級指標是相對胚芽長和相對胚根長^［9］。劉桂紅等對谷子品種進行芽期抗旱性研究中，除了測量以上指標外，還進行側根數(shù)和胚芽鞘長度進行測量，其研究表明，評價谷子芽期抗旱性，以抗旱指數(shù)為主，可結合其他指標進行綜合評價^［2］。

在苗期抗旱性鑒定中，反復干旱法和PEG模擬干旱脅迫法這2種方法常被用于鑒定谷子苗期的抗旱性^［10］。秦嶺等采用反復干旱法，把201份谷子根據(jù)幼苗存活率劃分為5個級別^［11］。山西省農業(yè)科學院也利用該方法把3 761份谷子劃分為5級，并篩選出6份水分利用率高、產量高、適應性廣、耐旱性強的品種，并在實際生產中得到應用^［12］。此外，也有研究表明，芽期和苗期抗旱鑒定中不一定存在顯著相關性，因此綜合芽期和苗期的抗旱鑒定可使抗旱評價體系更加完善^［13］。

本研究以36份適宜在承德地區(qū)種植的谷子品種（系）為材料，在芽期采用PEG模擬干旱脅迫，測定萌發(fā)抗旱指數(shù)、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對胚根長和相對胚芽長5個指標，篩選出抗旱性強的谷子品種（系）進行苗期抗旱鑒定，對芽期和苗期的研究結果進行綜合比較分析，選出抗旱性較強的谷子品種，并對其中2個品種進行干旱脅迫下的轉錄組分析，篩選抗旱基因，為選育優(yōu)異抗旱品種以及抗旱機制解析提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

36份供試的谷子品種（系）來源于河北民族師范學院冀北山區(qū)雜糧產業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，具體谷子品種（系）資源見表1。

1.2 試驗方法

試驗地點位于河北民族師范學院雜糧分子生物學與種質資源利用實驗室（40.53°N，117.57°E），芽期和苗期抗旱指標測定時間為2021年12月到2022年5月，種子萌發(fā)和小苗生長于人工氣候柜（28 ℃，16 h光照/8 h黑暗）中進行。

1.2.1 芽期抗旱性評價

準備72個經洗滌滅菌后大小一致的培養(yǎng)皿，剪出合適大小和數(shù)量的圓形濾紙，平鋪在培養(yǎng)皿內，每個培養(yǎng)皿內鋪3層濾紙作為發(fā)芽床，其中36個培養(yǎng)皿中注入10 mL 18% PEG-6000 溶液作為試驗組，剩余的培養(yǎng)皿中注入 10 mL 蒸餾水作為對照組，選取每個品種均勻飽滿的種子50粒，一半放入試驗組，一半放入對照組。培養(yǎng)皿加蓋后置于人工氣候箱內，用黑布覆蓋，試驗設3組重復。

每2 d調查1次發(fā)芽數(shù)，持續(xù)至第8天，第4天調查發(fā)芽勢，第7天調查發(fā)芽率，第8天測胚根長和胚芽長。種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率等計算公式如下：

萌發(fā)指數(shù)（PI）=1.00×nd₂+0.75×nd₄+0.50×nd₆+0.25×nd₈；

萌發(fā)抗旱指數(shù)=試驗組萌發(fā)指數(shù)/對照組萌發(fā)指數(shù)；

相對發(fā)芽勢=試驗組發(fā)芽勢/對照組發(fā)芽勢×100%；

相對發(fā)芽率=試驗組發(fā)芽率/對照組發(fā)芽率×100%；

相對胚根長=試驗組胚根長/對照組胚根長×100%；

相對胚芽長=試驗組胚芽長/對照組胚芽長×100%。

式中：nd₂、nd₄、nd₆、nd₈分別是第2、4、6、8天的種子萌發(fā)率。

1.2.2 苗期抗旱性評價

把不同谷子品種（系）播種于盛有營養(yǎng)土的塑料盒中，正常澆水至4葉期。第1次干旱脅迫前澆充足的水，一半谷子品種（系）長到4葉1心時停止?jié)菜斔泄茸悠贩N（系）葉片卷成針狀且上午仍處于萎蔫狀態(tài)、大部分葉片出現(xiàn)不同程度枯死、少數(shù)幼苗出現(xiàn)整株枯死時，進行第1次供水，直到營養(yǎng)土不再吸水為止，以幼苗心葉或分蘗葉轉為鮮綠色為存活標準，48 h后統(tǒng)計存活苗數(shù)。繼續(xù)進行干旱處理，直至出現(xiàn)第1次干旱脅迫后的狀態(tài)進行第2次供水，48 h后調查存活苗數(shù)，幼苗存活率為3組生物學重復的平均值。

幼苗存活率（LA）=（N₂/N₁+N₃/N₂）/2×100%。

式中：N₁表示每個品種（系）的幼苗總數(shù)；N₂表示第1次供水后存活的幼苗數(shù)；N₃表示第2次供水后存活的幼苗數(shù)。

1.2.3 轉錄組測序

待朝鮮小黃谷和跑死馬這2個谷子品種萌發(fā)長至5葉期時，經過干旱脅迫處理后取材并進行RNA提取，采用超微量分光光度計測RNA濃度。測序利用HiSeq 4 000完成，測序試驗和數(shù)據(jù)初步分析由貝瑞和康生物技術股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理在Excel 2010下進行，相關性分析在SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)下進行。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對谷子萌發(fā)期指標的影響

2.1.1 干旱脅迫對不同谷子抗旱鑒定指標的影響

由表2可知，干旱脅迫處理后，不同品種（系）谷子的萌發(fā)抗旱指數(shù)、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長和相對胚芽長都呈現(xiàn)出一定的變化趨勢。36份谷子品種（系）的萌發(fā)抗旱指數(shù)處于0.405～0.954之間，相對發(fā)芽勢處于0.444～1.018之間，相對發(fā)芽率處于0.405～0.992之間，相對胚根長處于0.189～0.927之間，相對胚芽長處于0.093～0.456之間。為更好地了解各品種（系）之間的鑒定關系，對36份谷子品種（系）的5個鑒定指標進行聚類分析，這些品種（系）在每個指標下均可分成3個等級，處于每個等級的具體品種（系）名稱見表2。

2.1.2 干旱脅迫下抗旱性狀的相關性分析

為了解芽期各指標（相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長、相對胚芽長）對抗旱性的參考價值，將芽期4個指標與萌發(fā)抗旱指數(shù)進行相關性分析，相對發(fā)芽勢與萌發(fā)抗旱指數(shù)相關系數(shù)為0.976^**，呈極顯著正相關；相對發(fā)芽率與萌發(fā)抗旱指數(shù)相關系數(shù)為0.960^**，呈極顯著正相關；相對胚根長與萌發(fā)抗旱指數(shù)相關系數(shù)為0.621^**，呈極顯著正相關；相對胚芽長與萌發(fā)抗旱指數(shù)相關系數(shù)為0.458^**，呈極顯著正相關。由圖1可知，對芽期4個抗旱指標進行聚類，可將其劃分為3類，評價谷子芽期抗旱性以萌發(fā)抗旱指數(shù)為前提，首先參考相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢（r=0.960^**，r=0.976^**），其次參考相對胚根長（r=0.621^**），最后參考相對胚芽長（r=0.458^**）。

2.2 干旱脅迫對苗期存活率的影響

種子萌發(fā)抗旱指數(shù)是評價種子芽期抗旱性的主要指標^［14］。選取芽期第1級抗旱品種（系）中抗旱指數(shù)排名前五的谷子品種（系）分別為跑死馬、朝鮮小黃谷、濟優(yōu)5號、200732-1、矮協(xié)1號，對其進行苗期抗旱性鑒定，谷子品種（系）在苗期采用反復干旱處理后進行存活率統(tǒng)計。統(tǒng)計結果（表3）顯示，朝鮮小黃谷的存活率最高，抗旱性較強，200732-1存活率最低，抗旱性較弱。將芽期萌發(fā)抗旱指數(shù)與苗期存活率之間進行相關性分析，相關系數(shù)為 -0.026，說明兩者之間沒有相關性。

2.3 干旱脅迫前后差異表達譜分析

為探究谷子抗旱的分子機制，本研究選取芽期和苗期抗旱性較強的2個品種朝鮮小黃谷和跑死馬在苗期進行干旱脅迫，干旱脅迫處理后進行轉錄組測序分析，結果見圖2、圖3。由圖2-A可知，干旱脅迫后，朝鮮小黃谷中有2 467個差異性變化的基因，其中上調基因1 340個，下調基因1 127個。為進一步明確朝鮮小黃谷經過干旱處理后的差異表達代謝通路，根據(jù)注釋結果進行KEGG富集分析。由圖2-B可知，處理后上調基因的富集通路主要有半胱氨酸和蛋氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，植物激素信號轉導，糖酵解、糖異生途徑，丙酸代謝及脂肪酸代謝。下調基因主要富集在DNA復制、苯丙素生物合成、同源重組、錯配修復、核苷酸切除修復。采用層次聚類方法調查DEGs的整體表達模式，結果（圖2-C）顯示，與對照組相比，試驗組中更多的基因表現(xiàn)出上調，這表明干旱脅迫誘導了基因表達。

從跑死馬的轉錄組測序結果（圖3）可知，跑死馬中差異性變化的基因2 090個，上調基因890個，下調基因1 200個。其KEGG富集分析顯示，干旱脅迫后跑死馬中的上調基因主要富集在植物激素信號轉導、精氨酸和脯氨酸的代謝、亮氨酸和異亮氨酸的降解，下調基因主要富集在光合作用、光合固碳作用、卟啉和葉綠素代謝、苯丙素生物合成。熱圖聚類分析結果顯示，干旱處理后，與對照組相比，試驗組中更多的基因表現(xiàn)出下調。

對2個品種中同時發(fā)生變化的基因進行分析，結果見圖4，2個品種中同時上調的基因621個，同時下調的基因289個。對2個品種中下調和上調表達的差異基因以Plt;0.05為閾值進行KEGG富集分析，得到這些基因的通路顯著富集結果，2個品種中上調基因富集的通路主要是植物激素信號轉導，苯丙素生物合成 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，而下調基因富集的通路主要是苯丙素生物合成、卟啉和葉綠素代謝、光合作用-天線蛋白等。同時，從2個品種共同變化的基因中選出與抗旱通路相關的一些基因并進行熱圖分析，結果（圖4-C）顯示，這些基因在2個突變體中變化比較一致。

3 討論

植物表現(xiàn)出的性狀是基因和環(huán)境綜合作用的結果，而抗旱性是受多基因、多因素控制的數(shù)量性狀，是一個復雜的綜合特性，它作用于植物的各個生長發(fā)育階段，并且最終決定生物的性狀^［15-16］。種子萌發(fā)指標中的相對發(fā)芽勢、抗旱指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)在鑒定不同物種抗旱性上被廣泛應用，能夠反映植物種子的抗旱性水平^［17-18］。本研究選用18% PEG-6000對谷子品種（系）進行干旱脅迫，該濃度能夠區(qū)分各品種（系）之間的差異，也有利于根長和芽長的測量，這與裴帥帥等的研究結果^［8］相近。本研究中鑒定所用的抗旱指標相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長、相對胚芽長與萌發(fā)抗旱指數(shù)存在極顯著的正相關，因此這些指標在一定程度上均能反映谷子的抗旱性，這和劉桂紅等的研究結果^{［2，9］}存在一定的一致性。綜合表現(xiàn)可以得出，在選擇抗旱谷子品種（系）時，當萌發(fā)抗旱指數(shù)相近時，可以依次參考1、2、3級指標，最終選出抗旱性較好的谷子品種（系）。

在苗期抗旱鑒定中，選取芽期第1級抗旱排名前五的谷子品種（系）分別為跑死馬、朝鮮小黃谷、濟優(yōu)5號、200732-1和矮協(xié)1號，這5個品種（系）的萌發(fā)抗旱指數(shù)分別為0.954、0.902、0.879、0.876和0.850。利用反復干旱法測定幼苗存活率是進行苗期抗旱性鑒定，結果表明，芽期的萌發(fā)抗旱指數(shù)與苗期的存活率之間相關性不顯著，這可能是由于植物在不同的生長發(fā)育階段有不同的抗旱性表現(xiàn)，干旱脅迫下的抗旱性機理也可能不同^{［4，13］}。

干旱脅迫處理后朝鮮小黃谷和跑死馬中發(fā)生差異性變化的基因很多，而KEGG分析顯示，朝鮮小黃谷中上調基因富集的通路要多于跑死馬，說明干旱脅迫下朝鮮小黃谷中相應物質的積累更為明顯，基因上調對朝鮮小黃合和跑死馬的抗旱性的增強可能具有一定的作用。而下調基因富集的通路在2個品種之間的差異較大，可能是因為品種特性的不同，品種自身的基因在影響并決定品種特性中具有重要作用^［19］。此外，2個品種中存在同時上調和下調的基因，后續(xù)筆者將重點關注這些基因在谷子響應干旱中的機制研究。

4 結論

芽期抗旱鑒定中，通過對適宜在承德地區(qū)種植的36個谷子品種（系）的萌發(fā)抗旱指數(shù)進行聚類分析，將谷子品種（系）劃分為3級，分別是1級抗旱、2級中抗旱、3級不抗旱?？购抵笜讼鄬Πl(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對胚根長、相對胚芽長與萌發(fā)抗旱指數(shù)呈極顯著正相關，因此評價谷子芽期抗旱性，1級指標是相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢，2級指標是相對胚根長，3級指標是相對胚芽長，其前提以萌發(fā)抗旱指數(shù)為主。苗期抗旱鑒定的5個品種（系）抗旱性由強到弱依次為朝鮮小黃谷、濟優(yōu)5號、矮協(xié)1號、跑死馬、200732-1。轉錄組分析結果顯示，這2個品種在干旱脅迫處理后均有差異性表達的基因，且這些差異基因參與了激素的信號轉導等途徑中。

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