28-高蕓苔素內(nèi)酯對黃芪生長和黃芪中多菌靈殘留的影響

摘要：28-高蕓苔素內(nèi)酯是近年來新開發(fā)的蕓苔素類植物生長調(diào)節(jié)劑，為研究其在黃芪上的應(yīng)用效果，并初步探索其對黃芪中多菌靈殘留的影響，以0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑為試驗(yàn)藥劑，0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑為對照藥劑，隴芪1號黃芪為供試作物，系統(tǒng)研究了在黃芪苗期噴施蕓苔素內(nèi)酯對植株株高和莖粗的影響，在黃芪根莖伸長期噴施蕓苔素內(nèi)酯對黃芪收獲期根重、根長、根頭部直徑和根尖直徑的影響，以及在黃芪白粉病發(fā)病初期施用多菌靈后噴施蕓苔素內(nèi)酯對黃芪植株中多菌靈殘留的影響。結(jié)果表明，苗期噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑1 500倍稀釋液后黃芪株高相比空白對照增加了24.54%，根莖伸長期噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑 1 500 倍稀釋液后黃芪地下部分鮮重相比空白對照增加了38.45%，促生長和增產(chǎn)效果均顯著高于0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑。并且噴施50%多菌靈可濕性粉劑4 d后的黃芪再噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑3 000倍稀釋液，黃芪植株中多菌靈殘留量顯著降低。噴施多菌靈后第7天，經(jīng)0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑 3 000 倍稀釋液處理的黃芪植株中多菌靈殘留量相比空白對照組降低了40.24%，比同濃度的0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯處理組低14.59%。表明28-高蕓苔素內(nèi)酯與24表蕓苔素內(nèi)酯相比不僅更能促進(jìn)黃芪植株的生長和黃芪產(chǎn)量的增加，并且能夠促進(jìn)黃芪植株中多菌靈的降解。

關(guān)鍵詞：28-高蕓苔素內(nèi)酯；黃芪；生長；多菌靈；殘留

中圖分類號：S481₊.8" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0187-05

收稿日期：2024-05-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：32302417）。

作者簡介：邢高山（1998—），男，湖北咸豐人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樾罗r(nóng)藥研究與開發(fā)。E-mail：xinggaoshan6@163.com。

通信作者：李俊凱，博士，教授，主要從事新農(nóng)藥開發(fā)與農(nóng)藥環(huán)境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com。

黃芪（Astragalus membranaceus）是一種名貴中藥材，在我國主要分布于山西、內(nèi)蒙、甘肅等地，由于野生黃芪資源逐漸減少，市場需求日益增加，近年來人工種植面積不斷擴(kuò)大^［1-2］。在栽培過程中，農(nóng)藥的使用有效控制了病蟲草害的發(fā)生，為了提高黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì)，蕓苔素內(nèi)酯等植物生長調(diào)節(jié)劑也得到了廣泛應(yīng)用。但農(nóng)藥的不合理使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)又成為影響黃芪品質(zhì)的重要因素，因此如何科學(xué)使用植物生長調(diào)節(jié)劑、有效降低農(nóng)藥殘留是黃芪等中藥材種植過程中的關(guān)鍵技術(shù)。

植物生長調(diào)節(jié)劑是指能影響高等植物發(fā)育或代謝過程的天然或合成化合物，具有與內(nèi)源性植物激素相似的生理活性^［3-4］。在各種植物生長調(diào)節(jié)劑中，蕓苔素內(nèi)酯因其在調(diào)節(jié)植物生理過程中的顯著效果，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用^［5-7］。由于天然蕓苔素內(nèi)酯在植物體內(nèi)含量低、提取工藝復(fù)雜，目前主要通過化學(xué)合成方法進(jìn)行制備^［8］。其中28-高蕓苔素內(nèi)酯是人工合成的蕓苔素內(nèi)酯類新化合物，活性達(dá)到天然蕓苔素內(nèi)酯的87%^［9］。其于2008年首次被中國農(nóng)藥信息網(wǎng)登記，登記作物為白菜，登記功能為促進(jìn)生長，目前已有相關(guān)報道表明其在大田作物上施用能夠增強(qiáng)抗逆性和提升品質(zhì)，但在中藥材等珍稀植物上的應(yīng)用鮮有報道，且在促進(jìn)農(nóng)藥降解方面的功能報道更少^［10-13］。因此本試驗(yàn)以0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑為試驗(yàn)藥劑，0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑為對照藥劑，研究28-高蕓苔素內(nèi)酯對黃芪生長和黃芪上常用農(nóng)藥多菌靈殘留的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)試劑有0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑（江西威敵生物科技有限公司）、0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑（江西威敵生物科技有限公司）、50%多菌靈可濕性粉劑（四川潤爾科技有限公司）、1 000 μg/mL 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院）、N-丙基乙二胺（上海麥克林生化科技股份有限公司）、十八烷基硅烷吸附劑（上海麥克林生化科技股份有限公司）。

試驗(yàn)儀器有TSQ QuantisTM高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）、XD-52AA型旋轉(zhuǎn)儀蒸發(fā)儀（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、Mili-Q 超純水儀 （美國Milipore公司）。

試驗(yàn)于2023年在甘肅省定西市岷縣申都鄉(xiāng)朱家村試驗(yàn)地（104°21′28.8″E，34°25′08.88″N）進(jìn)行，該地區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，海拔2 600 m，年平均降水量596.5 mm，土壤類型為黑土。試驗(yàn)黃芪品種為隴芪1號，于2023年3月25日移栽，行距 40 cm，株距8 cm，種植密度為331.25 萬株/hm₂。

1.2 苗期施用蕓苔素內(nèi)酯對黃芪地上部分生長的影響試驗(yàn)方法

于黃芪苗期（2023年5月17日）使用蕓苔素內(nèi)酯進(jìn)行莖葉噴霧，設(shè)置5個處理：0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋1 500倍、稀釋3 000倍；0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋1 500倍、稀釋3 000倍；清水對照。每個處理4次重復(fù)，小區(qū)面積為20 m₂，施藥2次，間隔15 d，用水量為 45 L/667 m₂。第2次施藥后15 d，每個小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)隨機(jī)選擇10株黃芪植株，用直尺和游標(biāo)卡尺分別測量并記錄黃芪地上部分的株高和莖粗。

1.3 根莖伸長期施用蕓苔素內(nèi)酯對黃芪地下部分生長的影響試驗(yàn)方法

于黃芪根莖伸長期（2023年7月20日）使用蕓苔素內(nèi)酯進(jìn)行莖葉噴霧，設(shè)置5個處理：0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋1 500倍、稀釋 3 000 倍；0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋 1 500 倍、稀釋3 000倍；清水對照。每個處理4次重復(fù)，小區(qū)面積為30 m₂，施藥3次，間隔15 d，用水量為 45 L/667 m₂。于2023年10月3日黃芪采收時每個小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)隨機(jī)選擇10根采收的黃芪根，分別測量并記錄黃芪根的鮮重、根長、根頭部直徑和根尖直徑。

1.4 多菌靈殘留檢測方法

1.4.1 UPLC-MS/MS分析方法

色譜條件：色譜柱采用Hypersil-Gold-C₁₈（100 mm×2.1 mm，5 μm），流動相A為0.1% 甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫（0～2 min：5%～25% B；2～4 min：25%～95% B；4～6 min：95%～5% B；6～10 min：5% B）。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；電噴霧電壓：3 500 V；離子源溫度：325 ℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；霧化氣和氣簾氣均為高純氮?dú)?；碰撞氣為氬氣，碰撞氣壓力?.2 Pa；鞘氣流速：40 L/min；輔助氣流速：7 L/min；多菌靈的前體離子為192.038 m/z，子離子分別為159.917、132.0、105.0 m/z，對應(yīng)的碰撞電壓分別為15.92、29.03、35.89 V，源內(nèi)裂解電壓為12.25 V，在此條件下以159.917 m/z為定量離子，132.0、105.0 m/z 為定性離子，保留時間為4.91 min。

1.4.2 樣品前處理方法

稱取5.00 g樣品置于粉碎機(jī)，加入50 mL甲醇，充分粉碎后轉(zhuǎn)入三角瓶中，超聲處理10 min后過濾。濾渣分別用30 mL甲醇再次超聲處理2次，合并濾液，濃縮至近干。將濃縮后的濾液用10 mL甲醇分3次復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸三鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，經(jīng)5 000 r/min離心5 min后取4 mL上清液移入10 mL離心管。加入600 mg無水硫酸鎂、150 mg N-丙基乙二胺和200 mg十八烷基硅烷吸附劑，經(jīng)5 000 r/min離心 5 min 后取上清液，過濾得到待測樣品。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法

準(zhǔn)確吸取濃度為 1 000 μg/mL 的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇逐級稀釋，配制成濃度梯度為1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.020 μg/mL的空白標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述分析條件測定各溶液的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到空白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

準(zhǔn)確吸取濃度為1 000 μg/mL的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成濃度梯度為1.000、0.500、0.200、0.100、0.050、0.020、0.010 μg/mL 的多菌靈基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述條件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

以得到的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率（K_m）和空白標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率（K_s）按公式（1）計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：

ME=K_m-K_sK_s×100%。（1）

如果-10%lt;MElt;10%，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不記，如果ME≥10%表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，如果ME≤-10%表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，按基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行后續(xù)研究^［14］。

1.4.4 添加回收率及檢出限的測定

采用空白添加回收試驗(yàn)方法測定回收率，選用4個質(zhì)量濃度（0.100、0.200、0.500、1.000 mg/kg）進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，并檢測黃芪基質(zhì)中該分析方法的檢出限（LOD）。

1.5 蕓苔素內(nèi)酯對多菌靈殘留的影響方法

于2023年7月4日黃芪白粉病發(fā)病初期噴施多菌靈，制劑施用量為100 g/667 m₂，用水量為 40 L/667 m₂，從噴施多菌靈后第2天開始連續(xù)6 d對黃芪地上部分葉片進(jìn)行取樣，在第4天，對噴施過多菌靈的黃芪分別噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑和0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑。每種藥劑分別進(jìn)行1 500倍和3 000倍的稀釋處理，且每個處理重復(fù)4次，小區(qū)面積20 m₂，用水量為 45 L/667 m₂。取樣時剪取黃芪植株地上部分表層葉片，定量稱取5.00 g后洗凈，置于-18 ℃冰箱中保存待測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用 DPS 19.05 數(shù)據(jù)處理軟件對黃芪的各調(diào)查指標(biāo)進(jìn)行方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行單因素差異顯著性分析（α=0.05）；使用Excel 2016計(jì)算多菌靈殘留降解的一級動力學(xué)方程［公式（2）］和半衰期［公式（3）］。

C_（t）=C₀×e^-kt；（2）

T_1/2=ln2k。（3）

式中：C_（t）為t時刻黃芪中多菌靈的殘留濃度；C₀為多菌靈施用于黃芪葉片后的初始濃度；k為黃芪葉片中多菌靈降解系數(shù)；T_1/2表示多菌靈在黃芪中的降解半衰期。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期施用蕓苔素內(nèi)酯對黃芪地上部分生長的影響

由表1可知，噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑和0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑后，黃芪株高有著明顯增加，其中0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋1 500倍效果最好，與空白對照相比平均株高增加了24.54%，與同濃度的0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑相比，平均株高增加了11.58%。0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑對黃芪的株高也有一定的促進(jìn)作用，但是效果低于0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑。但無論是蕓苔素內(nèi)酯的種類還是劑量，對黃芪植株的莖粗均沒有顯著的影響。這個階段黃芪以幼苗地上莖葉的生長為主要特征，噴施適宜濃度的0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑對黃芪的生長有顯著的促進(jìn)作用。

2.2 根莖伸長期施用蕓苔素內(nèi)酯對黃芪地下部分生長的影響

由表2可知，噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑和0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑后，黃芪地下部分鮮重有顯著增加，高劑量的增效效應(yīng)更加明顯。其中0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑稀釋1 500倍效果最好，與空白對照相比，地下部鮮重增加了38.45%。增產(chǎn)效果超過0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑的2個不同濃度處理。但2種蕓苔素內(nèi)酯在2個使用劑量下對黃芪根長、根頭部直徑和根尖直徑均沒有顯著影響。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)及回收率測定結(jié)果

通過UPLC-MS/MS檢測空白標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中多菌靈空白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=694 939.39+96 845 171.48x，相關(guān)系數(shù)r₂=0.999 9；多菌靈基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=1 766 518.97+54 216 255.42x，相關(guān)系數(shù)r₂=0.999 9。通過對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行計(jì)算，多菌靈在黃芪中的基質(zhì)效應(yīng)為-44.03%，表明黃芪基質(zhì)能夠影響多菌靈的檢測信號，后續(xù)研究使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多菌靈在黃芪葉片中的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差測定結(jié)果見表3，前處理方法的平均回收率在81.89%～101.12% 之間，最大相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.33%，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。在試驗(yàn)條件下，多菌靈的最低檢出限為0.046 μg/kg。

2.4 噴施蕓苔素內(nèi)酯對黃芪中多菌靈殘留量的影響

黃芪在噴施多菌靈后，自然狀態(tài)下葉片中的多菌靈殘留量會逐漸降低，噴施多菌靈后第2至第7天連續(xù)取樣并檢測多菌靈殘留量，得到的結(jié)果見表4，對其自然降解過程進(jìn)行分析，得到黃芪葉片中多菌靈自然降解曲線方程為C_（t）=74.441e^0.204t，符合一級動力學(xué)曲線，相關(guān)系數(shù)r=0.981 9，降解半衰期T_1/2=3.40 d。

由表4可知，2種蕓苔素內(nèi)酯均對黃芪植株中殘留的多菌靈的降解有促進(jìn)作用，并且0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑比0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑更能有效促進(jìn)多菌靈降解。施用多菌靈后第4天，噴施0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑1 500倍稀釋液和3 000倍稀釋液，至第5天，黃芪葉片中的多菌靈殘留量分別比未噴施蕓苔素內(nèi)酯的對照組低23.05%和27.76%，分別比同濃度的0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑低6.83%和11.46%。至第7天，0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑1 500倍和3 000倍稀釋液處理過的黃芪，葉片中的多菌靈殘留量分別比未噴施蕓苔素內(nèi)酯的對照組低23.66%和40.24%，分別比同濃度的0.01% 24-表蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑低13.13%和14.59%。2種蕓苔素內(nèi)酯制劑3 000倍稀釋液比 1 500 倍稀釋液促進(jìn)殘留多菌靈降解效果更好。

3 討論

28-高蕓苔素內(nèi)酯與24-表蕓苔素均能顯著增加黃芪地上部分株高和地下根部鮮重，說明其具有相似的作用機(jī)制，可能歸結(jié)為蕓苔素內(nèi)酯通過增加葉綠素含量和碳酸酐酶活性來增強(qiáng)光合作用，以及通過提升Rubisco的羧化速率來增強(qiáng)光合作用^［15］。而28-高蕓苔素內(nèi)酯具有比24-表蕓苔素內(nèi)酯具有更高的活性，可能由于其結(jié)構(gòu)上的差異。在28-高蕓苔素內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中，24位C上乙基處于 S-構(gòu)型，這與天然蕓苔素內(nèi)酯具有相同的構(gòu)型，而 24-表蕓苔素內(nèi)酯在24位C上的取代甲基處于R-構(gòu)型，不利于化合物與作用靶標(biāo)受體BRI1的結(jié)合，而28-高蕓苔素內(nèi)酯卻顯示出更高的親和力，從而在促進(jìn)植物生長和發(fā)育方面顯示出更強(qiáng)的生物活性^［16-17］。

28-高蕓苔素內(nèi)酯和24-表蕓苔素內(nèi)酯均能有效降解黃芪上的多菌靈殘留，這與前人的研究結(jié)果^［18-19］一致：Yang等研究發(fā)現(xiàn)，24-表蕓苔素內(nèi)酯能顯著降低番茄中啶酰菌胺的殘留量^［18］；廖燦等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，28-高蕓苔素內(nèi)酯可以顯著促進(jìn)韭菜中溴氰菊酯的殘留降解^［19］。但在本研究中，2種蕓苔素內(nèi)酯促進(jìn)黃芪中多菌靈的降解與蕓苔素的劑量之間的關(guān)系為稀釋3 000倍時促進(jìn)多菌靈的降解效果均優(yōu)于稀釋1 500倍，這一點(diǎn)與其他文獻(xiàn)報道的有所差異，可能與農(nóng)藥本身的性質(zhì)和不同作物對農(nóng)藥吸收能力的差異有一定關(guān)系。另外，在本研究中所選擇的多菌靈并未在黃芪上登記，但在實(shí)際調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在防治黃芪白粉病等主要真菌性病害時人們普遍選擇廣譜價廉的多菌靈，因此本研究對保證黃芪的殘留多菌靈盡快降解有重要意義。從實(shí)際調(diào)查和試驗(yàn)結(jié)果可以看出，藥農(nóng)施用多菌靈的劑量較高，導(dǎo)致多菌靈在黃芪植株中的殘留量處于較高水平，這雖然有助于病害防治和黃芪生產(chǎn)，但對于黃芪品質(zhì)有重要影響。使用蕓苔素內(nèi)酯后對黃芪根中相關(guān)藥用成分的影響還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

0.01%的28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑在黃芪苗期施用可顯著增加株高，促進(jìn)植株生長；在根莖伸長期施用能促進(jìn)地下根生物量的積累，增加根部鮮重，提升產(chǎn)量，并能促進(jìn)植株中多菌靈的降解。與市場上目前廣泛使用的24-表蕓苔素內(nèi)酯相比，28-高蕓苔素內(nèi)酯的效果更為顯著。并且發(fā)現(xiàn)0.01% 28-高蕓苔素內(nèi)酯可溶液劑在稀釋1 500倍時促生長和增產(chǎn)效果顯著，在稀釋3 000倍時促進(jìn)多菌靈殘留降解效果更優(yōu)，這一結(jié)果也為28-高蕓苔素內(nèi)酯在黃芪上的實(shí)際應(yīng)用提供指導(dǎo)。

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