小白菊內(nèi)酯對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制研究

【摘要】目的 探索小白菊內(nèi)酯（PTL）對(duì)多柔比星（DOX）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法 培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，應(yīng)用CCK-8法確定DOX和PTL的最佳作用濃度。將H9c2大鼠心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、PTL組、DOX組及DOX+PTL組進(jìn)行相應(yīng)處理，DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡比例，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶1（HO-1）、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)x蛋白（Bax）和B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 檢測(cè)0.5～5.0 μmol/L濃度梯度的DOX處理大鼠H9c2心肌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力下降，并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性 （P＜0.05），其中1.0 μmol/L DOX可引起H9c2心肌細(xì)胞活力降至53.0%±0.4%。5.0 μmol/L PTL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞3 h后可顯著增加DOX引起的細(xì)胞活力（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，在DOX組的H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)顯著增加（P＜0.05），氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞凋亡比例增多（P＜0.05）；與DOX組相比，PTL預(yù)處理顯著增加了DOX處理的H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax表達(dá)（P＜0.05），并降低氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。結(jié)論 PTL緩解DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷，可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制Bcl-2/Bax通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】小白菊內(nèi)酯；多柔比星；H9c2心肌細(xì)胞；Nrf2/HO-1信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.07.019

Study on the Protective Effects and Mechanisms of Parthenolide Against Doxorubicin-Induced H9c2 Cardiomyocyte Injury

GUO Hongdou1，2，JIANG Ling1，LUO Shunxiang1，CHEN Ganxiao1，LIN Jiayi 1，LIN Yifan1，XU Shanghua1

（1.Department of Cardiology，Affiliated Nanping First Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，Nanping 353000，F(xiàn)ujian，China; 2.Department of Cardiology，Wuwei People’s Hospital，Wuwei 733000，Gansu，China）

【Abstract】Objective To investigate the protective mechanism of parthenolide （PTL） against doxorubicin （DOX）-induced cardiomyocyte injury.Methods Rat H9c2 cardiomyocytes were cultured，and then the optimal concentration of DOX and PTL was determined by CCK-8 assay.Rat H9c2 cardiomyocytes were randomly divided into control group，PTL group，DOX group and DOX+PTL group.Intracellular reactive oxygen species levels were detected with DCFH-DA using a flow cytometer and the apoptotic cells were measured with Annexin V-FITC/PI staining kit by flow cytometer.Western blot was employed to detect the expressions of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2），heme oxygenase-1 （HO-1），B-cell lymphoma-2-associated X protein （Bax） and B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）.Results The cell viability of H9c2 cardiomyocytes exposed to 0.5～5.0 μmol/L DOX for 24 h decreased in a dose-dependent effect （P＜0.05），and 1.0 μmol/L DOX could reduce the viability of H9c2 cardiomyocytes to 53.0%±0.4%.The cell viability of H9c2 cardiomyocytes pretreated with 5.0 μmol/L PTL for 3 h was significantly increased after exposure to DOX （P＜0.05）.The protein expression levels of Nrf2，HO-1 and Bcl-2 in DOX group were significantly decreased comparing with the control group，while the proapoptotic protein Bax was significantly increased （P＜0.05），and the level of oxidative stress and the proportion of apoptosis were increased （P＜0.05）.Contrasted with DOX group，pretreatment with PTL could significantly increase the expression levels of Nrf2，HO-1 and Bcl-2 protein，and reduce the expression level of Bax （P＜0.05），and decrease the degree of oxidative stress and apoptosis rate of DOX-induced H9c2 cardiomyocytes （P＜0.05）.Conclusion PTL alleviates DOX-induced injury of H9c2 cardiomyocytes which was associated with activation of Nrf2/HO-1 pathway and inhibition of Bcl-2/Bax signaling pathway.

【Keywords】Parthenolide；Doxorubicin；H9c2 cardiomyocytes；Nrf2/HO-1 pathway；Apoptosis

多柔比星（doxorubicin，DOX）作為一種常用的蒽環(huán)類(lèi)化療藥物，被廣泛用于臨床治療多種惡性腫瘤，包括乳腺癌、白血病、軟組織肉瘤和淋巴瘤等。然而，DOX的應(yīng)用受到劑量依賴(lài)性心肌毒性的限制［1］。最近的研究表明，氧化應(yīng)激在DOX引起的心肌細(xì)胞損傷中扮演了關(guān)鍵角色。此外，DOX導(dǎo)致過(guò)多的活性氧累積還會(huì)促使心肌細(xì)胞凋亡，最終演變成進(jìn)行性心肌病和心力衰竭［2］。小白菊內(nèi)酯（parthenolide，PTL）是從中藥艾菊中提取的倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)自然產(chǎn)物。PTL具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、促使細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤生長(zhǎng)等［3］。研究［4］已證實(shí)，PTL通過(guò)減輕心血管損傷，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，對(duì)心肌缺血具有治療作用。然而，尚未有相關(guān)研究證明PTL是否具備減輕DOX引起的心肌細(xì)胞損傷的潛力。此外，研究［5］表明，PTL可通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、醌氧還原酶1、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，對(duì)抗慶大霉素引起的大鼠腎毒性。因此，本研究旨在使用DOX誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以研究PTL對(duì)DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響，并探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

H9c2大鼠心肌細(xì)胞系于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得。

1.2 主要試劑

主要試劑有DOX、PTL（MCE，美國(guó)），抗Nrf2、抗HO-1、抗B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2-associated X protein，Bax）、抗B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（Proteintech，中國(guó)），抗β-actin抗體（Cell Signaling，美國(guó)），CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（Dojindo，日本），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó)），DMEM高糖培養(yǎng)基、5%胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)），胎牛血清（PAN Seratech，美國(guó)），以及青霉素和鏈霉素雙抗溶液（Thermo ScientificTM，美國(guó)）。

1.3 主要儀器

主要儀器有Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）、PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀（BioRad，美國(guó)）和FACSCantoTM Ⅱ型流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）。

1.4 主要方法

1.4.1 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

使用含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素雙抗溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，在37 ℃和5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞的傳代處理。傳代按1：3的比例進(jìn)行，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到不同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。

1.4.2 DOX造模濃度的篩選

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全，分別予以0、0.5、1.0、2.0和5.0 μmol/L DOX處理24 h。隨后，每孔加入100 μL CCK-8工作液（包括90 μL DMEM培養(yǎng)基+10 μL CCK-8母液）。同時(shí)設(shè)置空白組，即只加入培養(yǎng)基而不加入細(xì)胞。所有操作需在避光條件下進(jìn)行，孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定每孔溶液的吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞活力值。DOX的用藥濃度將選取細(xì)胞活力值接近50%的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DOX損傷模型的制備。細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)-A空白）/（A對(duì)照-A空白）×100%。

1.4.3 PTL濃度的篩選

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全，分別予以含有0、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L DOX的培養(yǎng)基處理H9c2心肌細(xì)胞24 h。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，以確定PTL干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞的上限濃度。

1.4.4 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中，每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全，分別予以1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L PTL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞3 h。同時(shí)設(shè)立空白組和模型組，其中空白組只添加培養(yǎng)基，模型組加入培養(yǎng)基+1.0 μmol/L DOX。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力確定最佳PTL給藥濃度。

1.4.5 實(shí)驗(yàn)分組

基于CCK-8細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果，筆者將實(shí)驗(yàn)分為以下組別：對(duì)照組、PTL處理組（5 μmol/L）、DOX處理組（1.0 μmol/L）、DOX+PTL共處理組（1.0 μmol/L DOX + 5.0 μmol/L PTL）。其中共處理組在PTL預(yù)處理3 h后，加入1.0 μmol/L DOX，共同干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞24 h；空白對(duì)照組只加入完全培養(yǎng)基；其余兩組按藥物濃度分別加入1.0 μmol/L DOX、5.0 μmol/L PTL干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞24 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

使用Annexin V-FITC和PI染色來(lái)檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞的早期和晚期凋亡。不同組別的H9c2心肌細(xì)胞用0.25%無(wú)EDTA胰酶進(jìn)行消化，然后將細(xì)胞收集于微量離心管中，用PBS沖洗2次后重懸細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)的操作方法：每組取10萬(wàn)重懸細(xì)胞，進(jìn)行離心（1 000 g，5 min），棄去上清液后加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。接著分別添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，并轉(zhuǎn)移至流式管中。在避光條件下室溫孵育10 min后（孵育過(guò)程中通過(guò)重懸細(xì)胞3次以提高染色效果），立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.7 活性氧生成的檢測(cè)

筆者使用DCFH-DA探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。不同組別的H9c2心肌細(xì)胞在1 mL稀釋后的DCFH-DA中重懸，使細(xì)胞濃度為100萬(wàn)/mL，并在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，孵育過(guò)程中每5 min輕輕顛倒混勻，以確保探針和細(xì)胞充分接觸。然后，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌，以確保充分清除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧的生成。

1.4.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

各組細(xì)胞用PBS漂洗2次，加入含有RIPA裂解液在冰上進(jìn)行裂解30 min，然后進(jìn)行總蛋白提取，并使用BCA法完成蛋白濃度測(cè)定，加入5×loading buffer制樣。每孔上30 μg的蛋白，依據(jù)不同目的蛋白的大小，分別配置8%或10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。用PVDF轉(zhuǎn)印膜將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并在室溫下封閉1 h，將PVDF膜用洗膜液清洗后，分別加入Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、β-actin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。隔日用洗膜液清洗孵有抗體的PVDF膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例為1：2 000），室溫孵育1 h，然后使用ECL化學(xué)發(fā)光液在多功能成像系統(tǒng)下曝光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理方法

使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料。應(yīng)用單因素方差分析對(duì)多組之間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，不同兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOX造模濃度的確定

與對(duì)照組相比，加入不同濃度梯度的DOX（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L和5.0 μmol/L）分別作用于大鼠H9c2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，DOX均可降低H9c2心肌細(xì)胞的活力，而且這種效應(yīng)呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性（P＜0.05），見(jiàn)圖1。因此，本研究后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)中，選擇可使H9c2心肌細(xì)胞活力降至接近50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的DOX的濃度，即應(yīng)用1.0 μmol/L DOX對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為24 h，以建立DOX引起的心肌細(xì)胞損傷模型。

2.2 PTL濃度的確定

與對(duì)照組相比，不同濃度的PTL（1.0 μmol/L、2.0 μmol/L和5.0 μmol/L）處理對(duì)細(xì)胞活力均沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），見(jiàn)圖2。然而，當(dāng)PTL濃度增加至10.0 μmol/L和20.0 μmol/L時(shí)，明顯降低了H9c2心肌細(xì)胞的活力（P＜0.05）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇5.0 μmol/L的PTL濃度，確定為PTL的干預(yù)濃度上限。

2.3 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的作用

經(jīng)過(guò)DOX處理24 h后，細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），而經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PTL預(yù)處理后，細(xì)胞活力均得到顯著提高（P＜0.05）。在這4個(gè)劑量組中，5.0 μmol/L PTL表現(xiàn)出最顯著的保護(hù)效果，見(jiàn)圖3。因此，選擇5.0 μmol/L PTL進(jìn)行預(yù)處理，為期3 h，然后加入1.0 μmol/L DOX共同干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞，持續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 PTL對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)及活性氧生成的影響

根據(jù)DCFH-DA染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX干預(yù)的H9c2心肌細(xì)胞，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著增高（P＜0.05）。然而，與1.0 μmol/L DOX處理組相比，DOX+PTL共處理組的細(xì)胞活性氧水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX刺激后，H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。然而，經(jīng)過(guò)PTL預(yù)處理后，Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.5 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀結(jié)果分析，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX處理24 h后，H9c2心肌細(xì)胞的凋亡比例顯著增加（P＜0.05）。然而，與DOX處理組相比，DOX+PTL共處理組的細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，應(yīng)用 1 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞，經(jīng)過(guò)24 h后，促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)顯著增加，同時(shí)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。然而，與DOX處理組相比，DOX+PTL共處理組的Bax表達(dá)顯著降低，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

3 討論

盡管學(xué)術(shù)界對(duì)DOX引發(fā)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制已研究了數(shù)十年，但迄今為止，尚缺乏能有效預(yù)防和治療DOX心臟毒性反應(yīng)的特效藥物［6］。目前，右丙亞胺是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于改善DOX相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷的唯一藥物，它通過(guò)抗心肌細(xì)胞過(guò)度氧化應(yīng)激的機(jī)制來(lái)減輕DOX心肌細(xì)胞損傷，并已在臨床上得到應(yīng)用［7］。然而，右丙亞胺的臨床效果存在限制，而且已有研究［8］表明它可能會(huì)增加兒童繼發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)一步探索用于減輕DOX心臟毒性損傷的藥物，并深入了解其相關(guān)緩解作用機(jī)制，具有極其重要的臨床意義。

PTL是從天然藥用植物艾菊中分離到的倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)化合物，其親脂性有助于其在血腦屏障中的良好透通性［9］?，F(xiàn)有研究 ［3］已證實(shí)PTL的藥理作用領(lǐng)域較廣泛，主要涉及到抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抑制破骨細(xì)胞活性，以及抗腫瘤等。本項(xiàng)研究觀察到，DOX可導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞的活力下降，然而在PTL預(yù)處理后可提高細(xì)胞活力，表明PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷具有一定程度的抑制作用。此外，研究還表明PTL可通過(guò)抑制STAT3和NF-κB信號(hào)通路，抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖，包含乳腺癌、急性髓性白血病等［10-11］。這些研究結(jié)果表明，PTL不僅可改善DOX引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷，還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在不減弱DOX的抗腫瘤效果的前提下，PTL可能有望改善腫瘤患者的預(yù)后，因此，深入研究其心肌保護(hù)的具體機(jī)制具有重要意義。

已有研究［12］明確指出，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是參與DOX心肌細(xì)胞損傷重要病理過(guò)程之一，因此降低心肌細(xì)胞凋亡率可緩解DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色和蛋白質(zhì)印跡法來(lái)觀察H9c2心肌細(xì)胞的凋亡程度。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)DOX處理的H9c2心肌細(xì)胞中，促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增加，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡比例顯著增加，與相關(guān)研究［13］結(jié)果一致。與DOX處理組相比，經(jīng)過(guò)PTL預(yù)處理后，促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)降低，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)增加，同時(shí)顯著減少了DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡比例。這些研究結(jié)果表明，PTL減輕DOX引發(fā)的H9c2心肌細(xì)胞損傷可能與抑制凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。

另外，氧化應(yīng)激也在蒽環(huán)類(lèi)藥物引發(fā)心臟功能障礙的機(jī)制中扮演著重要的角色。DOX在其代謝過(guò)程中會(huì)生成半醌自由基，這些自由基通過(guò)一系列反應(yīng)最終形成活性氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷［14］。Nrf2是一種對(duì)氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子，它在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，能上調(diào)抗氧化基因HO-1的表達(dá)，而有活性的HO-1蛋白能減輕細(xì)胞內(nèi)炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等反應(yīng)。此外，應(yīng)用DOX會(huì)導(dǎo)致心臟中核蛋白Nrf2的表達(dá)降低［15-16］。有研究［17］已證實(shí)，染料木黃酮，一種異黃酮類(lèi)植物雌激素，能增加DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷動(dòng)物模型中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平。這一過(guò)程可能與染料木黃酮激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)，發(fā)揮潛在的抗氧化作用，從而保護(hù)心臟免受損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到PTL預(yù)處理顯著減少了DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成，增加了Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平，從而降低了促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，抑制了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終緩解了DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞引發(fā)的損傷。

DOX造成心臟毒性的機(jī)制較為復(fù)雜，其通過(guò)提升氧化應(yīng)激水平直接或通過(guò)促凋亡間接導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷［18］。Nrf2/HO-1是在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路之一，研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮激活此通路，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，繼而抑制凋亡水平［17］。表明在DOX引起的心肌細(xì)胞損傷中，以上兩條通路可能存在相互影響，但需進(jìn)一步研究論證。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)PTL可調(diào)節(jié)這兩條通路并改善DOX引起的心肌細(xì)胞損傷。但關(guān)于通路間是否存在相互促進(jìn)關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究揭示PTL可能與激活Nrf2/HO-1通路，增加Nrf2、HO-1抗氧化蛋白的水平，降低心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成有關(guān)，從而緩解氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損害，進(jìn)而減輕DOX引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡。此研究結(jié)果表明PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷具有明顯的抵抗作用。本研究通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，為臨床上治療和預(yù)防DOX引起的相關(guān)心臟病提供了參考，后續(xù)將進(jìn)一步完善動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

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收稿日期：2023-12-24