茶樹DREB基因的生信分析及其調(diào)控CsPOD3的抗旱機制

摘要：基于課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25等基因。通過RT-qPCR驗證，它們均受干旱誘導表達。從進化樹、蛋白理化性質(zhì)、親/疏水性、二級和三級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位等方面進行預測與分析。結(jié)果表明，CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25都與狹葉油茶（Camellia lanceoleosa）的親緣性最為密切，都屬于不穩(wěn)定的親水性蛋白。二級/三級結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，其亞細胞定位均位于細胞核中。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)CsDREB25與CsPOD3均在干旱下高表達且呈顯著相關(guān)，推測CsDREB25和CsPOD3存在相互作用關(guān)系。通過酵母單雜交驗證（Y1H）和雙熒光素酶報告基因檢測（DLA）以及雙熒光素酶互補成像（LCI）等方法試驗驗證了CsDREB25能正向調(diào)控CsPOD3的表達，提高POD的活性，清除過多活性氧，提高茶樹的耐旱性。

關(guān)鍵詞：茶樹；干旱脅迫；DREBs；過氧化物酶；生物信息學分析

中圖分類號：S571.1；Q946" " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " 文章編號：1000-369X（2025）01-0029-14

Bioinformatic Analysis of DREB Genes and Regulation of CsPOD3 on Drought Tolerance Mechanisms in

Camellia sinensis

XU Rong1， DENG Zhiying1， SHAO Chenyu1， LUO Yuqi1， QIU Shuqi1， WANG Cong1，

ZHOU Linghong2， LIU Zhonghua1， SHEN Chengwen1*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

2. Chenzhou Institute of Agricultural Sciences， Chenzhou 423042， China

Abstract： Based on the previous transcriptome data of the research group， three genes， CsDREB11， CsDREB15， and CsDREB25， were screened. Verified by RT-qPCR， their expressions were induced by drought. The phylogenetic tree， physical and chemical properties， hydrophilicity/hydrophobicity， secondary and tertiary structures， and subcellular localization were predicted and analyzed. The results show that CsDREB11， CsDREB15， and CsDREB25 are most closely related to their homolog genes in Camellia lanceoleosa. They are all unstable hydrophilic proteins. Random coils and α-helices dominate the secondary/tertiary structures. Their subcellular localizations are located in the nucleus. The preliminary study of the subject found that both CsDREB25 and CsPOD3 were highly expressed and significantly correlated under drought conditions， suggesting that there was an interaction between them. Through Y1H， DLA， and LCI experiments， it was verified that CsDREB25 can positively regulate the expression of CsPOD3， increase the activity of POD， remove excessive reactive oxygen species， and improve the drought tolerance of tea plants.

Keywords： Camellia sinensis， drought stress， DREBs， POD， bioinformatic analysis

茶樹［Camellia sinensis （L.） Kuntze］起源于我國云貴高原等西南地區(qū)，是全球重要的經(jīng)濟作物[1]，其鮮葉加工而成的飲品是世界上最受歡迎的非酒精飲料之一[2]。近年來，全球氣候變暖導致干旱天氣頻發(fā)，嚴重影響茶葉的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]。茶樹在干旱脅迫下經(jīng)歷了復雜的形態(tài)、生理和生化變化，干旱脅迫誘導了茶葉中H2O2、超氧陰離子和丙二醛（MDA）含量以及活性氧（ROS）的積累，最終降低了水勢和凈光合速率。這些生理生化變化嚴重威脅著茶樹的生長發(fā)育[4]。干旱脅迫會導致茶葉產(chǎn)量下降14%～33%，死亡率增加6%～19%[5]。干旱嚴重阻礙了茶農(nóng)經(jīng)濟收入和茶葉產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。因此開展茶樹干旱脅迫響應下的分子機制研究具有重要的現(xiàn)實意義，為選育優(yōu)良抗性茶樹品種奠定理論基礎(chǔ)，對茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的生產(chǎn)價值。

轉(zhuǎn)錄因子是基因表達最重要的調(diào)節(jié)因子之一，在植物應對各種環(huán)境脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用[6]。已有研究表明，植物中的AP2/ERF、MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物脅迫反應中扮演重要角色[7]。干旱應答元件結(jié)合蛋白（Dehydration responsive element binding protein，DREB）屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，具有1個典型的AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域[8]，由60～70個氨基酸組成，能夠特異性結(jié)合DRE順式作用元件，調(diào)控與干旱、高鹽、高滲、極端溫度等非生物脅迫應答有關(guān)的基因表達，從而增強植物對多種脅迫的抵抗性[9]。DREB亞族家族具有6個組，即A1～A6[10]。DREB轉(zhuǎn)錄因子家族只在植物中存在，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族AP2/ERF的亞族之一。有研究者從胡楊中分離出PeDREB2L基因，其受脫水/鹽和脫落酸（ABA）誘導，發(fā)現(xiàn)它可以提高擬南芥干旱和冰凍的耐受性，表明其具有提高植物非生物脅迫的潛力[11]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過增強活性氧清除能力增加植株對干旱脅迫的耐受性，如元寶楓AtruDREB28[12]。DREB轉(zhuǎn)錄因子參與到各種非生物脅迫過程中，在植物應對環(huán)境壓力的過程中具有重要調(diào)控作用[13]。目前在茶樹中關(guān)于DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能及表達調(diào)控研究少有報道，關(guān)于茶樹DREB轉(zhuǎn)錄因子參與響應干旱脅迫的機制尚不明確。

本研究利用生物信息學對CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25進行了分析，并用分子生物學方法克隆和鑒定了這3個基因。結(jié)合亞細胞定位、原核表達、酵母單雜交驗證（Y1H）和雙熒光素酶報告基因檢測（DLA）以及雙熒光素酶互補成像（LCI）等方法對CsDREBs參與茶樹干旱脅迫調(diào)控機制進行了基礎(chǔ)性研究，為深入研究茶樹響應干旱脅迫機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理方法

以一年生茶樹品種‘櫧葉齊’扦插幼苗為試驗材料。選擇長勢良好，狀態(tài)一致的幼苗進行5%聚乙二醇6000（PEG-6000，W/V）模擬干旱處理，在處理后0、12、24 h和48 h進行取樣（一芽二葉），分別編號為CK、D12、D24、D48。然后立即在液氮中速凍進行固樣，置于﹣80 ℃超低溫冰箱保存，進行后續(xù)試驗。

1.2 RNA的提取與實時熒光定量PCR分析

茶樹葉片總RNA提取采用Fastpure Universal Plant Total RNA Isolation試劑盒（Vazyme，中國）。使用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液（Agbio，中國）從總RNA中合成用于RT-qPCR的第一條鏈cDNA。使用BYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒（Agbio，中國）在QuantStudio 3定量PCR儀（Thermo Fisher Scientific，USA）進行RT-qPCR。設(shè)置3個生物學重復，用 法計算基因的相對表達量。使用National Center for Biotechology Information（NCBI）設(shè)計引物（表1）。

1.3 蛋白理化性質(zhì)和系統(tǒng)進化分析

使用MEGA-X軟件對CsDREB11、CsDREB15、CsDREB25以及所選用的其他植物的DREB轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)進化分析，系統(tǒng)進化樹構(gòu)建使用MEGA-X軟件（采用鄰接法），并使用在線工具iTOL進行可視化。利用在線工具ExPASy對CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的蛋白序列進行理化性質(zhì)分析，使用ProtScale程序預測蛋白的疏水性/親水性，使用在線工具WoLF-PSORT進行蛋白亞細胞定位預測，采用在線網(wǎng)站SOPMA和SWISS-MODEL對蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)進行預測。

1.4 亞細胞定位分析

將CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的全長編碼序列插入到融合了GFP的載體pEAQ-GFP中，形成pEAQ-CsDREB11/CsDREB15/CsDREB25-GFP構(gòu)建體。將其轉(zhuǎn)入GV3101根癌農(nóng)桿菌中，并將攜帶綠色熒光蛋白構(gòu)建體的農(nóng)桿菌菌株（菌株在波長600 nm的吸光度值為0.6～0.8）注射煙草。在25 ℃弱光條件下處理12 h，將其轉(zhuǎn)移至正常光照條件下處理48 h，使用Axio Scope.A1正置式熒光顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）檢測GFP信號。引物見表1。

1.5 原核表達

將CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的編碼區(qū)克隆到pMAL-c6T表達載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌菌株中，加入不同濃度的Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）誘導蛋白表達。使用SDS-PAGE分離每個樣品的蛋白質(zhì)。引物見表1。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測試驗（DLA）和雙熒光素酶互補成像（LCI）

選擇CsDREB25的編碼區(qū)作為效應基因克隆到pGreenII62-SK中，并將CsPOD3的啟動子區(qū)作為報告基因克隆到pGreenII0800-LUC中。將其轉(zhuǎn)入GV3101（pSoup-p19）根癌農(nóng)桿菌中，將攜帶效應基因和報告基因的菌株混合后共轉(zhuǎn)到煙草表皮中。正常培養(yǎng)2～3 d，以便感染和基因表達。熒光素鉀鹽溶液作為反應底物侵染煙草葉背，使用Viber Newton 7.0 Bio植物活體成像系統(tǒng)（Vilber Bio Imaging，法國）進行熒光信號檢測。雙熒光素酶活性檢測采用Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit（TransGen Biotech，中國）。引物見表1。

1.7 酵母單雜交互作驗證（Y1H）

將CsDREB25的編碼區(qū)序列克隆到pGADT7載體中作為獵物，CsPOD3全長編碼區(qū)序列插入pHis2載體中作為誘餌，共轉(zhuǎn)到酵母Y187菌株中。為證實CsDREB25和CsPOD3之間互相作用，將其共轉(zhuǎn)后的菌株進行梯度稀釋，并接種到含不同3-amino-1，2，4-triazole（3-AT）濃度的SD/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上進行篩選。引物見表1。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0進行相關(guān)性分析，Student’s t檢驗，Duncan多重比較，Plt;0.05表示顯著性。所有數(shù)據(jù)為平均值±標準差（Mean±SD），3次重復。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美國）進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹干旱脅迫表型的變化以及CsDREBs基因的表達驗證

使用5% PEG-6000處理茶樹枝條以達到干旱脅迫效果，隨著干旱脅迫時間不斷的增加，茶樹損傷程度越來越嚴重。干旱處理12 h時，茶樹苗并無明顯變化；干旱處理24 h時，茶樹老葉變黃且出現(xiàn)褐色斑跡，新葉出現(xiàn)輕微萎蔫；干旱處理48 h時，茶樹老葉損傷加重，葉片開始脫落且新葉葉緣出現(xiàn)褐色斑跡（圖1A）。為明確DREB轉(zhuǎn)錄因子在茶樹干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性。采用RT-qPCR對CsDREB11、CsDREB15、CsDREB25進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組（CK）相比，干旱處理后CsDREB11、CsDREB15、CsDREB25的表達明顯被誘導。CsDREB11在干旱處理12 h時的表達量最高；CsDREB15在干旱處理24 h時的表達量最高；CsDREB25在干旱處理48 h時的表達量最高（圖1B）。與課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下CsDREB11、CsDREB15以及CsDREB25相對表達量均顯著上升（Plt;0.05）（圖1C），與該結(jié)果基本一致。

2.2 CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25基因克隆

從茶樹品種‘舒茶早’基因組中獲取CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的CDS序列，全長序列分別為729、837、522 bp。以‘櫧葉齊’葉片cDNA為模板，利用高保真酶克隆CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的CDS序列。凝膠電泳結(jié)果顯示，以2 000 bp DNA Marker的條帶為參考，分別得到了3條特異性條帶，片段大小基本符合預期結(jié)果（圖2）。同時將其送到長沙有康生物公司進行檢測。檢測結(jié)果與CsDREB15、CsDREB11和CsDREB25基因的CDS區(qū)基本一致，可以基本確定克隆所得的3個目的片段分別為CsDREB15、CsDREB11和CsDREB25基因的CDS區(qū)（圖3）。

2.3 CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白序列比對分析

為進一步研究CsDREB與其他物種DREB序列的進化關(guān)系，將CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的氨基酸序列與其他物種同源性較高的氨基酸序列進行比對，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，CsDREB11與狹葉油茶（Camellia lanceoleosa，KAI8013437.1）、紅馬銀花（Rhododendron vialii，XP_058225422.1）、大花四照花（Cornus florida，XP_059637205.1）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis，PSS18000.1）蛋白親緣關(guān)系較近；CsDREB15與狹葉油茶（Camellia lanceoleosa，KAI8014866.1）、喜樹（Camptotheca acuminata，QNI23786.1）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha，XP_057481638.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，XP_002318846.1）蛋白親緣關(guān)系較近；CsDREB25與狹葉油茶（Camellia lanceoleosa，KAI8007792.1）、君遷子（Diospyros lotus，XP_052184365.1）、漸狹葉煙草（Nicotiana attenuata，XP_019245341.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，XP_006353419.1）、長春花（Catharanthus roseus，CAB93939.1）蛋白親緣關(guān)系較近，表明它們之間的生物學功能可能相似（圖4）。

使用ExPASy在線工具的ProtParam Tool程序?qū)sDREB11、CsDREB15和CsDREB25進行蛋白理化性質(zhì)分析（表2）。結(jié)果可知，CsDREB11包含242個氨基酸，分子量為26 259.39 Da，原子總數(shù)3 615，理論等電點為5.97，脂肪系數(shù)55.37，不穩(wěn)定系數(shù)41.65，此蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水性（GRAVY）﹣0.601，為親水性蛋白。CsDREB15包含278個氨基酸，分子量為30 252.84 Da，原子總數(shù)4 183，理論等電點為4.88，脂肪系數(shù)65.04，不穩(wěn)定系數(shù)47.27，屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水性（GRAVY）﹣0.551，為親水性蛋白。CsDREB25包含173個氨基酸，分子量為19 161.74 Da，原子總數(shù)2 674，理論等電點為10.13，脂肪系數(shù)54.22，不穩(wěn)定系數(shù)43.85，此蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；平均親水性（GRAVY）﹣0.887，為親水性蛋白。亞細胞定位預測分析表明3個基因均定位于細胞核中。

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的折疊方式，主要通過羰基與酰胺基團之間的氫鍵維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。利用SOPMA網(wǎng)站對CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測（圖4）。結(jié)果表明，α-螺旋（Alpha helix）、延伸鏈（Extended strand）和無規(guī)則卷曲（Random coil）3種構(gòu)象隨機分布于CsDREB序列。在CsDREB11蛋白二級結(jié)構(gòu)中（圖5A），包含α-螺旋9.92%、延伸鏈2.48%、無規(guī)則卷曲87.6%；CsDREB15蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖5B）包含α-螺旋15.47%、延伸鏈5.40%、無規(guī)則卷曲79.14%；CsDREB25蛋白二級結(jié)構(gòu)包含24.86%的α-螺旋、5.78%的延伸鏈、69.36%的無規(guī)則卷曲（圖5C）。CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白二級結(jié)構(gòu)均以無規(guī)則卷曲為主，且無β-折疊。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)指的是多肽鏈通過二級鍵（如氫鍵和范德華力）進一步交織時形成的空間結(jié)構(gòu)。氨基酸系列相似的多肽鏈會形成相似的三級空間結(jié)構(gòu)并發(fā)揮相似的功能。使用SWISS-MODEL對CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白三級結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果顯示CsDREB11的GMQE（Global model quality estimate）質(zhì)量分數(shù)為0.56，預測的蛋白模型與模板蛋白的相似度有70.40%（圖5a）；CsDREB15的GMQE質(zhì)量分數(shù)為0.62，預測的蛋白模型與模板蛋白的相似度有99.26%（圖5b）；CsDREB25的GMQE質(zhì)量分數(shù)為0.74，預測的蛋白模型與模板蛋白的相似度有75.58%（圖5c）。說明預測的CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白三級結(jié)構(gòu)模型可信度高、質(zhì)量良好，且與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致，均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。

2.4 CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25亞細胞定位分析

只有在特定的亞細胞器中，成熟的蛋白質(zhì)才能穩(wěn)定地發(fā)揮其生物功能，因此對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位分析將有助于加深我們對其功能和作用機制的理解。為了驗證CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白的亞細胞定位情況，在煙草中，短暫表達pEAQ-CsDREB11/CsDREB15/CsDREB25-GFP，而在煙草葉片表皮中以pEAQ-GFP作為對照。通過熒光顯微鏡檢測熒光信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在陽性對照中pEAQ-GFP整個細胞都能觀察到綠色熒光，而導入pEAQ-CsDREB11/CsDREB15/CsDREB25-GFP融合質(zhì)粒農(nóng)桿菌的煙草只在細胞核中檢測到綠色熒光信號（圖6），說明CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25均定位于細胞核中，屬于核蛋白。

2.5 重組蛋白誘導表達SDS-PAGE檢測

將pMAL-CsDREB11-c6T、pMAL-CsDREB15-c6T、pMAL-CsDREB25-c6T重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌菌株中，使用0.5、1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1的IPTG進行誘導，并進行SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié)果顯示（圖7）：當IPTG終濃度為1 mmol·L-1、溫度為16 ℃時，pMAL-CsDREB11-c6T和pMAL-CsDREB15-c6T上清液和沉淀中都有蛋白表達，且上清液中表達量多于沉淀部分；當IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1、溫度為16 ℃時，pMAL-CsDREB25-c6T上清液和沉淀中都有蛋白表達且上清液中表達量多于沉淀部分。利用生物信息學網(wǎng)站預測pMAL-CsDREB11-c6T、pMAL-CsDREB15-c6T、pMAL-CsDREB25-c6T重組蛋白分別約為71.0、75.0、64.5 kDa，參照蛋白Marker，上清液泳道位置可觀察到特異表達條帶，條帶所在位置與理論值相符，表明蛋白表達并成功誘導。

2.6 CsDREB25能夠與靶基因CsPOD3啟動子結(jié)合

基于課題組前期轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)CsDREB25與CsPOD3的相對表達量均在干旱條件下顯著上升（Plt;0.05），并呈顯著正相關(guān)（圖1C，圖8A），推測CsDREB25與CsPOD3可能存在相互作用，共同參與茶樹抗旱。為探索CsDREB25是否能體外結(jié)合靶基因CsPOD3，在CsPOD3啟動子區(qū)域（ATG上游2 000 bp）查找到DREB蛋白的DNA結(jié)合位點，截取CsPOD3啟動子序列1 050～2 000 bp的位置，包含﹣268 bp /﹣260 bp（TTGTCGGTG）片段。結(jié)果表明，在SD/-Leu/-Trp平板上，對照組Y187[proCsPOD3]和Y187[CsDREB25+proCsPOD3]生長良好且長勢相同，而SD/-His/-Leu/-Trp with 3-AT（80 mmol·L-1）平板上，Y187[CsDREB25+proCsPOD3]長勢明顯優(yōu)于Y187 [proCsPOD3]，說明CsDREB25可以與靶基因CsPOD3啟動子結(jié)合并互作（圖8B）。

2.7 CsDREB25正調(diào)控靶基因CsPOD3并促進其表達

為進一步驗證CsDREB25能否與CsPOD3結(jié)合，本研究將CsDREB25的CDS序列構(gòu)建到pGreenⅡ-62-SK載體上，作為Effector；將CsPOD3的啟動子序列構(gòu)建到pGreenⅡ 0800-LUC載體，作為CaMV35 S驅(qū)動的Reporter（圖9A）。將其轉(zhuǎn)入GV3101（pSoup-p19）根癌農(nóng)桿菌，將攜帶報告基因和效應基因的菌株混合注射到煙草葉背表皮細胞中，正常培養(yǎng)2～3 d，以便感染和基因表達。結(jié)果表明，CsDREB25能夠與CsPOD3結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄表達（圖9B）。使用雙熒光素酶試劑盒檢測煙草葉片中的LUC和REN值，共表達CsDREB25和proCsPOD3中的熒光素酶活性顯著高于對照組（Plt;0.05），表明CsDREB25可以激活CsPOD3啟動子，并正向調(diào)控促進CsPOD3的轉(zhuǎn)錄表達（圖9C），這與我們的推論一致。綜上所述，CsDREB25能正向調(diào)控CsPOD3并促進其轉(zhuǎn)錄表達，提高POD酶的活性，提高茶樹清除因干旱積累的過多活性氧，進而提高茶樹的抗旱性。

3 討論

DREB轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF家族的一個亞家族[14]，可通過調(diào)節(jié)應激相關(guān)基因的表達來應對各種非生物脅迫，在提高植物抗逆性中發(fā)揮了重要作用。已有研究表明DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物中過表達可以增強植株對非生物脅迫的抗性，例如擬南芥、水稻、小麥、玉米、番茄和大豆[15]。在大豆中，3種DREB同源物GmDREBa、GmDREBb和GmDREBc被證明與干旱、鹽和冷脅迫反應有關(guān)[16]。GmDREB3過表達已被證明可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因煙草對寒冷、干旱和高鹽的耐受性[17]。基于課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選到CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25基因，與CK組相比，干旱脅迫下它們的相對表達量顯著上升（Plt;0.05）（圖1）。同時，在茶樹中分離并克隆了3個能被干旱強烈誘導的DREB基因CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25的CDS序列，全長序列分別為729、837、522 bp（圖2）。通過蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)它們均屬于不穩(wěn)定的親水蛋白（表2），系統(tǒng)進化分析表明CsDREBs蛋白與狹葉油茶的親緣關(guān)系最為密切（圖4）。亞細胞定位分析顯示CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白和大多數(shù)DREB蛋白一樣在細胞核內(nèi)行使調(diào)控功能，屬于核蛋白（圖6），這與前人研究一致[18-19]。同時本研究是首次在茶樹中成功誘導CsDREB11、CsDREB15和CsDREB25蛋白（圖7）。上述結(jié)果表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子在很大程度上參與了植物對非生物脅迫的響應調(diào)控，是植物抗逆性的關(guān)鍵調(diào)控因子。

為驗證DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠響應植物的非生物脅迫?；谡n題組前期干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DREB基因表達量在干旱處理后顯著上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)CsDREB25與CsPOD3相對表達量呈顯著正相關(guān)，推測CsDREB25可能調(diào)控CsPOD3來響應干旱脅迫。本研究通過Y1H（圖8）、DLA以及LCI（圖9）一系列分子試驗發(fā)現(xiàn)，CsDREB25可以直接結(jié)合CsPOD3并促進其轉(zhuǎn)錄表達。

同樣，有研究發(fā)現(xiàn)水稻中的AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子OsLG3能結(jié)合過氧化氫酶基因OsCATC，增強其表達來提高植物清除活性氧的能力[20]。CmERF4可以通過調(diào)控ROS通路中的POD20、POD1-like等相關(guān)基因的表達負調(diào)控菊花的抗逆性[21]。在蘋果中，MhDREB2A能夠與MhZAT10結(jié)合，提高蘋果植株對干旱的耐受性[22]。EcDREB2A轉(zhuǎn)錄因子在煙草中過表達，能提高過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等過氧化物酶的活性以清除ROS，從而增強煙草對高溫的耐受性[23]。在干旱處理下，轉(zhuǎn)基因植株中DcDREB1A過表達導致超氧化物歧化酶（SOD）和POD活性增加，氣孔尺寸減小，且轉(zhuǎn)基因植株積累的木質(zhì)素量增加，木質(zhì)素生物合成基因表達水平更高，表明DcDREB1A參與了植物耐旱性的調(diào)控[24]。綜上所述，CsDREB25正向調(diào)控CsPOD3的轉(zhuǎn)錄活性并調(diào)節(jié)干旱脅迫下POD活性，清除過多ROS，提高茶樹的抗旱性。

本研究通過Y1H、DLA和LCI的試驗結(jié)果證實CsDREB25能正向調(diào)控CsPOD3并促進其轉(zhuǎn)錄表達，提高POD的活性，增強自由基清除機制來清除過多的ROS，提高茶樹的抗旱性。本研究為茶樹抗旱的分子機制研究提供了新的見解，為指導進一步設(shè)計基因分子標記來選育優(yōu)良品種提供了一定的基礎(chǔ)。

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