添加大蒜汁對酸菜發(fā)酵亞硝酸鹽控制機理的探討

摘要：為探究添加大蒜汁對東北酸菜的影響，該實驗對添加大蒜汁和自然發(fā)酵的酸菜的理化指標（pH、亞硝酸鹽、OD600）和高通量菌群結(jié)構(gòu)進行檢測分析。結(jié)果表明，添加大蒜汁能使“亞硝峰”降低，但對pH、OD600的影響較?。辉诎l(fā)酵初期，添加大蒜汁使致病菌Pseudomonas、Acinetobacter、Enterobacter、unclassified_Enterobacteriaceae的豐度增加，Lactococcus的豐度降低，Leuconostoc的豐度增加，乳酸菌的總豐度降低；FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測表明，添加大蒜汁使發(fā)酵初期的硝酸鹽降解作用增加，與疾病相關(guān)的功能增加，發(fā)酵功能降低；發(fā)酵后期，致病菌的豐度均下降，且大蒜汁的添加使unclassified_Enterobacteriaceae的豐度低于自然發(fā)酵；發(fā)酵后期，乳酸菌均成為優(yōu)勢物種，且總?cè)樗峋S度相差較小，但各乳酸菌屬的豐度存在差異。添加大蒜汁發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵初期硝酸鹽還原菌的豐度增加，為酸菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的控制提供了理論依據(jù)，對發(fā)酵菜安全性的提高具有一定的借鑒意義。

關(guān)鍵詞：酸菜；大蒜汁；亞硝酸鹽；菌群結(jié)構(gòu)

中圖分類號：TS201.3文獻標志碼：A文章編號：1000-9973（2025）03-0068-08

Discussion on Nitrite Control Mechanism in Sauerkraut Fermentation

by Adding Garlic Juice

WU Jia-ming ^1，2， YU Suang^1，2， CHI Xue-mei^1，2， SUN Quan-min^1，2， CHEN Wen-li^1，2，ZHAO Lu^1，2， CHI Nai-yu^1，2， ZHANG Qing-fang^1，2*

（1.Key Laboratory of Synthetic Biology in Dalian City， Key Laboratory of Marine Microbial

Engineering in Dalian City， College of Life and Health， Dalian University， Dalian 116622，

China; 2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Research Center，

Dalian 116622， China）

Abstract： In order to investigate the effect of adding garlic juice on northeast sauerkraut， in this experiment， detection and analysis of physicochemical indexes （pH， nitrite， OD600） and high-throughput microbial community structure of sauerkraut added with garlic juice and naturally fermented sauerkraut are conducted. The results show that the addition of garlic juice can reduce the “nitrite peak”， but has little effect on pH and OD600. In the early stage of fermentation， the addition of garlic juice increases the abundance of pathogenic bacteria such as Pseudomonas， Acinetobacter， Enterobacter， unclassified "Enterobacteriaceae， decreases the abundance of Lactococcus， and increases the abundance of Leuconostoc， resulting in a decrease in the total abundance of lactic acid bacteria. FAPROTAX ecological function prediction indicates that the addition of garlic juice increases the nitrate degradation effect as" well as the disease-related function in the early stage of fermentation， and decreases the fermentation function. In the later stage of fermentation， the abundance of pathogenic bacteria decreases， and the addition of garlic juice makes the abundance of unclassified_Enterobacteriaceae lower than that of natural fermentation. In the later stage of fermentation， lactic acid bacteria become dominant species， with a small difference in the total abundance of lactic acid bacteria， but there are differences in the abundance of various lactic acid bacteria genera. The addition of garlic juice leads to an increase in the abundance of nitrate-reducing bacteria in the early stage of fermentation， which has provided a theoretical basis for the control of nitrate and nitrite in sauerkraut， and has certain reference significance for improving the safety of fermented vegetables.

Key words： sauerkraut; garlic juice; nitrite; microbial community structure

收稿日期：2024-09-08

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2022YFC2805105）

作者簡介：吳家明（2000—），男，碩士研究生，研究方向：微生物及酶工程的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用。

*通信作者：張慶芳（1965—），女，教授，博士，研究方向：微生物及酶工程的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用。

酸菜在發(fā)酵過程中會積累亞硝酸鹽，尤其是氮肥的使用使蔬菜在生長過程中積累更多的硝酸鹽^[1]。在酸菜發(fā)酵過程中，硝酸鹽會被腸桿菌等硝酸鹽還原菌還原成亞硝酸鹽，導(dǎo)致發(fā)酵初期亞硝酸鹽的生成量大于降解量，積累形成高峰值的“亞硝峰”^[2]。亞硝酸鹽作為一種防腐劑，能夠抑制致病菌的生長^[3]，但人體攝入過量亞硝酸鹽后，會直接影響血紅蛋白的攜氧能力，導(dǎo)致呼吸中樞麻痹等癥狀。亞硝酸鹽也能在胃中與仲胺、叔胺等結(jié)合形成N-亞硝酸胺類化合物，此類化合物有強烈的致癌作用，與多種癌癥的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)^[4]。

目前大多通過添加有機酸、酶、香辛料、抗氧化物質(zhì)、乳酸菌發(fā)酵劑對發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽進行控制^[5]。大蒜作為一種香辛料，含有多種活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用^[6]，且對發(fā)酵食物中的亞硝酸鹽具有較強的清除效果^[7-9]。劉近周等^[10]研究報道，大蒜提取液中含有多種含硫化合物，主要包含巰基化合物，其能與亞硝酸鹽結(jié)合生成硫代亞硝酸酯類化合物，進而阻斷亞硝胺的合成。劉瑾等^[11]研究不同大蒜濃度對發(fā)酵菜中亞硝酸鹽含量的影響，結(jié)果表明，添加不同濃度蒜和未加蒜的酸菜在“亞硝峰”時期的亞硝酸鹽含量差異最大。張慶芳等^[12]研究表明，酸菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽對Enterococcus、Acinetobacter等致病菌有抑制作用，但對于添加大蒜汁及其造成的亞硝酸鹽含量下降將如何影響細菌群落，進而造成的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變化還未見報道。

本實驗以白菜為原料，主要研究添加大蒜汁和自然發(fā)酵酸菜“亞硝峰”時期的細菌群落結(jié)構(gòu)和群落的功能，以探索添加大蒜汁如何影響細菌群落，進而影響發(fā)酵酸菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽的降解，為添加大蒜汁發(fā)酵對酸菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的控制提供了一定理論依據(jù)，對發(fā)酵菜安全性的提高具有一定的借鑒意義。

1材料與方法

1.1材料

新鮮大白菜、食鹽、大蒜：均購于大連大學(xué)南門菜市場。

1.2試劑

亞硝酸鈉、硼酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；DP812土壤基因組脫氧核糖核酸（DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Thermo Multiskan 1510型酶標儀芬蘭Labsystems公司；PHS-3E型pH計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司；AL204型天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.4方法

1.4.1大蒜汁的制備

將新鮮無病變的大蒜去皮，用榨汁機榨汁，用無菌紗布過濾，再用45 μm的濾膜過濾，得100%的大蒜原汁^[13]。用無菌水將大蒜汁稀釋備用。

1.4.2酸菜制作工藝流程及操作要點

1.4.2.1工藝流程

添加大蒜汁發(fā)酵：新鮮大白菜→剝?nèi)ネ鈱訅娜~→清洗→瀝水→切絲混勻→裝瓶→添加大蒜汁→加鹽水→封蓋→恒溫25 ℃發(fā)酵。

自然發(fā)酵：新鮮大白菜→剝?nèi)ネ鈱訅娜~→清洗→瀝水→切絲混勻→裝瓶→加鹽水→封蓋→恒溫25 ℃發(fā)酵。

1.4.2.2操作要點

切絲混勻：將白菜切成0.5～1 cm的均勻細絲，并將白菜葉與白菜幫混勻。

裝瓶：使用小型獨立發(fā)酵體系進行發(fā)酵，選用555 mL規(guī)格統(tǒng)一的PET材質(zhì)的瓶子進行酸菜發(fā)酵。

添加鹽水和大蒜汁：添加鹽水的濃度為1.5%，鹽水與白菜的質(zhì)量比為1∶1，大蒜汁添加量為鹽水的0.2%、0.3%、0.4%。

1.4.3取樣

將未添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜設(shè)為對照，標記為CK組，添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜標記為S組。每瓶酸菜代表一個獨立的時間點，從第0天開始取樣測量，之后每隔1 d取樣一次。取樣時將酸菜和發(fā)酵液混勻倒入燒杯中，將其研磨成勻漿，用于pH和亞硝酸鹽含量的測定，并對每天取樣的樣品進行－80 ℃凍存，用于后續(xù)的高通量測序。

1.4.4理化指標測定

1.4.4.1pH測定

使用pH計進行測定。

1.4.4.2亞硝酸鹽含量的測定

參考GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法進行測定^[14]。

1.4.4.3OD600測定

對每天取樣的發(fā)酵液進行OD600測定。

1.4.516S rRNA高通量測序和分析

用土壤基因組提取試劑盒對樣品的基因組進行提取，并采用引物對338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對其進行PCR擴增，測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。對下機原始序列使用Trimmomatic v0.33軟件和Cutadapt 1.9.1軟件進行過濾，然后使用QIME 2^[15]進行去噪，得到最終有效序列。

1.4.6統(tǒng)計分析

采用OriginPro 2022對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以上實驗均重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1理化指標差異分析

由圖1中a可知，添加不同濃度大蒜汁的酸菜的pH隨著發(fā)酵時間的延長均呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)酵初期，添加大蒜汁濃度越大，酸菜的pH越高，在發(fā)酵第1天時，添加0.4%大蒜汁的發(fā)酵酸菜的pH最高，在4.5左右，且第1天時的pH均大于4.0，說明酸降解不是發(fā)酵初期亞硝酸鹽降解的主要原因^[16]。隨著發(fā)酵時間的推進，pH下降緩慢并逐漸穩(wěn)定。發(fā)酵7 d后，不同大蒜汁濃度的發(fā)酵酸菜的pH波動不大，均保持在2.9左右，說明添加大蒜汁發(fā)酵對酸菜發(fā)酵初期的pH有輕微影響，到發(fā)酵后期對pH的影響不大。由圖1中b可知，添加不同濃度大蒜汁的酸菜在發(fā)酵第1天均出現(xiàn)不同峰值的“亞硝峰”，且峰值隨著大蒜汁濃度的增大而降低。未添加大蒜汁的發(fā)酵酸菜的“亞硝峰”遠高于添加大蒜汁的發(fā)酵酸菜，“亞硝峰”最低的是添加0.4%大蒜汁的酸菜，為（4.22±0.042） mg/kg。隨著發(fā)酵時間的延長，酸菜中的亞硝酸鹽含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。由圖1中c可知，酸菜發(fā)酵過程中OD600差異較小，因此對群落豐度的研究更有說服力。由表1可知，“亞硝峰”與發(fā)酵后期的亞硝酸鹽殘留量有極顯著相關(guān)性，因此，控制“亞硝峰”的高低對酸菜成品中亞硝酸鹽含量的控制具有一定的意義。

2.2酸菜發(fā)酵初期16S rRNA高通量測序分析

根據(jù)不同時期亞硝酸鹽含量的結(jié)果，選擇S組處于亞硝峰時期（1 d）的凍存勻漿（標記為S41）和C組中亞硝峰控制效果最好的大蒜汁添加濃度（0.4%）處于亞硝峰時期（1 d）的凍存勻漿（標記為CK1）進行高通量測序分析。

2.2.1基于ASVs的Venn圖

對CK1和S41進行16S rRNA測序，分別得到79 925條和79 932條原始序列，原始序列經(jīng)質(zhì)量控制、去噪、拼接和去除嵌合體后最終分別得到68 064條和61 120條有效序列。對有效序列進一步進行ASVs分析，由圖2可知，CK1有ASVs 213個，S41有ASVs 306個，樣品中的ASVs數(shù)S41＞CK1，S41獨有ASVs 271個，CK1獨有ASVs 178個，兩者共有核心ASVs 35個。發(fā)酵初期添加大蒜汁發(fā)酵的細菌種類更加豐富，添加大蒜汁發(fā)酵與自然發(fā)酵相似的微生物較少。

2.2.2Alpha多樣性分析

Alpha多樣性（Alpha diversity）可以反映一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的物種豐富度和物種多樣性^[17]，度量菌群豐富度的常用指數(shù)主要有Chao 1、Ace、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、覆蓋率。

稀釋性曲線^[18]可以作為對各樣品測序數(shù)量是否充分的判斷依據(jù)，隨著測序數(shù)量的增加曲線趨于平緩，表示物種數(shù)量不隨測序數(shù)量的增加而增多，也可以間接反映樣品中物種的豐富度。CK1與S41樣品的稀釋性曲線見圖3中a。由圖3中a可知，兩種酸菜樣品的稀釋性曲線均逐漸趨于平緩，表明測序數(shù)量充分，且樣品中物種的豐富度S41gt;CK1。

Shannon指數(shù)曲線反映了樣品在不同測序深度時的微生物多樣性，指數(shù)越大說明物種越豐富，當(dāng)曲線趨于平緩時，說明測序的深度足夠大。CK1與S41樣品的Shannon指數(shù)曲線見圖3中b。由圖3中b可知，隨著測序深度的增加，曲線趨于平緩，說明CK1與S41的測序數(shù)量足夠大，且樣品中物種的豐富度S41gt;CK1。

Chao 1和Ace指數(shù)用來衡量物種數(shù)量的多少，即物種的豐富度，Shannon和Simpson用來衡量物種的多樣性，包括物種的豐富度和均勻度。CK1與S41的Alpha多樣性指數(shù)見表2。

S41無論是在微生物的豐富度還是在微生物的多樣性上都高于CK1，且覆蓋率為100%，說明樣品中的所有細菌均被檢出。

2.2.3在門水平上的物種分析

由圖4可知CK1與S41酸菜樣品在門水平上的物種分布，在相對豐度排名前十的菌門中，兩組酸菜樣品中相對豐度大于1%的菌門有厚壁菌門（Firmicutes，CK1gt;S41，73.72%gt;52.80%）、變形菌門（Proteobacteria，CK1lt;S41，24.14%lt;44.17%）、擬桿菌門（Bacteroidota，CK1lt;S41，1.94%lt;0.72%）。Firmicutes為CK1與S41在“亞硝峰”時期（發(fā)酵初期）的優(yōu)勢菌門，在CK1中的相對豐度是S41的1.40倍，表明添加大蒜汁發(fā)酵不利于發(fā)酵初期Firmicutes的生長；Proteobacteria的相對豐度在發(fā)酵初期S41是CK1的1.83倍，Bacteroidota的相對豐度在發(fā)酵初期S41是CK1的2.69倍，表明添加大蒜汁發(fā)酵后，有利于發(fā)酵初期Proteobacteria和Bacteroidota的生長。

2.2.4在屬水平上的物種分析

由圖5可知CK1與S41酸菜樣品在屬水平上的物種分布，在相對豐度排名前十的菌屬中，兩組酸菜樣品中相對豐度大于1%的菌屬有乳球菌屬（Lactococcus，CK1gt;S41，61.50%gt;18.48%）、拉恩氏菌屬（Rahnella，CK1gt;S41，6.23%gt;0.94%）、沙雷氏菌屬（Serratia，CK1gt;S41，2.34%gt;0.20%）、unclassified_Enterobacteriaceae（CK1lt;S41，13.72%lt;14.50%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，CK1lt;S41，0.23%lt;14.47%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，CK1lt;S41，5.80%lt;8.65%）、魏斯氏菌屬（Weissella，CK1lt;S41，5.42%lt;6.30%）、unclassified_Serpentinicella（CK1lt;S41，0.00%lt;8.01%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，CK1lt;S41，0.05%lt;7.28%）、腸桿菌屬（Enterobacter，CK1lt;S41，0.04%lt;3.86%）。可以看到在發(fā)酵前期Lactococcus是CK1中的主要優(yōu)勢菌屬，且相對豐度是S41的3.33倍，表明添加大蒜汁發(fā)酵在發(fā)酵前期對Lactococcus的生長不利。在發(fā)酵前期出現(xiàn)的致病菌屬Serratia的相對豐度是S41的11.7倍，表明添加大蒜汁發(fā)酵能夠抑制發(fā)酵前期某些致病菌的生長，在S41中Leuconostoc的相對豐度是CK1的1.49倍，Weissella的相對豐度是CK1的1.16倍，表明添加大蒜汁發(fā)酵對發(fā)酵前期Leuconostoc、Weissella的生長有利。此外，在S41中還檢測到Acinetobacter的相對豐度是CK1的62.91倍，Pseudomonas的相對豐度是CK1的145.6倍，Enterobacter的相對豐度是CK1的96.5倍，unclassified_Enterobacteriaceae的相對豐度是CK1的1.06倍，unclassified_Serpentinicella在CK1中未檢測到，猜測可能與S41中“亞硝峰”低于CK1有關(guān)。

2.2.5FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測

根據(jù)對酸菜樣品中細菌菌群結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果結(jié)合硝酸鹽與亞硝酸鹽降解的情況，將CK1與S41看成一個小型的氮循環(huán)系統(tǒng)，所以對酸菜樣品進行FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，相對豐度排名前十五的功能中豐度大于1%的有發(fā)酵（fermentation，CK1gt;S41，48.32%gt;20.58%）、化能異養(yǎng)（chemoheterotrophy，CK1gt;S41，48.79%gt;32.89%）、人類腸道（human gut，CK1lt;S41，0.15%lt;2.06%）、哺乳動物腸道（mammal gut，CK1lt;S41，0.15%lt;2.06%）、人類病原體（human pathogens all，CK1lt;S41，0.23%lt;7.70%）、動物寄生蟲或共生體（animal parasites or symbionts，CK1lt;S41，0.38%lt;9.77%）、好氧化能異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy，CK1lt;S41，0.48%lt;11.94%）、硝酸鹽還原作用（nitrate reduction，CK1lt;S41，0.13%lt;2.53%）、芳香族化合物降解（aromatic compound degradation，CK1lt;S41，0.15%lt;7.67%）?？梢钥吹紺K1中發(fā)酵和化能異養(yǎng)顯著高于S41，發(fā)酵功能的豐度是S41的2.35倍，化能異養(yǎng)功能的豐度是S41的1.48倍，在S41中與病原體相關(guān)的4種功能高于CK1，硝酸鹽還原功能的豐度是CK1的19.46倍，好氧化能異養(yǎng)功能的豐度是CK1的24.88倍。在屬水平分析中，S41中致病菌^[19-20]Pseudomonas、Acinetobacter、Enterobacter、unclassified_Enterobacteriaceae的豐度高于CK1，是導(dǎo)致添加大蒜汁發(fā)酵酸菜中與疾病相關(guān)的4種功能高于自然發(fā)酵酸菜的主要原因。

2.3大蒜汁發(fā)酵酸菜的安全性分析

通過對發(fā)酵1 d的酸菜進行菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)大蒜汁在抑制“亞硝峰”的同時會使致病菌Pseudomonas、Acinetobacter、Enterobacter、unclassified_Enterobacteriaceae的豐度增加，因為這些菌屬豐度的增加使得FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測中微生物在與人類腸道、哺乳動物腸道、人類病原體、動物寄生蟲或共生體等疾病相關(guān)功能的豐度增加。所以，對未添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜成品（標記為CK7）和0.4%大蒜汁酸菜成品（標記為S47）進行菌群結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測分析，進一步判斷添加大蒜汁發(fā)酵后酸菜成品的安全性。

2.3.1第7天酸菜屬水平菌群結(jié)構(gòu)分析

CK7與S47酸菜樣品中相對豐度排名前十的菌屬見圖7，除去不能培養(yǎng)的菌屬，分別為植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus，CK7lt;S47，45.03%lt;46.65%）、乳球菌屬（Lactococcus，CK7gt;S47，25.71%gt;16.03%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，CK7lt;S47，4.69%lt;12.11%）、unclassified_Enterobacteriaceae（CK7gt;S47，8.63%gt;5.28%）、魏斯氏菌屬（Weissella，CK7gt;S47，5.25%gt;4.63%）、拉恩氏菌屬（Rahnella，CK7gt;S47，2.58%gt;0.99%）、鹽單胞菌屬（Halomonas，CK7lt;S47，0.02%lt;2.68%）、片球菌屬（Pediococcus，CK7gt;S47，1.13%gt;0.80%）、促生乳桿菌屬（Levilactobacillus，CK7lt;S47，0.51%lt;1.30%）?？梢钥吹絊47中unclassified_Enterobacteriaceae的豐度低于CK7，且發(fā)酵1 d時注釋到的除unclassified_Enterobacteriaceae以外的致病菌的豐度，在發(fā)酵第7天時，無論是添加大蒜汁發(fā)酵還是自然發(fā)酵的酸菜都已經(jīng)下降到低水平，表明在酸菜成品中，致病菌的豐度下降，尤其是添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜雖然在發(fā)酵前期大部分致病菌的豐度高于自然發(fā)酵的酸菜，但在酸菜成品中致病菌unclassified_Enterobacteriaceae的豐度低于自然發(fā)酵的酸菜，其他致病菌的豐度也下降到低水平。在兩組酸菜成品中，乳酸菌的總豐度（Lactiplantibacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Weissella、Pediococcus、Levilactobacillus菌屬豐度之和），CK7和S47分別為82.24%和81.52%，表明發(fā)酵成品中乳酸菌的總豐度相近，且成為發(fā)酵后期的優(yōu)勢微生物，優(yōu)勢乳酸菌對致病菌的抑制是兩組酸菜發(fā)酵后期致病菌豐度下降的主要原因^[21]。但CK7和S47各乳酸菌組成存在差異，對兩組酸菜成品的風(fēng)味產(chǎn)生影響^[22]。

2.3.2第7天酸菜FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測

未添加大蒜汁的發(fā)酵酸菜成品（CK7）與0.4%大蒜汁酸菜成品（S47）的FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測見圖8。由圖8可知，相對豐度排名前十五的功能中豐度大于1%的有發(fā)酵（fermentation，CK7gt;S47，45.83%gt;40.80%）、化能異養(yǎng)（chemoheterotrophy，CK7gt;S47，46.53%gt;45.47%）、好氧化能異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy，CK7lt;S47，0.71%lt;1.65%）、動物寄生蟲或共生體（animal parasites or symbionts，CK7lt;S47，0.44%lt;1.32%）、硝酸鹽還原作用（nitrate reduction，CK7lt;S47，0.20%lt;1.13%）。與發(fā)酵前期相比，酸菜成品中未添加大蒜汁發(fā)酵中微生物的發(fā)酵功能的豐度降低了2.49%，化能異養(yǎng)降低了2.26%，好氧化能異養(yǎng)增加了0.23%，動物寄生蟲或共生體增加了0.06%，硝酸鹽還原作用增加了0.07%；添加大蒜汁發(fā)酵微生物的發(fā)酵功能的豐度增加了20.22%，化能異養(yǎng)增加了12.58%，好氧化能異養(yǎng)降低了10.29%，動物寄生蟲或共生體降低了8.45%，硝酸鹽還原作用降低了1.40%，可知在發(fā)酵成品中添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜在發(fā)酵前期由微生物引起的致病功能在發(fā)酵后期大幅度降低，而在未添加大蒜汁發(fā)酵的成品中有小幅度上升，在發(fā)酵前期發(fā)酵功能雖低于未添加大蒜汁發(fā)酵的發(fā)酵功能，但在發(fā)酵后期都已大幅度增大，說明在發(fā)酵前期添加大蒜汁發(fā)酵主要進行硝酸鹽和亞硝酸鹽的大量降解，隨著時間的延長，發(fā)酵作用逐漸占據(jù)主要地位，保證了產(chǎn)品的安全性。

3討論

在酸菜發(fā)酵過程中，蔬菜上附著大量雜菌，同時因為氮肥過量使用與蔬菜本身生長使其含有較多硝酸鹽，在發(fā)酵時會被發(fā)酵初期的微生物轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，出現(xiàn)較高亞硝酸鹽殘留量。亞硝酸鹽的攝入會在胃中形成強效致癌的N-亞硝基類化合物，增加患癌的風(fēng)險^[23]，所以在進行酸菜發(fā)酵時硝酸鹽的去除也是研究的熱點。據(jù)前人研究，大蒜中有機硫化物中的巰基可以與亞硝酸鹽結(jié)合，形成亞硝酸酯^[24]，對亞硝酸鹽進行清除，本實驗添加大蒜汁發(fā)酵后，“亞硝峰”值低于未添加大蒜汁發(fā)酵，且“亞硝峰”值與亞硝酸鹽殘留量呈極顯著正相關(guān)，說明添加大蒜汁發(fā)酵對“亞硝峰”有抑制作用，峰值越低，亞硝酸鹽殘留量越少。

目前對酸菜中添加大蒜汁降解亞硝酸鹽的機理研究主要集中在大蒜中的巰基化合物與亞硝酸鹽形成亞硝酸酯對亞硝酸鹽的控制^[24]。酸菜添加大蒜汁發(fā)酵時，大蒜會使“亞硝峰”值降低，在此過程中微生物群落如何發(fā)揮作用的相關(guān)報道較少，本研究以未添加大蒜汁發(fā)酵酸菜（CK1）為對照，對對照和最高大蒜汁濃度（0.4%）的酸菜（S41）在“亞硝峰”時期的微生物菌群結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)添加大蒜汁發(fā)酵能使Acinetobacter、Pseudomonas、Enterobacter、unclassified_Enterobacteriaceae、unclassified_Serpentinicella等菌屬微生物的豐度增加，而Acinetobacter、unclassified_Enterobacteriaceae、Pseudomonas、Enterobacter的豐度與硝酸鹽濃度呈負相關(guān)，與硝酸鹽降解呈正相關(guān)^[25-26]。在發(fā)酵前期，蔬菜中含有大量硝酸鹽，在發(fā)酵過程中被上述微生物降解成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽又可以與大蒜中富含的有機硫化物的巰基反應(yīng)生成亞硝酸酯，減少亞硝酸鹽含量。通過蔬菜攝入的硝酸鹽占每天飲食攝入的87%，且人體中93%的亞硝酸鹽來自口腔中共生細菌對硝酸鹽的轉(zhuǎn)化^[27-28]。添加大蒜汁發(fā)酵后有利于蔬菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的大量降解，進一步增強了蔬菜發(fā)酵的安全性，為開發(fā)硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均降低的酸菜提供了參考。根據(jù)FAPROTAX生態(tài)功能預(yù)測，添加大蒜汁發(fā)酵后微生物的好氧化能異養(yǎng)、硝酸鹽還原作用、功能豐度顯著高于CK1，符合菌群結(jié)構(gòu)變化，而這些功能的增強有利于S41中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，同時生成的亞硝酸鹽還與大蒜中的有機硫化物的巰基結(jié)合生成亞硝酸酯，進一步表明添加大蒜汁發(fā)酵能夠促進硝酸鹽還原微生物的生長，進而對酸菜發(fā)酵中硝酸鹽與亞硝酸鹽進行降解。且添加大蒜汁發(fā)酵后在發(fā)酵前期雖然致病菌豐度增加，但只是參與酸菜中硝酸鹽與亞硝酸鹽的降解，在添加大蒜汁的成品中，“亞硝峰”時期豐度增加的致病菌屬豐度低于對照組且兩組的豐度排名均降到前十以外，處于較低水平。綜上所述，添加大蒜汁發(fā)酵不僅會對酸菜中的硝酸鹽與亞硝酸鹽進行降解，而且保證了酸菜產(chǎn)品的安全性。

結(jié)合發(fā)酵前期與發(fā)酵后期微生物群落的變化可知，在發(fā)酵前期，S41中致病菌Pseudomonas、Acinetobacter、Enterobacter、unclassified_Enterobacteriaceae的豐度大于CK1，CK1中Lactococcus的豐度是S41的3.33倍，S41中Leuconostoc的豐度是CK1的1.49倍，在7 d后成品中，S47中unclassified_Enterobacteriaceae的豐度下降并低于CK7，其他致病菌的豐度也下降到低水平。CK7中Lactococcus的豐度是S47的1.97倍，S47中Leuconostoc的豐度是CK7的2.58倍，即Lactococcus在未添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜中無論在發(fā)酵前期還是成品中豐度均高于添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜，Leuconostoc在未添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜中無論在發(fā)酵前期還是成品中豐度均低于添加大蒜汁發(fā)酵的酸菜。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)^[12]，酸菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽會使Acinetobacter、unclassified_Enterobacteriaceae、Enterobacter等致病菌的豐度處于低水平。亞硝酸鹽有利于Lactococcus、Leuconostoc的生長，且發(fā)酵前期亞硝酸鹽對Lactococcus生長的促進作用更大。本實驗發(fā)酵前后期致病菌的豐度變化與本實驗室前期的實驗結(jié)果一致，推測發(fā)酵前期致病菌豐度的變化主要由亞硝酸鹽的變化引起，添加大蒜汁發(fā)酵使大蒜汁中的含硫化合物與亞硝酸鹽結(jié)合造成亞硝酸鹽含量降低，使S41中亞硝酸鹽對上述致病菌的抑制作用下降，導(dǎo)致致病菌的豐度大于CK1，發(fā)酵后期優(yōu)勢乳酸菌產(chǎn)生有機酸、乳酸菌素等抑制了致病菌^[21]，使致病菌的豐度降低。乳酸菌Lactococcus的豐度變化與亞硝酸鹽對Lactococcus的影響結(jié)果相一致，CK1中更高的亞硝酸鹽含量促進了Lactococcus的生長。而S41中Leuconostoc的豐度高于CK1，可能是蒜汁對Leuconostoc生長的促進作用比亞硝酸鹽大。在發(fā)酵后期，兩組中乳酸菌的總豐度相近，但各乳酸菌組成存在差異，乳酸菌在食品發(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種香味物質(zhì)，影響食品的風(fēng)味和品質(zhì)，不同的乳酸菌通過不同的代謝途徑產(chǎn)生不同的香味物質(zhì)，影響酸菜的風(fēng)味^[22]。Hu等^[29]研究表明，Leu.mesenteroides和L.plantarum混合發(fā)酵能提高酸菜的品質(zhì)。而添加大蒜汁發(fā)酵后期的Lactiplantibacillus和Leuconostoc的豐度均高于自然發(fā)酵，因此，大蒜汁的添加可以通過影響乳酸菌的豐度，進而影響酸菜的品質(zhì)，為添加大蒜汁改變酸菜風(fēng)味提供了理論依據(jù)，為提高酸菜品質(zhì)提供了參考。

添加大蒜汁發(fā)酵使蒜汁中的含硫化合物與亞硝酸鹽結(jié)合，造成亞硝酸鹽含量降低，亞硝酸鹽的降低導(dǎo)致對腸桿菌等硝酸鹽還原菌的抑制作用下降，使添加大蒜汁發(fā)酵前期的硝酸鹽還原作用顯著升高，生成的亞硝酸鹽又能與大蒜汁中的含硫化合物結(jié)合，使得添加大蒜汁發(fā)酵的“亞硝峰”保持較低水平，并且“亞硝峰”與成品中的亞硝酸鹽含量有顯著的相關(guān)性。添加大蒜汁可以使酸菜成品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量降低，酸菜變得更加安全。隨著發(fā)酵的進行，致病菌被優(yōu)勢乳酸菌抑制，使致病菌的豐度降低，進一步保證了酸菜的安全性。

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