無細(xì)胞百日咳疫苗研發(fā)與接種現(xiàn)狀及前景

崔樂樂 綜述，諶志筠，何秋水，2 審校

1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，北京 100069；2.芬蘭圖爾庫大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物和免疫學(xué)系，芬蘭 圖爾庫 20520

百日咳是一種由百日咳鮑特菌引起的急性呼吸道疾病，是中國的法定B 類傳染病，傳染能力極強(qiáng)，主要影響嬰幼兒［1］。自 20 世紀(jì) 50 ～ 60 年代全球廣泛應(yīng)用全細(xì)胞百日咳疫苗（whole-cell pertussis vaccines，wPVs）以來，百日咳發(fā)病率與死亡率明顯降低［2］。我國在1978年開展計劃免疫應(yīng)用白百破聯(lián)合疫苗（diphtheria，tetanus and whole-cell pertussis combined vaccine，DTwP）后，百日咳發(fā)病率顯著下降。2007 年開始使用白喉破傷風(fēng)無細(xì)胞百日咳聯(lián)合疫苗（diphtheria，tetanus and acelluar pertussis combined vaccine，DTaP），截止2017 年，百日咳報告發(fā)病率為0.75／10萬，比實施計劃免疫前降低了99%以上，相比DTwP，DTaP 中包含的無細(xì)胞百日咳疫苗（ace-llular pertussis vaccines，aPVs）安全性高，副作用較輕，因此在許多國家逐漸取代了DTwP［3］。但近20年來，在疫苗覆蓋率高的國家百日咳發(fā)病率呈顯著上升趨勢，出現(xiàn)“百日咳再現(xiàn)”現(xiàn)象。其主要因素是DTaP 不能提供長期保護(hù)效果，導(dǎo)致青少年和成年人發(fā)病率上升，不能有效阻止百日咳在群人中的傳播［4］。因此，需改進(jìn)或開發(fā)下一代疫苗并完善接種策略，本文就aPVs 研發(fā)與接種的現(xiàn)狀及前景作一綜述。

1 aPVs組分及特征

目前aPVs 有兩種制備方法：第1 種為共純化百日咳毒素（pertussis toxin，PTx）和絲狀血凝素（filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA）兩種保護(hù)性抗原，產(chǎn)率相對較高，且成本低，但抗原成分比例不穩(wěn)定；第2種使用柱層析法對抗原進(jìn)行分別純化，定量配比制成aPVs，易進(jìn)行質(zhì)量控制，副作用較?。?］。目前aPVs中包含的PTx、FHA、黏附素（pertactin，PRN）、菌毛（fimbriae，F(xiàn)IM）2型和3型等5種組分，可激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性抗體，在預(yù)防百日咳中發(fā)揮重要作用（見表1）。多數(shù)發(fā)達(dá)國家使用柱層析法，而我國仍在使用共純化方法制備aPVs，相比第1 種方法，第2種方法存在一定的不足，無法準(zhǔn)確保證抗原成分及比例，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)效力難以確定［5］。相比之下，分別純化每種抗原可明確抗原的具體含量，在機(jī)體中誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，不同品牌aPVs 中的抗原含量見表2。

表1 aPVs中包含的抗原類型Tab.1 Antigen types included in aPVs

表2 不同疫苗廠商生產(chǎn)的aPVs中的抗原含量Tab.2 Content of antigens in aPVs produced by various vaccine manufacturers

2 aPVs接種現(xiàn)狀

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）建議aPV 標(biāo)準(zhǔn)劑量為0.5 mL，初次免疫接種3 劑，每劑之間至少間隔4 周，加強(qiáng)接種1 到2 次。不同國家百日咳疫苗的接種程序有所差異，初次接種疫苗為DTaP，加強(qiáng)接種一般使用抗原含量減少的Tdap，見表3。aPVs主要誘導(dǎo)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，接種后可觀察到IgG抗體水平顯著升高，人群廣泛接種后免疫效果良好，但接種后缺乏黏膜免疫和細(xì)胞免疫，因此免疫保護(hù)維持時間較短［18］。盡管已有五組分aPVs，但其誘導(dǎo)的長期免疫保護(hù)效果仍不理想。近年來，針對“百日咳再現(xiàn)”現(xiàn)象，一些國家對接種方案進(jìn)行了調(diào)整，如開展孕期接種以預(yù)防新生兒感染百日咳［19］。此外，改進(jìn)現(xiàn)有疫苗或開發(fā)下一代疫苗也是解決“百日咳再現(xiàn)”的重要方向。

表3 部分國家aPVs接種程序Tab.3 Vaccination programs of aPVs in some countries

3 新型aPVs研究進(jìn)展

研究表明，除上述5 種抗原外，其他的百日咳鮑特菌抗原也在百日咳發(fā)病中起重要作用，但尚不清楚何種疫苗抗原可起到最佳的免疫保護(hù)效果［20］。佐劑具有增強(qiáng)機(jī)體對抗原免疫應(yīng)答的優(yōu)點，除明礬外，其他類型的佐劑也有助于疫苗發(fā)揮更大的免疫保護(hù)效應(yīng)。若將疫苗包裝至含特定生物分子的微粒中，有可能增強(qiáng)疫苗的免疫效果。此外，遺傳修飾毒素是較新穎的研究方向之一。多種疫苗改進(jìn)方案有助于優(yōu)化aPVs的免疫效果。

3.1 其他百日咳鮑特菌抗原 腺苷酸環(huán)化酶毒素（adenylate cyclase toxin，ACT）為百日咳鮑特菌的毒力因子，可阻斷細(xì)胞信號，是百日咳的發(fā)病機(jī)制之一。通過改良ACT 缺乏腺苷酸環(huán)化酶活性，與PT、FHA 構(gòu)成的二組分疫苗結(jié)合可有效減少細(xì)菌在鼻腔中的定植。此外，改良ACT 還可誘導(dǎo)抗PRN 的IgG2a 抗體，增強(qiáng) Th1 和 Th2 反應(yīng)［21］。不足之處在于百日咳自然感染對ACT 的免疫反應(yīng)明顯，但接種包含ACT 的aPVs 后，對ACT 的特異免疫反應(yīng)遲緩。小鼠體內(nèi)實驗表明，各種滅活或基因重組形式的ACT均不能很好地誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)，但與aPVs聯(lián)合接種可增強(qiáng)免疫效力。

百日咳血清抗性蛋白（bvg-regulated Bordetella pertussis protein，BrkA）是百日咳鮑特菌重要的毒力因子，可賦予血清抗性并介導(dǎo)黏附作用?？贵w結(jié)合于該蛋白的載體結(jié)構(gòu)域上可中和血清抗性并增強(qiáng)抗菌能力［22］。但單獨使用BrkA 制劑不能顯著誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)，需與PT和FHA聯(lián)合使用［23］。

鮑特菌定植因子A（Bordetella colonization factor A，BcfA）具有輔助誘導(dǎo)Th1／Th17 反應(yīng)的特性。將BcfA 添加到aPVs 中可降低鋁佐劑引起的Th2 反應(yīng)，加速清除小鼠肺部定植的百日咳鮑特菌，延長免疫效果，是建立長期免疫保護(hù)、減少疾病傳播的研究方向［24］。

百日咳感染易引起缺鐵，缺鐵可誘導(dǎo)不同具有免疫原性的功能蛋白產(chǎn)生，其中包括鐵調(diào)節(jié)蛋白，如IRP1-3和AfuA，在aPVs中加入兩種鐵調(diào)節(jié)蛋白可顯著增強(qiáng)小鼠的免疫活性［25］。

目前包含百日咳鮑特菌其他抗原的新型疫苗處于研發(fā)階段，尚未進(jìn)行臨床試驗，因此具體免疫效果尚不清楚。

3.2 新型佐劑 aPVs 主要誘導(dǎo)Th2 應(yīng)答，且這種免疫反應(yīng)持續(xù)時間較短，衰減速度較快，無法誘導(dǎo)提供長期保護(hù)作用的Th1和Th17反應(yīng)及組織駐留記憶反應(yīng)（tissue resident memory，TRM）。佐劑可增強(qiáng)Toll樣受體激動劑結(jié)合病原體相關(guān)分子模式受體的能力，增強(qiáng)體液免疫并誘導(dǎo)Th1／Th17 反應(yīng)，提供長期免疫保護(hù)。目前，aPVs中的佐劑多使用鋁佐劑，但免疫維持時間較短。三組分aPVs 中除Al3+外還加入了TLR7 激動劑，可誘導(dǎo)更高水平的IgG 和Th1／Th17反應(yīng)。c-di-GMP 為干擾素基因的細(xì)胞內(nèi)受體刺激劑，與TLR2激動劑共同加入aPVs可促進(jìn)Th17／Th1反應(yīng)，誘導(dǎo)TRM 產(chǎn)生，對疫苗的鼻腔定植有積極影響［26］。TLR9 和 STING／cGAS 也可作為佐劑聯(lián)合aPVs 使用，目前處于臨床試驗階段。將百日咳鮑特菌定殖因子A 作為佐劑加入三組分aPVs 中，同樣可誘導(dǎo)Th1／Th17 反應(yīng)，并可提高肺部細(xì)菌清除率［27］。佐劑curdlan是一種1，3-葡聚糖多糖，可誘導(dǎo)黏膜IgA和血清IgG 反應(yīng)，在中性環(huán)境下可形成凝膠，有助于疫苗在呼吸道上皮細(xì)胞定位，提高疫苗的局部效率，并可降低肺部細(xì)菌負(fù)荷，誘導(dǎo)全身抗PT-IgG產(chǎn)生，并抑制白細(xì)胞增多，接種后可在鼻腔灌洗液中檢測到IgA 的產(chǎn)生。在保證疫苗安全性和有效性的前提下，佐劑可進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗的免疫效力［28-29］。

3.3 生物顆粒與納米微粒 研究發(fā)現(xiàn)，將DTaP 包裝在含有聚磷酸鹽、陽離子先天防御調(diào)節(jié)肽和CpG 寡脫氧核苷酸的顆粒中，可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)更早發(fā)生，提高IgG2a和IgA的表達(dá)水平［30］。聚乙丙交酯可與TLR-7配體結(jié)合，若將DTaP 吸附至聚乙丙交酯納米微粒上并與TLR-7配體共定位，可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)IgG和IgG2a水平增高。含聚乳酸-乙醇酸納米微粒的PTx可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌抗原特異性干擾素和IL-17［31］。將aPVs 吸附于生物顆?；蚣{米微粒上可增強(qiáng)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗效果，是較為理想的疫苗改進(jìn)方向。

3.4 遺傳脫毒百日咳毒素 目前，aPVs中的PTx由化學(xué)脫毒制成，雖能有效消除PTx 毒性，但破壞了結(jié)合抗毒素強(qiáng)中和抗體的抗原決定簇，使PTx 的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，近年來嘗試構(gòu)建PTx 的基因突變體，即遺傳脫毒百日咳毒素（genetically detoxified PTx，gdPT）。AUSAR等［32］采用的是gdPTR9K／E129G，該突變體毒素的毒性已被完全消除，且保留天然PTx的大部分結(jié)構(gòu)特性，抗原決定簇與天然PTx 無異，具有免疫原性，安全性較高。氫氘交換質(zhì)譜分析表明，gdPTR9K／E129G中A原體兩個基因R9K和E129G的雙位點突變影響了S1亞基與NAD+的結(jié)合，使其熱穩(wěn)定性增加。質(zhì)譜流式技術(shù)顯示，gdPT R9K／E129G可誘導(dǎo)記憶T 細(xì)胞增殖，并具有活化表型，引起細(xì)胞表面 CD38、CD25 和 HLA-DR 高表達(dá)，正向調(diào)節(jié)免疫效力。

3.5 外膜囊泡疫苗 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）是百日咳鮑特菌菌膜的球形脂質(zhì)體囊泡，含細(xì)菌蛋白。通過在OMV 表面上表達(dá)異源抗原刺激B 細(xì)胞反應(yīng)，或在管腔內(nèi)表達(dá)異源抗原驅(qū)動T 細(xì)胞反應(yīng)，使其具有高度免疫力制備成百日咳外膜囊泡疫苗（outer membrane vesicles of pertussis vaccine，omvPV）［33-34］。相比aPVs，皮下接種OMV可引起小鼠體內(nèi)Th1／Th2／Th17 混合反應(yīng)，鼻內(nèi)接種可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜免疫反應(yīng)，增強(qiáng)IgG 與肺部、鼻部的IgA 抗體水平［35-36］。OMV 在小鼠體內(nèi)接種結(jié)果均表明相比皮下接種，鼻內(nèi)接種誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)、抗體類型更豐富。OMV 尚未進(jìn)行臨床試驗，在進(jìn)入臨床試驗階段前需考慮不同接種方式對免疫反應(yīng)的影響。鑒于百日咳通過呼吸道傳播，因此，經(jīng)鼻給藥可能比引起全身免疫的皮下接種更有效。

4 展望

實施免疫接種后，百日咳發(fā)病率得到有效控制。不少國家從接種wPVs轉(zhuǎn)變?yōu)閍PVs，大大降低了疫苗副作用的發(fā)生率。WHO 統(tǒng)計，目前世界范圍內(nèi)百日咳疫苗新生兒覆蓋率已達(dá)80%，但免疫力維持時間短的問題仍很突出［37］。針對aPVs 的改進(jìn)方向，基因脫毒疫苗已取得了明顯的臨床效果，其他改進(jìn)策略包括在現(xiàn)有aPVs 中使用新型佐劑、增加抗原，或采用納米顆粒包裝等也均具有良好的發(fā)展前景。此外，需考慮疫苗的接種方式是否仍采用皮下注射，如通過滴鼻方式更能誘導(dǎo)有效的黏膜免疫。目前我國在aPVs純化、接種程序等方面仍有不足，需對現(xiàn)有的aPVs進(jìn)行研發(fā)與改進(jìn)，除針對疫苗本身的研究之外，如何提高接種策略，以及預(yù)防青少年、成人和月齡較小的嬰兒感染百日咳也是至關(guān)重要的研究方向。