張　玲　陳長(zhǎng)永　王佳琦

張 玲 陳長(zhǎng)永 綜述，王佳琦 審校

人骨髓中所含的細(xì)胞可以分為造血類細(xì)胞和非造血類細(xì)胞。前者中含有的干細(xì)胞主要為造血干細(xì)胞，而后者中含有間充質(zhì)類干細(xì)胞（mesenchymal sten cell）能夠分化為骨、軟骨、肌腱、脂肪、皮膚和其他類型的細(xì)胞[1-2]。骨髓中含有多向分化潛能的細(xì)胞，這類細(xì)胞的共同特征是具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)，能黏附塑料培養(yǎng)皿，并能形成細(xì)胞克隆，但無(wú)吞噬功能。基于這些特征，這類細(xì)胞又被稱之為“成纖維細(xì)胞樣的克隆形成單位”或“骨髓間質(zhì)纖維細(xì)胞”。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，骨髓間質(zhì)纖維細(xì)胞能夠形成軟骨、骨、脂肪、纖維組織和骨髓間質(zhì)組織等[3]。由于MSC主要存在于骨髓中，故骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell）或骨髓間質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cell）的英文縮寫B(tài)MSC已成為一種較為常見(jiàn)的命名方式。理想的軟骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)具備以下特點(diǎn)：易獲取、對(duì)機(jī)體損傷小、易體外培養(yǎng)增殖、長(zhǎng)期傳代不改變生物學(xué)特征、具有較強(qiáng)的傳代繁殖力、組織修復(fù)能力強(qiáng)、植入體內(nèi)后能耐受機(jī)體免疫、并保持良好的生物相容性。來(lái)源于自體骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞完全具備這些特點(diǎn)[4-5]。隨著對(duì)BMSCs研究的不斷深入，BMSCs用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的巨大潛能逐漸被發(fā)掘出來(lái)了。本文就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨組織工程化組織構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1BMSCs定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的方式

目前，國(guó)內(nèi)外BMSCs定向誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞的方式很多，大體可分為體外和體內(nèi)兩種誘導(dǎo)方式。

1.1 體外誘導(dǎo)：體外誘導(dǎo)包括體外細(xì)胞團(tuán)聚集誘導(dǎo)、體外單層細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)、體外三維支架環(huán)境中誘導(dǎo)與軟骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)。

1.1.1 體外細(xì)胞團(tuán)聚集誘導(dǎo)：在軟骨發(fā)育過(guò)程中，前期細(xì)胞密度較大，后期細(xì)胞密度逐漸降低，所以Brian,Yoo JU[6-7]等把兔BMSC先在含10％DMEM中培養(yǎng)后，消化收集融合的BMSCs，低速離心后移入l5ml聚丙烯試管中，用含10mol/L地塞米松DMEM培養(yǎng)液聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)，在7天既檢測(cè)到細(xì)胞團(tuán)中有Ⅱ型膠原的分泌；21天細(xì)胞團(tuán)形態(tài)類似軟骨組織，體積約2mm3，所有細(xì)胞聚集團(tuán)均有軟骨特異性Ⅱ型膠原分泌，并部分檢測(cè)到X型膠原的表達(dá)，而不加地塞米松的對(duì)照組則無(wú)Ⅱ型膠原表達(dá)。在DMEM培養(yǎng)液中同時(shí)加入TGF-β1時(shí)，誘導(dǎo)出的類軟骨組織團(tuán)體積比前者大。以上研究初步證實(shí)TGF-β1、地塞米松在BMSCs向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要作用[8-10]，而研究者所采用細(xì)胞聚集成團(tuán)誘導(dǎo)，正是模擬了人體內(nèi)軟骨發(fā)育時(shí)的過(guò)程，先在將要形成軟骨的部位，中胚層的問(wèn)充質(zhì)細(xì)胞聚集形成前軟骨細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)一步分化為軟骨細(xì)胞。細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成內(nèi)部相對(duì)缺氧的環(huán)境,可能會(huì)有利于BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。

1.1.2 體外單層細(xì)胞誘導(dǎo)：體外細(xì)胞團(tuán)聚集誘導(dǎo)培養(yǎng)形成基質(zhì)后，可能因?yàn)橹苓吋?xì)胞營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞團(tuán)外基質(zhì)分泌較旺盛，細(xì)胞團(tuán)中心部位細(xì)胞由于營(yíng)養(yǎng)彌散受限而易發(fā)生壞死，而且細(xì)胞團(tuán)聚集誘導(dǎo)形成的軟骨樣組織體積非常小，一般僅約2～5mm3，其臨床實(shí)用性非常有限，根本無(wú)法滿足軟骨缺損修復(fù)或體表凹陷缺損的充填，而體外單層誘導(dǎo)培養(yǎng)有可能獲得更多的細(xì)胞。Worster[11]等在體外單層培養(yǎng)環(huán)境中，對(duì)馬的BMSCs單層誘導(dǎo)培養(yǎng)，檢測(cè)到軟骨細(xì)胞特異性II型膠原，初步證實(shí)馬的BMSCs經(jīng)單層誘導(dǎo)培養(yǎng)已有部分細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。Gallay[12]等用含有β1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)骨膜MSCs后發(fā)現(xiàn)有軟骨細(xì)胞形成。Mackay[13]等將人的BMSCs置入含有地塞米松、TGF-β1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，細(xì)胞開(kāi)始分泌Ⅱ型膠原，說(shuō)明BMSCs已分化為軟骨細(xì)胞。夏萬(wàn)堯等以高糖DMEM低血清含有TGF-β1，地塞米松、胰島素等誘導(dǎo)因子作為誘導(dǎo)培養(yǎng)液，在體外單層培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)豬BMSCs向軟骨細(xì)胞表型定向分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)后7天免疫組化檢測(cè)到II型膠原，原位雜交也檢測(cè)到II型膠原mRNA表達(dá)；而對(duì)照組則不能測(cè)到II型膠原的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明BMSCs在體外單層培養(yǎng)誘導(dǎo)下，也能向軟骨細(xì)胞分化。Sekiya[14-16]等證明，在含有地塞米松、TGF-β1的培養(yǎng)體系中再加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6（BMP-6)會(huì)使細(xì)胞微團(tuán)的重量增加10倍以上，產(chǎn)生的基質(zhì)也更多。Mastrogiacoma[17]等的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)使BMSCs保持在一種不成熟的狀態(tài)中，并有強(qiáng)烈的促增殖作用，同時(shí)可誘導(dǎo)MSCs分化成軟骨細(xì)胞。

1.1.3 體外三維支架環(huán)境中誘導(dǎo)：因?yàn)轶w內(nèi)細(xì)胞都是在三維空間中生長(zhǎng)、繁殖、分化并發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能的，在用組織工程技術(shù)構(gòu)建軟骨或修復(fù)的過(guò)程中，細(xì)胞支架可模擬機(jī)體的狀態(tài)，提供一個(gè)穩(wěn)定的三維空間支架結(jié)構(gòu)，并保持足夠的空隙率，供細(xì)胞在其中附著、分化、增殖、物質(zhì)交換、生長(zhǎng)代謝，引導(dǎo)軟骨組織形成，并為細(xì)胞自分泌或旁分泌的細(xì)胞因子提供暫時(shí)的附著點(diǎn)。U1rich[18]等以包埋后聚羥基乙酸(PGA)為載體，在體外應(yīng)用含TGF-β1，特定培養(yǎng)液定向誘導(dǎo)人BMSCs，結(jié)果證實(shí)有軟骨樣組織形成，并在蛋白和分子水平檢測(cè)到軟骨細(xì)胞分泌的II型膠原、IX型膠原。夏萬(wàn)堯[19-20]等以豬髂骨骨髓中分離得到的BMSCs體外低糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2周，傳代后以濃度為5×107/ml細(xì)胞懸液均勻接種于管狀PGA支架上，以高糖DMEM低血清特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)lO周時(shí)，BMSCs-PGA復(fù)合物外觀呈乳白色軟骨樣，管壁較厚,有一定的彈性，但中間部管腔塌陷較明顯，HE染色見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組管狀BMSCs-PGA復(fù)合物表層為2～4層成纖維樣細(xì)胞樣組成的軟骨膜，下層為較成熟的軟骨組織，軟骨細(xì)胞均勻分布，包埋在軟骨陷窩內(nèi)，結(jié)構(gòu)較致密和規(guī)則，免疫組化也證實(shí)在形成的軟骨基質(zhì)中有大量被特異性染成棕黃色顆粒的Ⅱ型膠原分布；而對(duì)照組管狀BMSCs-PGA完成解體，僅剩一層薄薄的膜狀組織。此研究結(jié)果表明利用BMSCs為種子細(xì)胞，復(fù)合管狀PGA支架，應(yīng)用特定的培養(yǎng)液可在體外構(gòu)建管狀軟骨，這對(duì)將來(lái)臨床應(yīng)用BMSCs作為種子細(xì)胞，修復(fù)軟骨缺損或構(gòu)建復(fù)合組織氣管具有一定的應(yīng)用前景。王會(huì)才[21]等觀察微重力條件下動(dòng)態(tài)三維誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化!并與靜態(tài)培養(yǎng)作比較得出結(jié)論：立體誘導(dǎo)優(yōu)于平面誘導(dǎo)，微重力動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可提高細(xì)胞誘導(dǎo)分化質(zhì)量。

1.1.4 與軟骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)：許多研究證實(shí)軟骨細(xì)胞可分泌多種對(duì)BMSCs有誘導(dǎo)作用的生長(zhǎng)因子如TGF-β、IGF及CDMP等。苗春雷[22]等應(yīng)用軟骨細(xì)胞和BMSCs以8∶2的比例混合接種在PGA支架上體外共培養(yǎng)，能誘導(dǎo)BMSCs分化為成熟的軟骨細(xì)胞并形成軟骨組織，組織學(xué)顯示有較連續(xù)的成熟軟骨形成，有大量成熟的軟骨陷窩，免疫組化證實(shí)有II型膠原分泌。而對(duì)照組應(yīng)用單純相同數(shù)量BMSCs在體外僅形成纖維樣組織，單獨(dú)應(yīng)用相同數(shù)量的少量軟骨細(xì)胞與同體積生物材料混合接種培養(yǎng)，也只能形成極少量的不連續(xù)的軟骨組織，明顯少于共培養(yǎng)組，說(shuō)明去除軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)作用后，BMSCs不能單獨(dú)在體外形成成熟的軟骨組織，而且軟骨細(xì)胞量太少時(shí)，也只能形成極少量的軟骨組織。從這實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)在體外共培養(yǎng)過(guò)程中，由于BMSCs與軟骨細(xì)胞的充分接觸，軟骨細(xì)胞分泌多種誘導(dǎo)因子如TGF-β1、IGF及CDMP等有可能以旁分泌方式作用于BMSCs，誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞表型分化，同時(shí)BMSCs也暴露于軟骨細(xì)胞分泌的特異性細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅱ型膠原。軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨細(xì)胞膜表面分子也可能在誘導(dǎo)大量BMSCs向軟骨細(xì)胞分化并在體外形成軟骨起重要作用，說(shuō)明軟骨細(xì)胞是一個(gè)良好的誘導(dǎo)因素，能有效地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。

1.2 體內(nèi)誘導(dǎo)：體內(nèi)誘導(dǎo)包括體內(nèi)軟骨微環(huán)境誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)。

1.2.1 體內(nèi)軟骨微環(huán)境誘導(dǎo)：關(guān)節(jié)軟骨再生主要靠缺損周圍軟骨細(xì)胞分泌或關(guān)節(jié)滑液中含有的多種因子，使遷移到缺損處的間充質(zhì)干細(xì)胞，在局部合適的軟骨微環(huán)境中，再加上關(guān)節(jié)活動(dòng)時(shí)的力學(xué)刺激，被誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞并修復(fù)軟骨缺損。董啟榕[23]等將兔BMSCs細(xì)胞體外增殖后與II型膠原凝膠混勻，植入到兔股骨滑車關(guān)節(jié)面上軟骨缺損處，直徑3mm、深度3mm達(dá)骨髓腔；對(duì)照組為單純Ⅱ型膠原凝膠，4周后實(shí)驗(yàn)組缺損處可見(jiàn)透明軟骨樣組織充填，l2周后缺損處軟骨及軟骨下骨大部分得到修復(fù)，邊界清楚，表面稍不平整。而對(duì)照組缺損主要為纖維樣軟骨修復(fù)為主，這說(shuō)明BMSCs和II型膠原凝膠的復(fù)合物，在關(guān)節(jié)軟骨原位修復(fù)時(shí)，即使沒(méi)有體外誘導(dǎo)的過(guò)程，在關(guān)節(jié)微環(huán)境誘導(dǎo)誘導(dǎo)條件下，也能部分修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)培養(yǎng)：近年還發(fā)現(xiàn)BMSCs不僅具有多向分化潛能，還易于外源基因的轉(zhuǎn)染并能穩(wěn)定表達(dá)外源基因，因此利用基因工程方法將主要誘導(dǎo)因子基因轉(zhuǎn)入BMSCs，使外源基因在一定時(shí)期內(nèi)能高效表達(dá)，植入體內(nèi)后能通過(guò)自分泌或旁分泌途徑來(lái)表達(dá)目的誘導(dǎo)因子，進(jìn)一步促進(jìn)其分化和維持表型穩(wěn)定，從而彌補(bǔ)由于突然失去體外誘導(dǎo)培養(yǎng)液中的高濃度誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)作用而發(fā)生“反分化”。鄭啟新[24]等應(yīng)用真核表達(dá)載體pcDNA3，1-TGF-β1轉(zhuǎn)染BMSCs，可使BMSCs有效表達(dá)活性TGF-β1達(dá)3周；在此研究的基礎(chǔ)上，郭曉東[25]等進(jìn)一步用真核表達(dá)載體pcDNA3，1-TGF-β1轉(zhuǎn)染的BMSCs作為種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)后接種到多聚賴氨酸包埋的聚DL乳酸可降解多孔材料(PDLLA)，修復(fù)同種異體兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，修復(fù)后24周，實(shí)驗(yàn)組新生透明樣軟骨表面平整，軟骨下骨再生，與鄰近新骨、軟骨結(jié)合緊密，新生組織周圍僅有少量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因的BMSCs植入體內(nèi)后，可能使BMSCs的hTGF-β1自分泌、旁分泌功能顯著加強(qiáng)，通過(guò)在缺損處局部形成有效hTGF-β1的濃度，表層的BMSCs在關(guān)節(jié)腔內(nèi)低氧壓力以及關(guān)節(jié)應(yīng)力的環(huán)境下，向軟骨分化。付勤[26]等應(yīng)用TGF-p。和IGF-l基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs后大鼠BMSCs原代細(xì)胞接種24 h后可見(jiàn)少量貼壁突起細(xì)胞，4、5 天開(kāi)始形成典型的BMSCs簇狀增生9、10天細(xì)胞生長(zhǎng)即可達(dá)80％～90％融合；傳代后細(xì)胞形態(tài)較均一免疫熒光法檢測(cè)BMSCs的CD29、CD44呈陽(yáng)性反應(yīng)，CD34、CD45呈陰性反應(yīng)。TGF-β1和IGF1基因共同轉(zhuǎn)染BMSCs修復(fù)軟骨缺損是一個(gè)較有前景的發(fā)展方向，對(duì)組織工程軟骨應(yīng)用于臨床具有重要意義。

2BMSCs應(yīng)用于軟骨組織工程中存在的幾個(gè)問(wèn)題

2.1 BMSCs構(gòu)建的軟骨組織工程化組織較正常軟骨形態(tài)、生物力學(xué)性能存在差異：Wakitani等1994年首先報(bào)道了用體外純化培養(yǎng)的自體骨髓MSCs摻入I型膠原凝膠修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨大的全厚缺損，術(shù)后2周即形成透明軟骨，24周缺損的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨得以修復(fù)，但修復(fù)的軟骨比正常關(guān)節(jié)軟骨薄，有些區(qū)域缺乏軟骨蛋白多糖著色。與周圍軟骨融合仍不完全．力學(xué)測(cè)試結(jié)果低于正常軟骨，而采用來(lái)源于骨膜BMSCs的效果更差。 1996年Miriam等以高密度培養(yǎng)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型后，將BMSCs摻入2%的高分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行自體移植修復(fù)羊膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，3個(gè)月后形成了組織結(jié)構(gòu)與正常關(guān)節(jié)軟骨相似的透明軟骨。但形態(tài)結(jié)構(gòu)仍有差別，其最終的轉(zhuǎn)歸還需更長(zhǎng)時(shí)間的觀察。可見(jiàn)，雖然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)性培養(yǎng)和體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)均能有效地生成軟骨，但只能達(dá)到組織形態(tài)及生化成分上類似，不能實(shí)現(xiàn)與原有軟骨相同的再生。因此目前尚無(wú)組織工程學(xué)方法能高質(zhì)量地修復(fù)軟骨缺損并獲得很好的遠(yuǎn)期療效，要成功產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨還需進(jìn)一步模擬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向生理狀態(tài)下軟骨分化的調(diào)控。

2.2 如何調(diào)控BMSCs定向分化成軟骨細(xì)胞，使其分化的初級(jí)軟骨細(xì)胞分化為成熟軟骨細(xì)胞，并抑制其向肥大軟骨細(xì)胞分化，這也是目前軟骨組織工程學(xué)中的重要問(wèn)題。這需要更深入的研究了解BMSCs分化機(jī)制。從而指導(dǎo)調(diào)控。

2.3 適合于BMSCs的組織工程基質(zhì)材料同樣是目前研究的難點(diǎn)：理想的軟骨組織工程基質(zhì)材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①良好的生物相容性：其本身或降解產(chǎn)物對(duì)種子細(xì)胞和機(jī)體無(wú)毒性，不會(huì)引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)；②良好的生物降解性：降解速度需和組織再生速度相匹配，最后可完全吸收；③ 具有三維多孔立體結(jié)構(gòu)。④可加工性和有一定的機(jī)械強(qiáng)度；⑤良好的材料－細(xì)胞界面；⑥良好的消毒性能[27]。常用的軟骨組織工程基質(zhì)材料按其來(lái)源可分為人工合成和天然材料二大類。合成材料主要有：聚羥乙酸(PGA)、聚乳酸(PLLA、PDLLA)、聚乳酸/聚羥乙酸共聚物(PL－GA)、透明質(zhì)酸(HA)、藻酸鈣凝膠、聚氧乙烯水凝膠、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(Pluronic)、聚丙烯延胡索酸鹽(PPF)、聚酐、聚磷酸酯等。天然材料有膠原(I或Ⅱ型)、纖維蛋白凝膠、硫酸軟骨素、脫鈣骨基質(zhì)(DBM)、明膠等[27-28]。這些基質(zhì)材料各有其優(yōu)缺點(diǎn)。其中PLGA、HA、Pluronie、PGA/PLLA、PDLLA等在軟骨組織工程研究中顯示了良好的性能而被廣泛接受。

2.4 BMSCs作為軟骨組織工程種子細(xì)胞存在的醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題：從患者骨髓穿刺獲取骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，用于修復(fù)軟骨缺損等，與多次切取自體軟骨組織移植相比，患者更愿意接受。間充質(zhì)干細(xì)胞由于是自體細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增誘導(dǎo)后重新回植，所以病人更容易在心理上接受，涉及的倫理道德問(wèn)題也較少，因此已成為組織工程軟骨組織種子細(xì)胞的主要來(lái)源[29]。

3BMSCs在軟骨組織工程化組織構(gòu)建中的應(yīng)用前景

正是由于BMSCs具有良好的多組織分化潛能和高增殖活性，獲取方法簡(jiǎn)便易行。便于自體移植．故在組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用前景。但就軟骨組織工程而言。有關(guān)BMSCs在很多方面還需要進(jìn)一步研究。一些基本的問(wèn)題需要給以準(zhǔn)確的回答。例如．BMSCs經(jīng)體外大量擴(kuò)增后如何能很好地保持多能干細(xì)胞的生物學(xué)特性；BMSCs分化為軟骨組織，是軟骨內(nèi)成骨的中間過(guò)程還是終極分化；BMSCs的軟骨細(xì)胞表型分化和維持的關(guān)鍵外部刺激信號(hào)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等等 隨著B(niǎo)MSCs各方面研究的不斷深入。相信在不久的將來(lái)它很可能成為組織損傷修復(fù)的有力工具。

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[收稿日期]2008-11-10[修回日期]2009-01-08

編輯/張惠娟