鄭　洲　繆錦來

摘要光鑷?yán)庾V技術(shù)（LTRS）是將光學(xué)囚禁技術(shù)與顯微拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，用同一束光來實(shí)現(xiàn)囚禁單個(gè)懸浮細(xì)胞并激發(fā)細(xì)胞分子的拉曼光譜。利用LTRS系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)南極石油烴降解嗜冷菌細(xì)胞內(nèi)的生化代謝過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測，了解其參與石油烴分解代謝的過程，獲知單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部生化分子變化與環(huán)境變化的相互關(guān)系，更好的了解其降解機(jī)制。

關(guān)鍵詞光鑷?yán)庾V技術(shù)；南極細(xì)菌；石油烴；低溫降解

中圖分類號(hào)X55文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2009）04-0263-02

1光鑷?yán)庾V技術(shù)特點(diǎn)

激光拉曼光譜法被公認(rèn)為是研究生物大分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和功能的有效方法，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域很有應(yīng)用潛力的工具。從拉曼光譜特征峰的位置、強(qiáng)度和線寬可以獲得樣品的分子組成及結(jié)構(gòu)信息，拉曼光譜已成為研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有效手段。共焦顯微拉曼光譜技術(shù)可以研究單個(gè)細(xì)胞甚至細(xì)胞器，但由于人為的用物理或化學(xué)手段固定研究對(duì)象，細(xì)胞周圍的環(huán)境發(fā)生改變，甚至細(xì)胞死亡，對(duì)細(xì)胞的生理帶來了未知的影響。最近，光鑷?yán)庾V技術(shù)（laser-tweezers-Raman-spectroscopy，LTRS）的出現(xiàn)，使人們可以在接近自然的生理狀態(tài)下研究單個(gè)懸浮細(xì)胞或細(xì)胞器[1，2]。LTRS是將光學(xué)囚禁技術(shù)與顯微拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，用同一束光來實(shí)現(xiàn)囚禁單個(gè)懸浮細(xì)胞并激發(fā)細(xì)胞分子的拉曼光譜，其原理是利用高度匯聚的激光束產(chǎn)生的梯度力囚禁溶液中的活細(xì)胞，使之固定在激光微束中，再通過瞬時(shí)增強(qiáng)的光束來激發(fā)細(xì)胞內(nèi)分子的拉曼光譜，從而實(shí)時(shí)獲得該細(xì)胞的拉曼光譜及其生化性質(zhì)。由于細(xì)胞被囚禁在光束焦點(diǎn)位置，共焦光路優(yōu)化了散射光的收集，從而可獲得高靈敏度。選用適當(dāng)?shù)募す獠ㄩL、功率和激發(fā)時(shí)間，激光束不會(huì)傷害細(xì)胞，被囚禁的細(xì)胞依然懸浮在不受干擾的環(huán)境中，得到的是接近自然生理狀態(tài)的單個(gè)活細(xì)胞的拉曼光譜。

2LTRS在單細(xì)胞中的應(yīng)用情況

光鑷?yán)庾V技術(shù)可以在接近自然的生理狀態(tài)下研究單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器，探索接近生理狀態(tài)下的單細(xì)胞生命活動(dòng)，可以無損地提供豐富的分子結(jié)構(gòu)和物質(zhì)成分的信息，是一種很有應(yīng)用潛力的工具，正在生命科學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。目前，光鑷?yán)庾V技術(shù)已用于研究溶液中單個(gè)活體的紅細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等，得到不同細(xì)胞的高質(zhì)量的拉曼光譜，使得研究溶液中的單個(gè)活細(xì)胞的生化性質(zhì)成為可能。Tang等[2]利用光鑷?yán)庾V技術(shù)研究了火炬松轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的單細(xì)胞拉曼光譜特征。LTRS系統(tǒng)可以成為區(qū)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的有效手段。楊文沛等[3]利用LTRS系統(tǒng)測量了單個(gè)肝癌細(xì)胞的拉曼光譜，并利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)光譜進(jìn)行分析，從而建立一個(gè)識(shí)別正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的數(shù)學(xué)模型，表征了單個(gè)肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異。岳糧躍等[4]利用LTRS系統(tǒng)對(duì)紅細(xì)胞凍存前后的變化，以及對(duì)紅細(xì)胞被解凍后在不同溶液中的變化情況進(jìn)行了拉曼光譜研究。王桂文等[5]研究表明，LTRS 系統(tǒng)可以研究單個(gè)血小板細(xì)胞的拉曼光譜，并可以區(qū)分不同物種的血小板，是研究溶液中接近自然生理狀態(tài)下小生物體、細(xì)胞的有力工具，為進(jìn)一步研究血小板的生理生化反應(yīng)提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。王桂文等[6]采用LTRS系統(tǒng)，在水溶液中直接俘獲單個(gè)伴孢晶體，并收集其拉曼光譜信號(hào)，得到群體伴孢晶體的分子結(jié)構(gòu)和群體內(nèi)各晶體蛋白之間的信息。該方法免去了復(fù)雜的純化過程，為Bt伴孢晶體蛋白的研究提供了一種快速簡便、可以洞悉群體內(nèi)單個(gè)晶體蛋白結(jié)構(gòu)差異的手段。王桂文等[7]利用LTRS系統(tǒng)觀察活性干酵母單細(xì)胞活化過程，記錄了干酵母單細(xì)胞的生長現(xiàn)象，既可實(shí)時(shí)觀察單個(gè)細(xì)胞活化過程的光譜變化，又可獲知細(xì)胞間的差異。

3LTRS在南極細(xì)菌低溫降解石油烴中的應(yīng)用

極地石油污染已成為一個(gè)普遍而嚴(yán)重的問題。在最近十幾年里，人類在極地的活動(dòng)日益頻繁，大量的柴油、潤滑油和原油進(jìn)入海水中，人為給極地海洋造成了烴污染，石油烴已經(jīng)成為極地海洋生態(tài)系統(tǒng)中的主要污染物。由于極地海洋常年處于低溫狀態(tài)，短鏈?zhǔn)蜔N蒸發(fā)緩慢，長鏈烴凝為固體，使有機(jī)污染物持久存在，對(duì)當(dāng)?shù)厣镔Y源及生態(tài)環(huán)境的危害很大。因此，對(duì)低溫環(huán)境下石油烴降解的研究十分重要，而生物降解以其高效、安全日益受到人們的重視。

微生物群落對(duì)石油烴的生物降解是清除污染物的一個(gè)主要機(jī)制。南極嗜冷菌在低溫海洋環(huán)境中可以高效降解石油，當(dāng)南極生態(tài)系統(tǒng)被石油烴污染后，能降解石油烴的土著微生物便開始迅速生長，以適應(yīng)被污染的環(huán)境[8]。環(huán)境因素和生物因素決定了石油烴生物降解的速率和程度。在極地海洋生態(tài)系統(tǒng)中，石油烴的降解涉及到的主要環(huán)境因素是溫度。溫度影響石油烴的物理性質(zhì)和化學(xué)組分、微生物的代謝速率和微生物群落組成，間接對(duì)烴的降解速率產(chǎn)生影響，研究表明南極細(xì)菌在20℃對(duì)石油烴的降解率高于4℃。然而，低溫時(shí)細(xì)菌對(duì)石油烴的降解雖然緩慢，但是經(jīng)過一段時(shí)間后，降解率與常溫下并無區(qū)別，這表明低溫僅僅延遲了降解時(shí)間，并不影響最終的降解率[9]。迄今，已發(fā)現(xiàn)的南極烷烴低溫降解菌較少，對(duì)其研究也均以菌株的鑒定、催化反應(yīng)和降解組分分析為主[10]。對(duì)烷烴低溫降解過程中南極菌單個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部生化分子變化及其參與烷烴代謝的機(jī)制還不清楚，這些基本問題都亟需研究。

拉曼光譜為獲知單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部生化分子變化與環(huán)境變化的相互關(guān)系提供了有力的工具，從拉曼光譜的特征峰的位置、強(qiáng)度和線寬可以獲得樣品的分子組成及結(jié)構(gòu)信息。近年來，已有學(xué)者用拉曼光譜技術(shù)對(duì)南極微生物細(xì)胞的實(shí)地生命活命活動(dòng)進(jìn)行研究，鑒定了一些化合物，并探明其在微生物適應(yīng)南極極端環(huán)境中的作用和機(jī)制[11]，這些對(duì)南極微生物細(xì)胞生命活動(dòng)的認(rèn)識(shí)通常都是通過研究其群體樣品而得到的統(tǒng)計(jì)平均信息，不能探索接近生理狀態(tài)下的單細(xì)胞生命活動(dòng)。而LTRS技術(shù)可以在接近其自然的生理狀態(tài)下研究單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器，可以實(shí)時(shí)觀察單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物化學(xué)過程，或判別不同類型、不同狀態(tài)的細(xì)胞，獲知很多掩蓋在群體平均信息下的個(gè)體生命信息。細(xì)胞處于溶液中，其生理活性不受影響，可以實(shí)現(xiàn)長時(shí)間對(duì)同一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測。將LTRS技術(shù)應(yīng)用于石油烴微生物低溫降解的研究，可以了解石油烴低溫降解過程中單個(gè)南極細(xì)菌細(xì)胞如何協(xié)調(diào)能量、細(xì)胞生長與烷烴降解三者的關(guān)系，從單個(gè)細(xì)胞水平獲得對(duì)南極細(xì)菌低溫降解石油烴的新認(rèn)識(shí)，獲知單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部生化分子變化與環(huán)境變化的相互關(guān)系；可以實(shí)時(shí)監(jiān)測單個(gè)南極細(xì)菌細(xì)胞低溫降解石油烴的動(dòng)態(tài)過程，并可以結(jié)合光鑷進(jìn)行細(xì)胞分選；還可以同時(shí)記錄石油烴低溫降解過程胞內(nèi)、胞外的實(shí)時(shí)石油烴濃度，這是其他方法無法實(shí)現(xiàn)的。因此，應(yīng)用單細(xì)胞激光鑷子拉曼光譜技術(shù)研究石油烴微生物的低溫降解，可以更好的了解其降解機(jī)制，這對(duì)低溫海洋環(huán)境中石油污染物的消除和環(huán)境修復(fù)具有重要意義。

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