溫壽青　邱　立　汪春?！∴u桂華

【摘要】 目的 探討三磷酸腺苷（ATP）在大鼠胰島分離過程中抑制胰酶對胰島細(xì)胞的消化作用。方法 將20只SD大鼠平均分為兩組，處理組在胰島分離全過程中加用ATP進(jìn)行干預(yù)，對照組則不加ATP處理，采用Ficoll非連續(xù)密度離心純化后對兩組胰島細(xì)胞的凋亡、胰島產(chǎn)量及活力方面進(jìn)行比較性研究。結(jié)果 加用ATP的處理組的胰島細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.01),處理組胰島產(chǎn)量和胰島素釋放水平均顯著高于對照組（P<0.01）。結(jié)論 胰島分離過程中加用一定濃度ATP對胰島具有抑制凋亡和保護(hù)胰島活力的作用。

【關(guān)鍵詞】

胰島分離；ATP；流式細(xì)胞儀；凋亡

Protective effect of ATP in rat islets isolation

WEN Shou-qing,QIU Li,WANG Chun-fu,et al.Baoan Peoples Hospital,Shenzhen 518101,China

【Abstract】 Objective To observe the anti-apoptosis effect of ATP in rat islets isolation.Methods The rats were devided into 2 groups according whether with the treatment of ATP during the islets isolation.The purified islets by Ficoll were compared between the groups.Results The outcome and anmouts of insulin release under the glucose stimulating of isolated and purified islets in ATP group were superior to those in the control group(P<0.01).The number of apoptosis islet cells in ATP group were fewer than those in control group(P<0.01).Conclusion With the treatment of ATP during the islets isolation may protect the islets from trypsin digestion and prevent apoptosis of islet cells.

【Key words】 Islet isolation; ATP; Flow cytometer; Apoptosis

胰島移植通過β細(xì)胞替代療法治療1型糖尿病，近年來成為研究的熱點(diǎn)［1］。但與其他移植治療一樣，供體來源的短缺仍是人同種異體胰島移植在臨床廣泛開展所面臨的重大困難,而目前大多數(shù)的臨床胰島移植需要2~3個(gè)供體胰腺分離所獲的胰島量來達(dá)到完全脫離胰島素依賴的效果［2］。一個(gè)主要原因是在胰島分離純化過程中缺氧引起胰島細(xì)胞的凋亡和死亡［3］，，影響了移植胰島的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)直接針對缺氧這個(gè)重要的損傷因素，在整個(gè)移植前處理過程中加用三磷酸腺苷（ATP）對胰島進(jìn)行保護(hù)，觀察其對胰島損傷，特別是在細(xì)胞凋亡過程中所產(chǎn)生的影響和效果。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 膠原酶V，由SIGMA公司提供；分散酶Dispase Ⅱ由美國羅氏公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供；Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒有Biovision公司提供；大鼠胰島素ELISA試劑盒由Mercodia公司提供。

1.2 動物來源、分組和處理SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量250~300 g，由廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物合格證號：NO.0010321）提供。20只大鼠隨機(jī)分成兩組,ATP處理組10只，在胰導(dǎo)管逆行注射膠原酶時(shí)加用ATP注射液2 ml，20 mg。對照組10只，處理過程中不加ATP，等量生理鹽水代替。

1.3 胰島的分離和純化 實(shí)驗(yàn)大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，無菌術(shù)下正中線開腹，結(jié)扎胰膽管近肝端，皮試注射器胰管逆行注射1.5 mg/ml膠原酶溶液10 ml，使胰腺充分膨脹，取下整個(gè)胰腺后剪碎，37℃水浴消化10 min后，加入含20%小牛血清的Hanks液終止消化，不銹鋼濾網(wǎng)過濾，Hanks液洗滌離心2次。ATP處理組在整個(gè)分離過程中的Hanks液中均加用ATP(5000 U/ml)處理。

胰島純化采用Ficoll400不連續(xù)梯度離心法。將分離后的沉淀物加入25%的Ficoll400溶液4 ml，充分混勻后，在液層上依次加入23%,20%，10%的Ficoll400溶液，2000轉(zhuǎn)/min低溫離心15 min后，吸取23%，20%兩層之間以及20%，10%兩層之間的胰島，Hanks液洗離心2次。用含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液收集胰島。

1.4 胰島產(chǎn)量計(jì)數(shù) 純化后的胰島用雙硫腙（DTZ）染色。用定量加樣器在胰島懸液中取樣3次，每次50 μl鏡檢DTZ染色陽性細(xì)胞團(tuán)，按以下公式［4］計(jì)算胰島量：胰島數(shù)=3次細(xì)胞團(tuán)總數(shù)÷3×20×樣本總體積（ml）。

1.5 原位末端核苷酸標(biāo)記法（TUNEL）觀察胰島細(xì)胞凋亡 將純化后的胰島細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)接種于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，按上述實(shí)驗(yàn)分組處理，自然干燥后，加2%多聚甲醛固定1 h，PBS漂洗5 min，浸入3%雙氧水/甲醇溶液中室溫封閉10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。然后浸入0.1%TritonX-100室溫處理 10 min，PBS洗3次。加TdT酶反應(yīng)液37℃避光反應(yīng)60 min,PBS漂洗后滴加Streotavidin-HRP工作液，避光反應(yīng)30 min后，滴加DAB顯色，室溫避光反應(yīng)15 min，PBS漂洗后直接光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Annexin-V/PI定量分析胰島細(xì)胞凋亡率 純化后的胰島懸液中加入2 ml分散酶Dispase Ⅱ，37℃水浴搖床消化15 min，18G針筒抽吸數(shù)次，獲得胰島單細(xì)胞懸液獲得含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液8 ml中止消化。用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗2次，收集細(xì)胞記數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml,對照管和檢測管每管各加100 μl細(xì)胞懸液，每管分別加5 μl PI和Annexin V-FITC抗體，避光室溫孵育10 min后，美國Coulter公司ATRLA型流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.7 流式細(xì)胞儀對Bcl-2/Fas-L表達(dá)水平的檢測 制備胰島單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，加入Fixation劑100 μl,固定15 min,加入PBS1 ml清洗1次,離心后再用PBS清洗1次，將上面細(xì)胞分成兩管,一管加入同性對照,一管加入Bcl-2及Fas-L一抗試劑1 μg,在避光孵育15 min。用PBS清洗1次,加入二抗FITC 10 μl試劑,避光孵育15 min,用PBS清洗1次,將樣本放置在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上檢測,采用SystemⅡ軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.8 葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測胰島功能 純化后的胰島經(jīng)Hanks液洗滌3次，分別轉(zhuǎn)移至無糖，低糖（2.7 mmol/L）和高糖（16.7 mmol/L）無血清RPML-1640培養(yǎng)基中，每孔100個(gè)胰島，于37℃,5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，收集培養(yǎng)液，用大鼠胰島素ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，測定培養(yǎng)液中的胰島素水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。使用SPSS 11.5軟件，采用兩個(gè)樣本t檢驗(yàn)及兩組樣本率比較的秩和檢驗(yàn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATP處理對胰島產(chǎn)量的影響 分離純化后的胰島數(shù)量，ATP處理組的胰島產(chǎn)量（312.3±6.2）個(gè)較對照組（306.5±5.6）個(gè)之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 原位末端核苷酸標(biāo)記法檢測胰島細(xì)胞凋亡 胞核呈深棕色的陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。光鏡下觀察結(jié)果顯示,處理組的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組。見圖1：

2.3 Annexin V/PI雙染色檢測胰島凋亡結(jié)果 通過流式細(xì)胞儀定量檢測胰島細(xì)胞凋亡，結(jié)顯示ATP處理組的平均細(xì)胞凋亡率為(8.6±2.9)%,而對照組為（22.7±3.1）%,處理組的胰島細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組（P<0.01）。見圖2。

M1表示細(xì)胞碎片和部分死亡細(xì)胞比例，M2表示死亡細(xì)胞比例，M3表示活細(xì)胞比例，M4表示凋亡細(xì)胞比例。說明：三個(gè)散點(diǎn)圖橫軸的4個(gè)坐標(biāo)從左到右分別為：100，101，102，103三個(gè)散點(diǎn)圖縱軸的4個(gè)坐標(biāo)從下到上分別為：100，101，102，103

2.4 Bcl-2/Fas-L表達(dá)水平的檢測結(jié)果 ATP處理組Bcl-2的陽性率（20.8±1.1）%較對照組陽性率（9.7±1.7）%顯著升高（P<0.01）,同時(shí)處理組Fas-L的陽性率（6.2±0.9）%與對照組陽性率（15.6±2.1）%比較顯著性降低（P<0.01）。

2.5 葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 ATP處理組在低濃度葡萄糖和高濃度葡萄糖刺激下釋放胰島素水平均顯著高于對照組（P<0.01），在無葡萄糖刺激下兩組釋放胰島素水平無顯著性差異（P>0.05），見表1。

3 討論

胰島從生物學(xué)特性上看是相當(dāng)脆弱的細(xì)胞團(tuán),外界微環(huán)境的變化對它形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整和功能的保持都有著顯著的影響。如何提高供體胰島的數(shù)量與質(zhì)量是近年來研究的一個(gè)重要方面。目前的臨床胰島移植，在供體胰島的分離純化過程中，存在很多對胰島損傷的因素，比如機(jī)械力的損傷，缺氧，滲透壓的改變，純化介質(zhì)對胰島的毒性作用，外分泌部腺泡釋放出的胰酶，組織因子［5］等，都會對分離出的胰島造成損害，或使胰島團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞死亡，或是激活凋亡程序。有研究用早期凋亡檢測法證明，在移植前的胰島處理過程中，一部分胰島細(xì)胞的凋亡程序已經(jīng)被啟動，事實(shí)上胰島進(jìn)入受體后的命運(yùn)，是否能抵抗不良因素而成功存活，在移植前就已經(jīng)決定。而解決這個(gè)問題的重要途徑，就是在移植前的整個(gè)處理過程中如何對胰島進(jìn)行保護(hù)［6-7］。

近年相關(guān)研究顯示，胰島自供體胰腺血流阻斷起即進(jìn)入缺氧狀態(tài)，且在整個(gè)分離和培養(yǎng)過程中，直至移植后胰島細(xì)胞團(tuán)內(nèi)微循環(huán)重新建立前的一段時(shí)間，都無有效的氧供，缺氧可導(dǎo)致胰島細(xì)胞線粒體受損，ATP生成障礙，細(xì)胞正常生理活動受損，離子通道功能障礙，從而無法維持正常膜電位，胞質(zhì)Ca2+濃度升高，細(xì)胞膜損傷和溶酶體損傷，由此引起細(xì)胞的死亡或凋亡。

根據(jù)以上情況，本實(shí)驗(yàn)直接針對缺氧這個(gè)重要損傷因素，在整個(gè)移植前處理過程中對胰島進(jìn)行保護(hù)。ATP是維持細(xì)胞生命重要的能量物質(zhì)，細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)ATP大量缺失將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的保護(hù)因素ATP-MgCl₂是臨床常用的能量劑和輔酶類藥物，可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，直接為細(xì)胞提供能量,維持細(xì)胞正常形態(tài)，膜電位，以及維持正常生命活動必需的蛋白質(zhì)合成功能，且ATP可促進(jìn)胰島素的合成，有利于維持和提高待移植胰島的功能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ATP處理組的胰島產(chǎn)量較對照組并無顯著差別，但胰島素釋放實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組的胰島對葡萄糖刺激的反應(yīng)能力優(yōu)于對照組，提示ATP對胰島的功能具有保護(hù)作用。

有研究表明胰島細(xì)胞的凋亡是引起胰島功能損傷的一個(gè)重要因素［10］。為進(jìn)一步研究ATP對分離胰島的保護(hù)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)特別通過TUNEL以及流式細(xì)胞儀對胰島細(xì)胞凋亡的進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，ATP處理組胰島細(xì)胞的凋亡得到有效控制，細(xì)胞凋亡率下降，提示ATP在分離胰島過程中具有抑制胰島細(xì)胞凋亡的作用，對胰島功能的損害起到了抑制效果，從而對胰島的活力具有保護(hù)作用。而通過對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的檢測，進(jìn)一步提示了ATP對胰島凋亡的抑制作用可能是通過促進(jìn)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)和抑制凋亡基因Fas-L的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。但是對ATP細(xì)胞毒性研究顯示，ATP同時(shí)還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［11］，其機(jī)制主要與多個(gè)嘌呤受體激活有關(guān)，包括：P2X₁、P2X₂、P2X₇等。不過近年來的研究顯示，雖然ATP對細(xì)胞凋亡具有雙重作用，但其對產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用的濃度要低于誘導(dǎo)凋亡的濃度很多倍，所以對ATP的濃度控制很重要。另一方面相關(guān)研究證明，在胰島β脈內(nèi)留置時(shí)間長且不易穿破血管壁等優(yōu)勢在臨床上得到廣泛應(yīng)用，為了觀察BD密閉式靜脈留置針在血漿置換術(shù)中應(yīng)用的臨床效果，筆者對2005-2008年間，共236例內(nèi)科系統(tǒng)疾病需行血漿置換的患者， 隨機(jī)分為BD密閉式靜脈留置針組和細(xì)胞中ATP對胰島素的分泌起著重要的調(diào)節(jié)作用［12］，故選擇ATP5000 U/ml濃度，在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，ATP通過動員胞內(nèi)鈣庫的Ca+釋放使胞漿鈣離子濃度顯著增加，觸發(fā)β細(xì)胞強(qiáng)烈分泌胰島素。這就能進(jìn)一步解釋ATP處理組胰島對葡萄糖刺激釋放胰島素量高于對照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提示在胰島分離過程中使用一定濃度的ATP可以起到保護(hù)胰島，抑制胰島細(xì)胞凋亡，提高胰島質(zhì)量的作用。因此有希望成為一種提高臨床胰島移植中供體胰島分離純化效果的有效途徑。目前需進(jìn)一步采用大動物實(shí)驗(yàn)及更進(jìn)一步胰島細(xì)胞凋亡觀察。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Jason L.G,AM..Shapiro,Gordon CW.Islet transplantation:progress and challenge.Achieves of medicalresearch,2005,36:274.

［2］ OlleKorsgren,B.Nilsson,C.Berne,et al.Current status of clinical islet transplantation.Transplantation,2005,79:1289.

［3］ Gray DWR.Avoiding damage transplanted human islets during implantation is important.Transplantation,2005,79:1294.

［4］ 董維平，張洪德，王煜非，等.胰島移植物質(zhì)量鑒定方法的研究.中華器官移植雜志，1998，19:205.