ｐＨ值對檸檬酸深層發(fā)酵的影響與調(diào)節(jié)控制探討

陳西偉

摘要 結(jié)合檸檬酸深層發(fā)酵的生產(chǎn)實際，就檸檬酸深層發(fā)酵過程中pH值對微生物生長和代謝的影響做了深入的探討，并對檸檬酸深層發(fā)酵過程中pH值變化的原因進行了全面分析，以便在生產(chǎn)中采取相應(yīng)的檢測和控制措施，使生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中處于最適宜的pH值環(huán)境下進行，提高檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)率。

關(guān)鍵詞 檸檬酸；深層發(fā)酵；pH值；控制

中圖分類號 TQ920.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）05-0011-02

檸檬酸深層發(fā)酵過程中pH值高低直接影響著生產(chǎn)菌（黑曲霉）的代謝活動以及檸檬酸的合成，同時在發(fā)酵過程中各種酶促反應(yīng)也需要在適宜的pH值下進行，因此發(fā)酵液的pH值變化是發(fā)酵過程中一個重要的控制指標。探討pH值對微生物生長和代謝的影響以及引起發(fā)酵過程pH值變化的原因，并采取相應(yīng)的控制措施，對提高檸檬酸深層發(fā)酵產(chǎn)酸率具有重要的指導(dǎo)意義。

1 pH值對菌體生長和代謝產(chǎn)物合成的影響

微生物生長的pH值范圍很廣，大多數(shù)pH值在5～9之間，其活動的pH值范圍也存在最高、最適、最低三基點。pH值對微生物的生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響有以下幾個方面：一是影響酶的活性，當pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝；二是影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄；三是影響培養(yǎng)基中某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用；四是pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。另外，pH值還會影響某些霉菌的形態(tài)。

根據(jù)不同微生物生長的最適pH值不同，可將微生物分為嗜酸性、嗜堿性、嗜中性微生物；同種微生物的生長最適pH值和產(chǎn)物積累pH值往往不一致，即使在產(chǎn)物積累階段，由于pH值不同，也可能會得到不同的發(fā)酵產(chǎn)物。

2 檸檬酸深層發(fā)酵過程pH值的適宜范圍

確定微生物發(fā)酵的最適pH值范圍，目的是促使發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量最大。最適pH值是根據(jù)試驗結(jié)果并經(jīng)生產(chǎn)實踐檢驗確定的。

檸檬酸發(fā)酵用的生產(chǎn)菌主要是黑曲霉，為嗜酸性的微生物。黑曲霉的生長以及在發(fā)酵過程中的不同階段都需要不同的酸度條件。理論研究和生產(chǎn)實踐證明，黑曲霉可以在很寬的pH值范圍（pH值1.5～11.0）內(nèi)發(fā)育，但在pH值3～7之間比較適宜。黑曲霉發(fā)育的適宜pH值與培養(yǎng)基中的氮源有關(guān)，在糖合成培養(yǎng)基中，黑曲霉的分生孢子在pH值6.2～7.2之間發(fā)芽良好，如果起始pH值＜4.5時就會抑制分生孢子的發(fā)育，在pH值＜2.5時分生孢子甚至不能發(fā)育，但如果pH值＞7.5時，分生孢子會劇烈膨脹甚至破裂。

對于不同原料的發(fā)酵培養(yǎng)基，適宜發(fā)酵的初始pH值有較大的區(qū)別。試驗證明利用黑曲霉在合成培養(yǎng)基（去離子糖140g/L，NH⁴NO³ 2.5g/L，MgSO⁴ 0.25g/L）中發(fā)酵，培養(yǎng)基需要用HCl調(diào)節(jié)到pH值2.5產(chǎn)酸效果最好。在發(fā)酵生產(chǎn)實踐中利用糖蜜原料進行發(fā)酵的初始pH值要求在6.8左右。薯干粉培養(yǎng)基由于在發(fā)酵前期要利用黑曲霉豐富的酶系使培養(yǎng)基中的淀粉進一步轉(zhuǎn)化成可利用的葡萄糖，需要把初始pH值控制在糖化酶適宜范圍之內(nèi)（糖化酶最適宜的pH值在4.0～4.6之間），一般要求其pH值在4.5左右。目前檸檬酸生產(chǎn)多采用玉米糖液（玉米糖化后的過濾液）發(fā)酵，其初始pH值可在糖化過程中利用硫酸或者檸檬酸母液調(diào)節(jié)到4.8～5.2，這樣對糖液的過濾和發(fā)酵都很有利。

對于發(fā)酵進入產(chǎn)酸期的最適宜pH值，試驗研究和生產(chǎn)實踐相一致。進入產(chǎn)酸氣的pH值在3.0以上容易代謝產(chǎn)生副產(chǎn)物草酸，由于葡萄糖氧化酶最適宜pH值為5.6，在該pH值附近容易形成葡萄糖酸。黑曲霉合成積累檸檬酸是在pH值3.0以下進行的，因此當菌體生長完成后進入產(chǎn)酸期要求pH值降到3.0左右是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素，生產(chǎn)中最少要降到3.5才能實現(xiàn)高的產(chǎn)酸率。

發(fā)酵液中氮源和磷源種類或數(shù)量對發(fā)酵最適pH值有很大影響。例如，以NaNO³、（NH⁴）2CO³、尿素為氮源時，即使發(fā)酵液在pH值2.6仍然產(chǎn)生很多草酸，最高達11.8g/L。這是因為在NO³ 被利用，碳酸銨和尿素被分解放出氮時，會使細胞內(nèi)微環(huán)境變堿。在磷酸鹽含量少時，蔗糖發(fā)酵起始pH值5與pH值2比較，草酸比檸檬酸多；而碳酸鹽含量高時，不論pH值在什么水平，所產(chǎn)生的檸檬酸極少而草酸很多。

總之，發(fā)酵微生物生長的最適宜pH值范圍取決于微生物的生態(tài)學(xué)特性、培養(yǎng)基的成分構(gòu)成。發(fā)酵過程中的不同階段也需要控制相應(yīng)的最適宜pH值范圍。

3 發(fā)酵過程pH值的變化

發(fā)酵過程中pH值的變化是微生物代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果，與培養(yǎng)基的組成、微生物的代謝途徑有著密切的關(guān)系。培養(yǎng)基中堿性物質(zhì)的消耗和酸性物質(zhì)的生成自然會引起發(fā)酵液pH值的下降，而酸性物質(zhì)的消耗和堿性物質(zhì)的生成又可引起pH值的上升。同時其他發(fā)酵條件的改變、菌體的自溶以及雜菌污染也將引起發(fā)酵液pH值的變化。因此，pH值的變化決定于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。

在檸檬酸深層發(fā)酵過程中，隨著生產(chǎn)菌種（黑曲霉）對培養(yǎng)基中碳、氮源的利用，以及檸檬酸和其他代謝產(chǎn)物的積累，在正常發(fā)酵過程中不同的發(fā)酵階段pH值的變化具有一定的規(guī)律。一是發(fā)酵前期（生長階段）：菌體產(chǎn)生蛋白酶水解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，生成銨離子，使pH值呈上升的趨勢；但隨著菌體量增多，銨離子的消耗也增多，但由于糖被微生物利用合成有機酸使pH值下降而進入產(chǎn)酸期。二是主發(fā)酵（產(chǎn)酸階段）：其變化與發(fā)酵控制的條件（通風(fēng)量）和消泡劑的添加量有關(guān)。但由于檸檬酸積累量是影響pH值的主要因素，正常發(fā)酵中這個階段pH值趨于穩(wěn)定。三是發(fā)酵后期（自溶階段）：隨著養(yǎng)分的耗盡，菌體蛋白酶的活躍，致使pH值又呈上升趨勢，此時菌體趨于自溶而代謝活動終止。但大量檸檬酸產(chǎn)物的積累總的pH值沒有明顯的變化。

正常發(fā)酵過程中，長菌期以后pH值的下降都能達到檸檬酸積累所希望的水平，但pH值的下降速度是值得重視的問題，不能降得太快，否則會導(dǎo)致菌體生長不足和菌體早衰。尤其是在薯干粉直接發(fā)酵的情況下，還對糖化酶活力有很大的影響，使糖化不徹底導(dǎo)致發(fā)酵殘?zhí)沁^高，產(chǎn)酸率下降。

引起發(fā)酵液pH值下降的因素：①培養(yǎng)基中碳、氮比例不當。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加上溶氧不足，致使有機酸大量積累而pH值下降；②消泡劑加得過多；③生理酸性物質(zhì)存在，銨被利用，pH值下降。

引起發(fā)酵液pH值上升的因素：①培養(yǎng)基中碳、氮比例不當，氮源過多，氨基氮釋放，使pH值上升；②生理堿性物質(zhì)存在；③添加中和劑；④菌種退化和發(fā)酵過程中存在污染雜菌。

4 發(fā)酵過程中pH值的檢測

發(fā)酵過程中pH值的檢測十分重要，只有通過檢測pH值才能及時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵pH值的變化規(guī)律，判斷發(fā)酵是否處在相應(yīng)的最適宜pH值范圍之內(nèi)，并及時做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)和控制。實際生產(chǎn)中，通常采用pH試紙和pH電極對pH值進行測量。筆者所接觸的多家檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)均采用取樣測量發(fā)酵pH值，正常發(fā)酵每班間斷取1～2次，由于間斷取樣不能及時反映發(fā)酵過程的pH值，不利于發(fā)酵控制，而且多次取樣會造成發(fā)酵液的浪費和環(huán)境的污染。目前已試制成功適合于發(fā)酵過程適時監(jiān)測pH值的電極，能連續(xù)測定并記錄pH值的變化，將信號放大輸出并顯示或者記錄下來，實現(xiàn)在線檢測。

5 發(fā)酵過程中pH值的調(diào)節(jié)及控制

（1）微生物生長增殖發(fā)育的pH值調(diào)節(jié)與控制。首先考慮和試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使它們適當配比，使發(fā)酵過程中的pH值在合適范圍內(nèi)變化。采用淀粉或薯干粉等原料的檸檬酸發(fā)酵過程，淀粉的糖化和檸檬酸的合成與積累是處在同一個環(huán)境中，都是由檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉完成的。發(fā)酵的技術(shù)關(guān)鍵是兼顧糖化和產(chǎn)酸，保證糖化速度和產(chǎn)酸速度之間的銜接與平衡。黑曲霉檸檬酸生產(chǎn)菌的酸化糖化酶的最適pH值為4.0～4.6，隨著pH值的下降，尤其當pH值降到2.2時，液化酶和糖化酶會大量被破壞，而檸檬酸發(fā)酵的最佳pH值是2.0以下。要解決兩者矛盾，可采用下列方法：一是采用酸化平板馴化，分離在高檸檬酸濃度下糖化酶活力高的菌株；二是通過調(diào)節(jié)風(fēng)量來控制，通常在16～18h前控制風(fēng)量，使pH值維持在有利于菌種生長和糖化作用的范圍。

在薯干粉的檸檬酸發(fā)酵中，初始不調(diào)節(jié)pH值，為自然pH值，約為5.5。當接入菌種后，菌種生長繁殖消耗氮源和銨離子，使培養(yǎng)基的pH值下降，前期（12h）pH值下降較快，活力強的菌種培養(yǎng)12h，pH值可以降至2.3～2.5，這時會有少量的檸檬酸產(chǎn)生，但是由于發(fā)酵液固形物較多，原料成分繁雜，其中金屬離子含量較多，緩沖作用大，再加上檸檬酸是3個羧基的有機酸，氫離子釋放是逐步的，所以有時培養(yǎng)48h，才能使pH值降至2.0以下。這樣就有充分的時間讓酸性糖化酶作用，使原料中的淀粉糖化較徹底，進而轉(zhuǎn)化為大量的檸檬酸。當檸檬酸產(chǎn)量和殘?zhí)呛恐偷扔诨蚪咏鹗歼€原糖時，才能提高通風(fēng)量，迅速進入產(chǎn)酸期，使pH值迅速降至2.0以下，保證檸檬酸發(fā)酵的正常進行。

糖蜜原料本身有酸性的，也有堿性的，在黃血鹽或其他方法處理前要根據(jù)不同的情況加以調(diào)節(jié)。為了得到較高和穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)酸率，調(diào)酸度時還要考慮加熱時間的影響。對于酸性原料，pH值應(yīng)調(diào)得比堿性原料高些，因為它具有延時緩沖性，它配制的培養(yǎng)基在滅菌后會酸化，稱為返酸，而堿性原料的性質(zhì)正好相反。pH值調(diào)節(jié)一般用H2SO⁴或Na2CO³，參與調(diào)節(jié)范圍為pH值6.0～7.2。

（2）發(fā)酵進入產(chǎn)酸期pH值的調(diào)節(jié)與控制。為了確保發(fā)酵的順利進行，必須使其各個階段經(jīng)常處于最適pH值范圍之內(nèi)，這就需要在發(fā)酵過程中不斷地調(diào)節(jié)和控制pH值的變化。正常發(fā)酵過程中，長菌期以后pH值的下降都能達到檸檬酸積累所希望的水平。如果達不到要求，還可在發(fā)酵過程中補加酸或堿。過去是直接加入酸（如H2SO⁴）或堿（如NaOH）來控制，現(xiàn)在常用的是以生理酸性物質(zhì)（NH⁴）2SO⁴和生理堿性物質(zhì)氨水來控制，它們不僅可以調(diào)節(jié)pH值，還可以補充氮源。

經(jīng)試驗證明，黑曲霉偏好于無機氮，當有機氮和無機氮同時存在時，它首先利用無機氮。在無機氮中，生理酸性氮比堿性氮好，這是因為生理酸性氮中銨離子被利用后，使培養(yǎng)基變酸，可以使發(fā)酵中的黑曲霉生長階段結(jié)束，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸階段，pH值下降到較低水平有利于檸檬酸的積累。因此，銨鹽既可以調(diào)節(jié)代謝，也可以控制pH值。簡單的有機氮比復(fù)雜的好，如尿素比氨基酸好，氨基酸比蛋白胨好。在蔗糖合成培養(yǎng)基上，NH⁴NO³是最好的氮源。黑曲霉以同樣的速度消耗2種氮，所以培養(yǎng)基酸度不變。但糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中還需添加少量NH⁴Cl。若原料中有機氮含量過于豐富，菌生長代謝加快，對縮短發(fā)酵周期有利，但是不利于檸檬酸積累，產(chǎn)酸率不高。這就是不能直接利用含蛋白質(zhì)豐富的粗玉米粉的原因。

另據(jù)報道，在檸檬酸發(fā)酵中途添加銨鹽，尤其是當發(fā)酵中檸檬酸生成速度開始下降時，添加銨離子最為有利，且對菌體無影響，這種效應(yīng)可能與銨離子對檸檬酸積累調(diào)節(jié)作用有關(guān)。近年來，我國采用高濃度薯干粉發(fā)酵，為縮短發(fā)酵周期，提高檸檬酸產(chǎn)酸速率，有時也添加0.01%～0.05%的（NH⁴）2SO⁴。

（3）發(fā)酵過程通風(fēng)量對pH值的調(diào)節(jié)作用。在薯干粉發(fā)酵中，黑曲霉還擔負著糖化的任務(wù)，糖化的適宜pH值在4.0左右，雖然工業(yè)上并不嚴格控制在4.0水平，但在糖化基本完成之前，必須控制低風(fēng)量使pH值緩慢降到2.5，這個過程需16～18h。當產(chǎn)酸量加上還原糖量接近起始可發(fā)酵總量（其差比大于10g/h·L）時，則可以認為糖化已經(jīng)完成，這時可適當加大風(fēng)量使發(fā)酵進入產(chǎn)酸期。在產(chǎn)酸期內(nèi)控制風(fēng)量使產(chǎn)酸速率維持在2～3g/h·L，不得過快，以進一步利用糖化作用和防止菌體過早衰老。

（4）中和劑對發(fā)酵pH值調(diào)節(jié)的應(yīng)用。為了防止pH值下降過快造成不利影響，也可以在發(fā)酵的第18～40h加入少許CaCO³（5～10g/L）以中和酸度，但不得使pH值超過3.0，否則會多產(chǎn)草酸。當用NH⁴+鹽作為氮源時，可在培養(yǎng)基中加入CaCO³，用于中和NH⁴+被吸收后剩余的酸，但在操作中應(yīng)注意控制染菌危險。

（5）發(fā)酵過程pH值的自動控制。檸檬酸深層發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌黑曲霉比生長速率和產(chǎn)物檸檬酸合成比生產(chǎn)速率分別有各自的最適宜pH值范圍。因此，應(yīng)分階段控制生長最適pH值和產(chǎn)物最適pH值?？砂褭z測的pH值結(jié)果輸送到pH值控制器以指令加糖、加酸或加堿，實現(xiàn)自動控制，使發(fā)酵液的ｐＨ值控制在預(yù)定的數(shù)值。

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