李真順，姜 源

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

乳酸鏈球菌最適抑菌培養(yǎng)條件的研究

李真順，姜 源

(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

為降低天然防腐劑乳酸鏈球菌素(Nisin)的生產(chǎn)成本，以金黃色葡萄球菌為試驗菌，探討了直接利用乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)培養(yǎng)液進行抑菌的最適培養(yǎng)條件。首先通過單因素試驗，初步確定了最適碳源、氮源、金屬離子及其濃度或配比的范圍，然后采用正交試驗L9(33)優(yōu)化后得到的乳酸鏈球菌抑菌的最佳發(fā)酵條件為：3.0 g/100 g葡萄糖，4 g/100 g蛋白胨，2 g/100 g酵母膏，1 g/100 g牛肉膏，0.005 mol/L MgSO4。優(yōu)化后的培養(yǎng)基抑菌能力明顯提高，此結果可為乳酸鏈球菌素的生產(chǎn)提供參考。

乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)；抑菌條件；營養(yǎng)要求

乳酸鏈球菌素(Nisin)能夠抑制大部分革蘭陽性菌及其芽孢的生長與繁殖， 特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯，是世界上公認的安全防腐劑。同化學防腐劑相比，乳酸鏈球菌素作為一種純天然生物防腐劑具有許多優(yōu)點，它安全無毒、抑菌菌譜范圍廣。雖然從開發(fā)到使用已有50年的歷史[1]，但是仍未廣泛使用。制約Nisin應用的主要因素有2個，一是生產(chǎn)成本太高,二是純品提取困難。目前Nisin發(fā)酵所用的培養(yǎng)基有機氮含量都比較高,這一方面增加了生產(chǎn)成本,另一方面由于培養(yǎng)基中含有較高濃度的多肽,影響了Nisin的分離提純[2]。

乳酸鏈球菌(Lactococcuslactis)為一種安全無毒的微生物，它可產(chǎn)生Nisin，因此可直接利用其培養(yǎng)液進行抑菌而免去提純的工藝，在食品工業(yè)上可直接作為發(fā)酵菌株進行生產(chǎn)。本研究以抑菌特性作為指標，探討了獲取其對金黃色葡萄球菌最佳抑菌特性的培養(yǎng)條件，以期為直接利用乳酸鏈球菌作為防腐發(fā)酵菌株應用到發(fā)酵食品中提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：凍干的乳酸鏈球菌10193來源于中國菌種保藏中心；脫脂乳粉為市場上購得的完達山牌脫脂乳粉；金黃色葡萄球菌長江大學生命科學學院微生物實驗室分離保存。

試劑：蔗糖、葡萄糖、乳糖、Na2HPO4·12H2O、NaCl、MgSO4、KH2PO4、NaOH、無菌水均為分析純；可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂、吐溫 80均為食用級原料。

1.2 試驗方法

(1)培養(yǎng)基制作 試驗所用培養(yǎng)基配方分別如下：

CM1培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO410 g/L、NaCl 2 g/L、MgSO40.2 g/L，pH 6.8。

檢測培養(yǎng)基：蛋白胨8 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、Na2HPO4·12H2O 2 g/L、吐溫80 10 mL，pH值6.8。

活化培養(yǎng)基(乳酸鏈球菌10193) ：脫脂乳12 g/100 g、葡萄0.5 g/100 g、酵母膏0.5 g/100 g。

活化培養(yǎng)基(金黃色葡萄球菌)：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[3]。

(2)發(fā)酵液預處理 用移液管移取1%乳酸鏈球菌10193于100 mL CM1培養(yǎng)基中,30 ℃ 150 r/min搖床下培養(yǎng)24 h左右。培養(yǎng)完畢后以體積百分數(shù)為10%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，定時取樣,檢測樣液D620 nm值及pH。

將培養(yǎng)一定時間的乳酸鏈球菌10193發(fā)酵液，5 400 r/min離心12 min，除去沉淀，收集上清液，并以濾紙片法[4]測乳酸鏈球菌10193的抑菌圈平均直徑。

(3)抑菌試驗方法 采用濾紙片法。抑菌培養(yǎng)條件為30 ℃ 24 h。

(4)乳酸鏈球菌10193培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗 以檢測培養(yǎng)基為基礎，以碳源、氮源、金屬離子、培養(yǎng)溫度為考察對象，10%的接種量進行單因素試驗，發(fā)酵24 h后，測定其抑菌圈直徑和光密度D620 nm，從而確定各因素最佳條件，具體如下：①碳源種類對試驗菌株生長量的影響試驗。以蔗糖、可溶性淀粉、乳糖分別代替檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量分別為1.5 g/100 g。②氮源種類對試驗菌株生長量的影響試驗。按3.0 g/100 g的比例分別在檢測培養(yǎng)基中加入蛋白胨、混合氮源(酵母膏∶蛋白胨∶牛肉膏=1∶1∶1)、酵母膏、牛肉膏、檸檬酸三氨等5種氮源。③溫度對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響試驗。培養(yǎng)溫度設為25 、30、32、35、37 ℃。④金屬離子種類對試驗菌株生長量的影響試驗。檢測培養(yǎng)基中分別添加0.001 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+。

(5)正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以抑菌圈直徑為主要指標，選擇碳源、氮源和金屬離子為影響因素，確定各正交因子的水平，設計正交試驗L9(33)，確定出最佳提取條件。其優(yōu)化培養(yǎng)的工藝參數(shù)如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 溫度對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖1 溫度對菌株抑菌效果和生長量的影響Figure 1 Influence of temperature on bacteriostatic effects and growth

不同溫度對金黃色葡萄球菌抑菌效果的影響見圖1。由圖1可以看出，當溫度為30 ℃時，抑菌效果較好，并且菌數(shù)也最多。隨著溫度的升高，乳酸鏈球菌菌數(shù)逐漸降低，抑菌圈直徑也平穩(wěn)降低，這說明30 ℃為乳酸鏈球菌10193的最適生長溫度，而且菌數(shù)越多，抑菌效果越好。

2.2 碳源對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

以不同碳源代替檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖，確定不同種類碳源對乳酸鏈球菌的生長及抑菌特性的影響，結果見圖2。由圖2可知，以葡萄糖作為碳源時乳酸鏈球菌10193生長量最大，而以蔗糖作為碳源時，其Nisin抑菌效果最好，而可溶性淀粉作為碳源時乳酸鏈球菌10193的生長量和抑菌效果均差。因此選擇葡萄糖為最佳碳源。

圖2 碳源對試驗菌株抑菌效果和生長量的影響Figure2 Influenceofcarbonsourceonbacteriostaticeffectsandgrowth圖3 氮源對菌株抑菌效果和生長量的影響Figure3 Influenceofnitrogensourceonbacteriostaticeffectsandgrowth

圖4 金屬離子對菌株抑菌效果和生長量的影響Figure 4 Influence of metal ions on bacteriostatic effects and growth

2.3氮源對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

不同氮源對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響結果見圖3。由圖3可以看出，以混合氮源作為氮源時細胞生長量和抑菌效果最好，牛肉膏則相對影響最小，而當檸檬酸三銨作為氮源時乳酸鏈球菌10193幾乎不生長。5種氮源抑菌效果的次序為：混合氮源gt;酵母膏gt;蛋白胨gt;牛肉膏gt;檸檬酸三銨。綜合考慮，選擇混合氮源作為乳酸鏈球菌10193細胞生長和抑菌的最佳氮源。

2.4 金屬離子對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

金屬離子對菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響結果見圖4。由圖4可見，6種金屬離子產(chǎn)Nisin的抑菌效果的次序為：Mg2+gt;Zn2+gt;K+gt;Ba2+gt;Ca2+gt; Cu2+，而細胞生長量在不同金屬離子之間的變化趨勢與抑菌效果趨勢大致相同。而以Mg2+作為金屬離子加入培養(yǎng)基時，較之其它金屬離子相比，其菌株生長量也達到最大，綜合考慮，確定Mg2+為最適金屬離子。

2.5 正交試驗結果

采用正交試驗L9(33)對不同碳源、氮源和金屬離子濃度下產(chǎn)Nisin最佳條件進行優(yōu)化，試驗結果見表2。由表2可知，3個因素的極差大小順序為：硫酸鎂濃度gt;混合氮源濃度配比gt;葡萄糖濃度，可見金屬離子濃度是影響Nisin產(chǎn)生和產(chǎn)量的主要因子，其次是混合氮源濃度和葡萄糖濃度。最優(yōu)的營養(yǎng)條件組合為A2B2C3。

3 小結

通過單因素試驗，確定了最適碳源、氮源、金屬離子及其濃度或配比，分別為2.5 g/100 g葡萄糖，1 g/100 g蛋白胨+1 g/100 g酵母膏+1 g/100 g牛肉膏、0.003 mol/LMg2+。采用正交試驗優(yōu)化后得到的乳酸鏈球菌10193抑菌性最佳的營養(yǎng)條件為：3.0 g/100 g葡萄糖、4 g/100 g蛋白胨、2 g/100 g酵母膏、1 g/100 g牛肉膏、0.005 mol/L MgSO4。

在試驗過程中還進行了酸度的測定，結果表明，產(chǎn)酸能力越強抑菌效果越好，乳酸鏈球菌10193產(chǎn)酸能力對抑菌效果有直接影響。

本研究可為應用乳酸鏈球菌10193進行工業(yè)化生產(chǎn)Nisin提供必要的參數(shù)指標，為今后進行微生物型食品防腐劑的研究提供基礎。

[1]繆存影.天然食品防腐劑—乳酸鏈球菌素[J].中國食物與營養(yǎng)，2008，(4):30～32.

[2]焦中高，陳海昌，劉 茵.營養(yǎng)因素對乳酸乳球菌DL-203生長及其Nisin生物合成的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2003，(11): 22～24.

[3]歐陽諒. 微生物學實驗法[M].南昌：江西人民出版社，1980.14

[4]趙 斌,何紹紅.微生物學實驗[M].北京：科學出版社,2004.38～40.

2009-08-31

李真順(1978-)，女，湖北荊州人，工學碩士，講師，主要從事畜產(chǎn)品加工研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.019

TQ920.1

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1673-1409(2009)04-S065-03