李雪盛 孫建軍 姜偉 劉肖

近年來(lái)，隨著原位組織工程技術(shù)研究的深入，應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行異位成骨的研究進(jìn)展很快[1]，其基本方法為應(yīng)用三維立體的生物支架材料，復(fù)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)植入體內(nèi)骨缺損部位，原位誘導(dǎo)新骨形成。有研究[2]表明，緩釋BMP-2可在中耳空腔內(nèi)誘導(dǎo)形成新生骨組織，有可能用于聽(tīng)骨缺損的修復(fù)重建。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察緩釋BMP-2植入中耳腔后的成骨誘導(dǎo)情況及對(duì)內(nèi)耳聽(tīng)功能的影響，為這種材料應(yīng)用于聽(tīng)骨缺損重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1脫細(xì)胞松質(zhì)骨的制備與觀察 取新鮮成年豬(性別不限)椎體部松質(zhì)骨塊，切成5 mm×2 mm×2 mm柱狀，蒸餾水浸泡24 h，15%過(guò)氧化氫溶液浸泡48 h，70%乙醚脫脂24 h，蒸餾水浸泡24～48 h，冷凍干燥后環(huán)境掃描電鏡(Quanta 200 FEG，F(xiàn)EI，荷蘭)觀察其超微結(jié)構(gòu)。另取脫細(xì)胞骨以10%乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，切片后HE染色，顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.2BMP-2復(fù)合 BMP-2(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為粉末狀結(jié)晶，不溶于水，攪拌后呈混懸狀，將此混懸液滴入脫細(xì)胞松質(zhì)骨后(每塊約含BMP 0.5 mg，為該院提供的經(jīng)驗(yàn)劑量)迅速滲入骨孔內(nèi)，-20℃過(guò)夜后低溫冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒后備用。

1.3手術(shù)植入 20只(40耳)健康成年白色豚鼠(雌雄不拘，北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠提供)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，左耳作為實(shí)驗(yàn)組(20耳)，右耳作為對(duì)照組(20耳)。氯胺酮及速眠新Ⅱ等比混合液肌肉注射(0.5 ml/kg)麻醉，麻醉成功后取左耳后切口，分離找到聽(tīng)泡后外側(cè)氣房，仔細(xì)清理表面軟組織，尖針穿刺進(jìn)入聽(tīng)泡，擴(kuò)大骨孔，植入含緩釋BMP-2的脫細(xì)胞松質(zhì)骨，植入體形狀根據(jù)聽(tīng)泡大小及手術(shù)需要進(jìn)行修剪，以含抗生素(0.5%紅霉素軟膏)的明膠海綿固定。右耳植入不含BMP-2的脫細(xì)胞松質(zhì)骨作為對(duì)照，骨孔以小塊肌肉組織封閉。縫合切口，術(shù)后3日內(nèi)每日肌注青霉素2萬(wàn)單位預(yù)防感染。

1.4ABR測(cè)試 術(shù)前及術(shù)后即刻、術(shù)后3個(gè)月所有動(dòng)物行ABR檢查(TDT-3，USA)。于隔聲屏蔽室完成測(cè)試，動(dòng)物常規(guī)麻醉后，記錄電極置顱頂正中，參考電極置受試耳耳后皮下，接地電極置鼻尖。刺激聲為寬頻帶短聲(click)，脈沖寬度為0.1 ms，掃描時(shí)程10 ms，疊加1 024次。以波Ⅲ消失時(shí)的聲刺激強(qiáng)度作為該耳的ABR反應(yīng)閾值。

1.5大體觀察及病理學(xué)檢查 術(shù)后觀察動(dòng)物行為特點(diǎn)及對(duì)聲反應(yīng)，術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，取出聽(tīng)泡觀察植入物形態(tài)變化及黏膜覆蓋情況后，中性福爾馬林固定1周，10%乙二胺四乙酸脫鈣，每3天換液1次，2周后每天換液1次，以尖針刺入確定脫鈣效果滿意后，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.6耳蝸毛細(xì)胞硝酸銀染色觀察 術(shù)后3個(gè)月，于ABR閾值測(cè)試后將動(dòng)物處死，取出耳蝸，打開(kāi)蝸尖、前庭窗和蝸窗，以臨時(shí)配制的0.5%硝酸銀溶液自蝸尖行耳蝸灌注染色3次，蒸餾水沖洗，10%福爾馬林灌注固定4次，蒸餾水洗后于日光下曝曬約2小時(shí)至蝸殼呈黃褐色為止，最后再置10%福爾馬林中還原固定。在體視顯微鏡下分離出耳蝸基底膜，制作鋪片，甘油封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察毛細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1支架材料制備情況 新鮮松質(zhì)骨呈紅色，經(jīng)脫細(xì)胞脫脂處理后，顏色純白，親水性好，呈海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，大體形態(tài)無(wú)明顯變化，人工擠壓粗測(cè)仍可保持一定的機(jī)械強(qiáng)度，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。環(huán)境掃描電鏡觀察，可見(jiàn)互相連通的孔隙，表面附有少量殘余軟組織，孔徑大小不一，多在200～600 μm左右(圖1)。HE染色光鏡下觀察，見(jiàn)松質(zhì)骨形成均勻網(wǎng)狀孔隙，骨小梁清晰完整，膠原纖維排列有序，無(wú)細(xì)胞成分，骨陷窩空虛(圖2)。凍干處理后的材料表面觀察無(wú)明顯變化。

2.2術(shù)后觀察動(dòng)物狀況 全部手術(shù)動(dòng)物于麻醉后約1.5 h蘇醒，無(wú)行走不穩(wěn)、原地打轉(zhuǎn)等不良反應(yīng)，對(duì)聲反應(yīng)良好。術(shù)后2周，手術(shù)切口愈合良好，耳內(nèi)鏡觀察鼓膜完整，無(wú)充血及穿孔。

2.3ABR測(cè)試結(jié)果 術(shù)后即刻ABR反應(yīng)閾升高，術(shù)后3個(gè)月基本恢復(fù)正常，各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)耳及對(duì)照耳植入前后ABR閾值比較

注：*與同組植入前及植入后3個(gè)月比較，P<0.05

2.4大體觀察及光學(xué)顯微鏡下觀察 術(shù)后3個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組聽(tīng)泡內(nèi)無(wú)滲液及膿性分泌物，植入的緩釋BMP-2小柱被再生黏膜完整包裹，無(wú)血管增生，無(wú)肉芽及瘢痕組織形成。光鏡下檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組聽(tīng)泡及耳蝸大體形態(tài)良好，無(wú)異常骨質(zhì)增生(圖3)，鐙骨底板關(guān)節(jié)無(wú)骨質(zhì)增生或固定(圖4)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)組植入的含緩釋BMP-2的脫細(xì)胞松質(zhì)骨孔隙中，有新生骨組織形成(圖5)，對(duì)照組植入的脫細(xì)胞松質(zhì)骨孔隙中無(wú)新生骨形成，孔隙內(nèi)被纖維結(jié)締組織充填(圖6)。

2.5耳蝸鋪片硝酸銀染色觀察 植入3個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)組耳蝸基底膜及各回結(jié)構(gòu)均完整，界限清楚，內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛排列整齊無(wú)缺失，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(圖7、8)。

圖1豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨材料環(huán)鏡掃描電鏡觀察可見(jiàn)互相連通的孔隙，表面附有少量殘余軟組織，孔徑大小不一，多在200～600 μm左右(環(huán)鏡掃描電鏡 ×100)

圖2豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨光鏡下觀察松質(zhì)骨形成均勻網(wǎng)狀孔隙，骨小梁清晰完整，膠原纖維排列有序，無(wú)細(xì)胞成分，骨陷窩空虛(HE染色 ×100)

圖3耳蝸形態(tài)正常，骨壁無(wú)異常骨質(zhì)增生(×100)

圖4鐙骨底板關(guān)節(jié)無(wú)異常骨質(zhì)增生或固定(×200)

圖5復(fù)合BMP-2豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨植入術(shù)后3個(gè)月光鏡觀察(HE染色 ×200)A：脫細(xì)胞松質(zhì)骨支架；B：新生骨

圖6單純豬脫細(xì)胞松質(zhì)骨植入術(shù)后3個(gè)月光鏡觀察(HE染色 ×200)A：脫細(xì)胞松質(zhì)骨支架；B：纖維結(jié)締組織

圖7植入3個(gè)月后實(shí)驗(yàn)耳的耳蝸基底膜各回結(jié)構(gòu)均完整，界線清楚，內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛排列整齊無(wú)缺失。IHC：內(nèi)毛細(xì)胞；OHC：外毛細(xì)胞(×200)

圖8對(duì)照組耳蝸基底膜

3 討論

BMP是一種廣泛存在于骨基質(zhì)中的低分子糖蛋白多肽，具有誘導(dǎo)骨形成的生物學(xué)特性，可以作用于間充質(zhì)細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)血管周圍的未分化間充質(zhì)細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為軟骨和骨細(xì)胞，其中BMP-2 的成骨能力最強(qiáng)，也是最常用的成骨活性因子，其高效誘導(dǎo)成骨活性已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)[4]。在骨組織形成過(guò)程中，BMP-2 可使未分化的間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞并具有形成骨組織的能力，形成的新骨細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，為骨組織周圍的血管再生提供有利條件[5]。

由于BMP-2在體內(nèi)很快會(huì)彌散或降解消失，因此在誘導(dǎo)成骨過(guò)程中，需要選擇合適的載體，使其緩慢釋放。脫細(xì)胞松質(zhì)骨是一種常用的成骨基質(zhì)材料，研究表明，經(jīng)脫細(xì)胞脫脂處理后，其免疫活性很低，但同時(shí)可保持良好的機(jī)械特性[6～8]。本實(shí)驗(yàn)中所用BMP為人反轉(zhuǎn)錄BMP-2，不溶于水，局部分解緩慢，完全降解時(shí)間約在1月以上，加入脫細(xì)胞松質(zhì)骨互相連通的微小孔隙內(nèi)，可進(jìn)一步延遲BMP-2的釋放。

BMP-2是否會(huì)影響聽(tīng)覺(jué)功能，是決定其能否應(yīng)用于聽(tīng)骨缺損修復(fù)的關(guān)鍵。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)組中耳腔植入緩釋BMP-2后，聽(tīng)泡內(nèi)無(wú)異常骨質(zhì)增生，耳蝸形態(tài)正常，內(nèi)、外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞均著色良好, 各組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn), 毛細(xì)胞排列整齊規(guī)律；兩組耳蝸毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯聽(tīng)毛倒伏、融合、變性和缺失等形態(tài)改變；植入術(shù)后即刻，兩組的ABR反應(yīng)閾明顯升高，但實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明聽(tīng)力下降可能與植入手術(shù)操作有關(guān)。術(shù)后三個(gè)月，兩組的ABR反應(yīng)閾與術(shù)前無(wú)明顯差異，說(shuō)明聽(tīng)泡內(nèi)植入緩釋BMP-2對(duì)動(dòng)物聽(tīng)功能無(wú)明顯影響。因此，中耳內(nèi)植入含緩釋BMP-2聽(tīng)骨贗復(fù)物對(duì)中耳及內(nèi)耳功能無(wú)明顯影響。

傳統(tǒng)的聽(tīng)骨鏈重建手術(shù)所用的聽(tīng)骨假體材料種類繁多，包括異種材料、異體材料、自體材料等。由于聽(tīng)骨贗復(fù)物將被永久植入人體，理想的聽(tīng)骨贗復(fù)物應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①在人體內(nèi)無(wú)毒；②有非常好的組織相容性及化學(xué)穩(wěn)定性，能與周圍骨質(zhì)緊密相連；③易于塑形，操作簡(jiǎn)單；④在植入局部長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，具有良好傳音性，并且不脫出，不被吸收，且無(wú)其它不良反應(yīng)發(fā)生。目前尚缺乏完全滿足以上特點(diǎn)的聽(tīng)骨贗復(fù)材料，因此，有必要尋找新的更好的材料與方法[9]。應(yīng)用緩釋BMP-2異位誘導(dǎo)成骨方法進(jìn)行聽(tīng)骨重建，由于釋放的BMP-2容易被降解破壞或彌散吸收，因此只在緩釋材料局部才有新生骨組織形成，且是形成自身活骨組織修復(fù)缺損，理論上可避免免疫反應(yīng)、吸收、脫出等目前所用各種吸骨贗復(fù)物的缺點(diǎn)，具有一定的優(yōu)越性，是一種值得研究的方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，緩釋BMP-2可于中耳腔內(nèi)有效誘導(dǎo)新生骨形成，并在此劑量下對(duì)內(nèi)耳功能不產(chǎn)生明顯影響，有可能用于聽(tīng)骨缺損修復(fù)重建，但尚需進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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