崔傳玨,魏英杰,張秀芳,史強,胡盛壽

乳鼠心肌細(xì)胞中 C反應(yīng)蛋白對基質(zhì)金屬蛋白酶-10表達(dá)調(diào)控的研究＊

崔傳玨,魏英杰,張秀芳,史強,胡盛壽＊

目的：研究在乳鼠心肌細(xì)胞中C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-10(MMP-10)表達(dá)的作用及其分子機(jī)制。

方法：培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,以炎性因子C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)MMP-10的表達(dá)。分別應(yīng)用酶譜法和實時定量反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)檢測培養(yǎng)上清中MMP-10的活性和細(xì)胞中MMP-10信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平的變化,應(yīng)用蛋白免疫印跡雜交技術(shù)觀察胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路以及轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的蛋白水平的變化。實驗分為 4組：對照組,C反應(yīng)蛋白組,C反應(yīng)蛋白+抑制劑組和抑制劑組。

結(jié)果：心肌細(xì)胞給予C反應(yīng)蛋白(5μg/ml)刺激后 24 h,細(xì)胞培養(yǎng)上清中 MMP-10活性較對照組升高了 9.23倍(P＜0.01);細(xì)胞 MMP-10mRNA水平與 0h相比,6h增加了 0.83倍(P＜0.05),12h達(dá)最高,增加了 2.67倍(P＜0.05),24 h略有下降,增加了 1.92倍(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。C反應(yīng)蛋白可激活心肌細(xì)胞 p-ERK1和 p-ERK 2,從15min開始,可持續(xù)到240m in;C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞 4h,活化蛋白-1的蛋白水平與 0h相比,增加了 3.66倍(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;ERK抑制劑 PD 98059預(yù)處理心肌細(xì)胞,可阻斷C反應(yīng)蛋白引起的活化蛋白-1的蛋白水平的上調(diào)作用以及MMP-10活性的增加及 MMP-10mRNA的表達(dá)。

結(jié)論：C反應(yīng)蛋白通過ERK通路,上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的蛋白水平,從而對心肌細(xì)胞中MMP-10基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

C反應(yīng)蛋白;心肌細(xì)胞;基質(zhì)金屬蛋白酶-10;胞外調(diào)節(jié)激酶通路;活化蛋白-1

Objective：To investigate the effect of C-reactive protein(CRP)onmatrixmetalloproteinase-10(MMP-10)expression with the underlyingmechanism.

Methods：The experiments were divided into 4 groups,Control group：the neonatal rat cardiomyocytes were regularly cultured;CRP group：5μg/ml of CRP was added into the cell culture medium;CRP p lus inhibitor group：CRP and 50μM of PD 98059 were added into cell the culturemedium;and Inhibitor group：PD 98059was added.ThemRNA expression of MMP-10 was analyzed by real-time RT-PCR.The protein levels of MMP-10,extracellu lar regulated protein kinases(ERK)and activated p rotein-1 weremeasured with Western blotand zymographic assay respectively.

Resu lts：By 24 hours of treatment,compared with Control group,the activity ofMMP-10 increased 9.23 times in CRP group(P＜0.01)in the conditioned medium;while by 6h,12h,and 24h of cu lture,the mRNA level of MMP-10 increased 0.83 times,2.67 times,and 1.92 times in CRP group(P＜0.05 respectively).CRP could activate the ERK 1 and ERK 2 signaling pathway started from 15m in of culture,and this effect lasted for 240min.By 4h of treatment,the protein level ofactivated protein-1 increased 3.66 times in CRP group(P＜0.01).The ERK inhibitor,PD98059,could block the increased mRNA expression and enzyme activity of MMP-10,inhibit the increased protein levelof activated protein-1 which were induced by CRP.

Conclusion：CRP cou ld regulate themRNA exp ression ofMMP-10,thatwasmediated by ERK signaling pathway and activated protein-1.Key words C-reactive protein;Cardiomyocyte;Matrix metalloproteinase-10;Extracellu lar signal-regulated kinase signaling pathway;Activated p rotein-1

(Chinese Circulation Journal,2010,25：476.)

心力衰竭是由多種病因引起的一種復(fù)雜的病理生理狀態(tài),這種異常的心功能狀態(tài)使心臟不能泵出足夠的血液以滿足組織代謝的需要,是心臟對負(fù)荷和刺激產(chǎn)生連續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)的一種動態(tài)過程,從而引起心肌細(xì)胞在分子水平和細(xì)胞水平上的改變。研究顯示[1],心肌的細(xì)胞外基質(zhì)在心臟重塑的過程中起著重要的作用。在正?；铙w組織,細(xì)胞外基質(zhì)處于生成和降解的動態(tài)平衡中?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloptotease,MMPs)是體內(nèi)參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的最主要酶系,是心肌重塑的重要因素之一。MMPs是一類依賴于鋅離子降解細(xì)胞外基質(zhì)的內(nèi)源性蛋白水解酶家族,目前已發(fā)現(xiàn)有 28種,根據(jù)其結(jié)構(gòu)與不同特異性的底物結(jié)合可以分成四大類,其中 MMP-10屬于基質(zhì)溶解素類。本實驗室的研究結(jié)果顯示,在不同心肌病引起心力衰竭的心肌組織中 MMP-10高表達(dá),它在心力衰竭后心室重構(gòu)的分子機(jī)制中可能發(fā)揮作用[2,3]。本研究是在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步闡明心肌細(xì)胞中MMP-10表達(dá)調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子機(jī)制。

1 材料與方法

實驗材料：實驗時間為 2009-01至 2009-10。1～3天 Sp rague-Daw ley(SD)大鼠 (SPF級)購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心[合格證號 SCXK(京)2006-2008]。5-溴脫氧尿苷、C反應(yīng)蛋白、抗活化蛋白-1抗體、胞外調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制劑 PD98059、胰酶購自美國 Sigma公司;抗 ERK 1和2抗體、抗磷酸化胞外調(diào)節(jié)激酶 1和 2(p-ERK1/2)抗體購自美國 cell signaling technology公司;抗 3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自英國 Abcam公司;反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國 promega公司;SYBR Green實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自美國 ABI公司;Trizol試劑、4%～12%預(yù)制膠和 4%～16%酶譜預(yù)制膠購自美國Invitrogen公司;2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二甲酸二鈉法蛋白濃度測定試劑盒購自北京普利萊生物公司。

原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)：1～3天 SD大鼠,雌雄不拘,麻醉處死后,無菌開胸取其心臟,放入漢克氏液洗滌 3次,用眼科剪剪成 1mm×1mm×1 mm的組織塊,用 0.08%的胰蛋白酶在 37℃水浴中重復(fù)消化至心肌組織塊完全消化,每次 8min,第 1次的消化上清棄去,從第 2次開始收集消化上清于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,1 000 r/min離心 10 min,棄上清,用含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,200目鋼網(wǎng)過濾后,在 5%二氧化碳,37℃培養(yǎng)箱中孵育 1 h差速培養(yǎng),取未貼壁的心肌細(xì)胞,以 1×105個細(xì)胞/ml的密度接種 T25培養(yǎng)瓶,用含 0.1mmol/L 5-溴脫氧尿苷的 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) 48 h,以抑制非心肌細(xì)胞增殖。再更換為不含 5-溴脫氧尿苷的10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至 72 h。

細(xì)胞處理：細(xì)胞培養(yǎng) 72 h后,更換無血清 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h,之后隨機(jī)分組,①對照組：以無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞;②C反應(yīng)蛋白組：加入 5μg/ml C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞;③C反應(yīng)蛋白 +抑制劑組：在 C反應(yīng)蛋白處理前 30min加入 ERK抑制劑 PD98059 50 μM進(jìn)行預(yù)處理,再加入5μg/ml C反應(yīng)蛋白;④抑制劑組：單純加入 ERK抑制劑 PD98059 50μM。

酶譜法測定 MMP-10的活性：用以酪蛋白為底物的 4%～16%酶譜預(yù)制膠進(jìn)行電泳,分別取等量的各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清,與等體積上樣緩沖液混勻后上樣,125V電泳 90min至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底,停止電泳,卸膠后,將膠浸泡在洗脫液中 30min,之后將膠移至孵育液中,室溫平衡 30m in后,更換新的孵育液,37℃孵育 72 h,可見藍(lán)色背景的膠上出現(xiàn)無色清晰的酶譜條帶,掃描后分析,實驗重復(fù) 3次。

逆轉(zhuǎn)錄—實時定量互補脫氧核糖核酸(cRNA)：按照 Trizol試劑說明書方法提取細(xì)胞總核糖核酸(RNA),按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第一條 cRNA,再以等量cRNA為模板,進(jìn)行實時定量聚合酶鏈反應(yīng),以GAPDH作為內(nèi)對照。引物由大連寶生物工程有限公司合成,引物序列分別為：MMP-10 5′-TTCCTTCAGGCTTAGATGCTGCCT-3′(上游),5′-TCCTCTTTGGGTAACCTGCTTGGA-3′(下 游 );GAPDH 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′(上 游 ),5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′(下游),使用 Applied Biosystems 7300實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀,實驗重復(fù) 3次。

蛋白免疫印跡雜交技術(shù)分析：分別收集各處理組細(xì)胞,裂解液裂解,離心收取裂解液上清,用 2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二甲酸二鈉法測定蛋白濃度,以 40μg蛋白量與上樣緩沖液混勻沸水中煮 5min,用 4%～12%的預(yù)制膠進(jìn)行電泳分離,電泳完畢用電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用封閉液(5%脫脂牛奶)室溫封閉 1 h,加入待測目的蛋白的特異性抗體孵育雜交,最后用化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果,以 GAPDH為內(nèi)對照,ERK的磷酸化產(chǎn)物用 p-ERK表示,實驗重復(fù) 3次。

2 結(jié)果

C反應(yīng)蛋白對細(xì)胞培養(yǎng)上清 MMP-10活性影響：本實驗使用不同濃度的 C反應(yīng)蛋白刺激心肌細(xì)胞 24 h,都具有增加 MMP-10活性的作用。其中 C反應(yīng)蛋白濃度為 5μg/m l時的作用最強,細(xì)胞培養(yǎng)上清中 MMP-10的比活為(27 076.34±138.78)m l/mg,是對照組(10 897.51±136.56)ml/mg的 2.48倍(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 1A)。以 5μg/m l C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞不同時間,細(xì)胞培養(yǎng)上清中 MMP-10活性在 6 h開始增加,比活為(12 874.02±1 172.62)m l/mg,24 h后比活為 (26 723.05±1 915.58)ml/mg,是對照組(2 884.78±696.91)m l/mg的 9.23倍(圖 1B)。實驗重復(fù) 3次。

圖 1 C反應(yīng)蛋白對不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清的基質(zhì)金屬蛋白酶-10的活性影響 A為不同濃度C反應(yīng)蛋白刺激心肌細(xì)胞24 h,MMP-10活性的變化。a：對照組;b：C反應(yīng)蛋白5μg/m l;c：C反應(yīng)蛋白 15μg/m l;d：C反應(yīng)蛋白 30μg/ml;e：C反應(yīng)蛋白 50μg/m l。B為 5μg/ml C反應(yīng)蛋白在不同時間點刺激心肌細(xì)胞,MMP-10活性的變化。 a：對照組;b：6 h;c：12 h;d：24 h。n=3。kDa：蛋白質(zhì)分子量單位千道爾頓;MMP-10：基質(zhì)金屬蛋白酶-10

C反應(yīng)蛋白對細(xì)胞中 MMP-10的 mRNA水平影響：用 2-ΔΔCt值表示。以 5μg/ml C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞不同時間,6 h MMP-10mRNA(1.83±0.22)水平明顯增高,與 0 h(1.00±0.00)比,增加了 0.83倍 (P＜0.05),12 h達(dá)最高(3.67±1.11),增加了 2.67倍(P＜0.05),24 h后略微降低(2.90±0.73),增加了 1.92倍(P＜0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 2)。

C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo) p-ERK1/2的時間效應(yīng)：在無 C反應(yīng)蛋白刺激時(對照組),有極其微量的 p-ERK1/2表達(dá),以 5μg/m l的 C反應(yīng)蛋白刺激 15 min后,p-ERK 1/2開始激活,可持續(xù)增加到 240 min(圖 3)。實驗重復(fù) 3次。

圖 2 5μg/ml C反應(yīng)蛋白對心肌細(xì)胞刺激不同時間點,細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-10的信使核糖核酸表達(dá)變化 mRNA的相對表達(dá)變化量用 2-ΔΔCt值表示。與 0 h比較＊P均 ＜0.05,n=3。mRNA：信使核糖核酸

圖 3 5μg/m l C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)胞外調(diào)節(jié)激酶 1和胞外調(diào)節(jié)激酶 2磷酸化的時間效應(yīng) p-ERK 1：磷酸化的胞外調(diào)節(jié)激酶 1;p-ERK 2：磷酸化的胞外調(diào)節(jié)激酶 2;ERK 1：胞外調(diào)節(jié)激酶 1;ERK 2：胞外調(diào)節(jié)激酶 2;GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶。n=3

C反應(yīng)蛋白刺激轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的蛋白表達(dá)：以 5μg/ml C反應(yīng)蛋白刺激 4 h后(1.00±0.05),與 0 h(0.21±0.02)比,活化蛋白-1蛋白水平增加了3.66倍(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,可持續(xù)增加到24 h(圖 4)。實驗重復(fù) 3次。

圖 4 5μg/m l C反應(yīng)蛋白刺激心肌細(xì)胞后不同時間活化蛋白-1的蛋白表達(dá)變化 GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶。n=3

ERK抑制劑 PD98059對活化蛋白-1和 MMP-10的影響：以 50μM的 PD98059預(yù)處理心肌細(xì)胞 30 min后,再加入 5μg/ml C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞 15 m in,PD98059可以抑制 C反應(yīng)蛋白引起的 p-ERK1/2的活化(圖 5A);以 50μM的 PD98059預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min后,再加入 5μg/ml C反應(yīng)蛋白刺激細(xì)胞 24 h,PD98059可阻斷 C反應(yīng)蛋白對活化蛋白-1的蛋白水平的上調(diào)作用(圖 5B),C反應(yīng)蛋白引起的 MMP-10活性的增加(圖 5C)以及 MMP-10的 mRNA的表達(dá)(圖5D)。實驗重復(fù) 3次。

圖 5 胞外調(diào)節(jié)激酶抑制劑 PD98059對活化蛋白-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-10的影響 A：p-ERK 1和 p-ERK 2活化的影響;B：活化蛋白-1的蛋白表達(dá)的影響;C：對 MMP-10活性的影響;D：對 MMP-10mRNA的表達(dá)影響。 mRNA的相對表達(dá)變化量用 2-ΔΔCt值表示,與對照組比較＊P＜0.05;與C反應(yīng)蛋白組比較△P＜0.05,n=3。PD 98059：胞外調(diào)節(jié)激酶抑制劑;p-ERK 1：磷酸化的胞外調(diào)節(jié)激酶 1;p-ERK2：磷酸化的胞外調(diào)節(jié)激酶 2;GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶;MMP-10：基質(zhì)金屬蛋白酶-10;mRNA：信使核糖核酸

3 討論

心肌重塑是引起心力衰竭的機(jī)制,而心肌細(xì)胞外基質(zhì)的改變是心肌重塑的一個決定性因素。近年來,炎癥反應(yīng)在心力衰竭過程中所起的作用日益引起重視[4]。炎性因子 C反應(yīng)蛋白可使 MMPs的量增加,從而加重心肌重塑[5]。本研究室前期實驗的結(jié)果顯示,在心力衰竭患者的心肌 MMP-10的表達(dá)水平明顯升高,提示與心室重塑密切相關(guān)[3]。已有文獻(xiàn)報道,C反應(yīng)蛋白可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞 MMP-10表達(dá)[6],但 C反應(yīng)蛋白對心肌細(xì)胞 MMP-10表達(dá)的影響還不清楚,因此,本研究在心肌細(xì)胞中觀察 C反應(yīng)蛋白對 MMP-10的表達(dá)是否有誘導(dǎo)作用,進(jìn)而觀察其信號調(diào)控機(jī)制。

絲裂原活化蛋白激酶是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一,在哺乳動物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)四個亞家族。絲裂原活化蛋白激酶通路可參與 C反應(yīng)蛋白或凝血酶引起的內(nèi)皮細(xì)胞 MMP-10的表達(dá),且主要是通過絲裂原活化蛋白激酶通路中的 ERK通路和氨基端激酶通路[7]。而我們的實驗結(jié)果顯示,C反應(yīng)蛋白在心肌細(xì)胞中主要是通過激活 ERK通路來調(diào)控 MMP-10的表達(dá),表明絲裂原活化蛋白激酶通路是 MMP-10表達(dá)調(diào)控的主要信號通路之一。

基因轉(zhuǎn)錄增加的重要原因之一是轉(zhuǎn)錄因子蛋白增加?；罨鞍?1屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族,是很多生長因子和激酶信號通路的重要中介者[8],目前,已明確人的 MMP-10基因的啟動子序列上含有 4個活化蛋白-1結(jié)合元件[9]。因此,我們進(jìn)一步觀察 MMP-10 mRNA表達(dá)增加是否與轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的蛋白表達(dá)變化有關(guān)。結(jié)果顯示,C反應(yīng)蛋白刺激心肌細(xì)胞后,活化蛋白-1的蛋白表達(dá)趨勢與 MMP-10mRNA表達(dá)升高一致,用 PD98059阻斷 ERK通路后,也可抑制 C反應(yīng)蛋白引起的活化蛋白-1蛋白的增加,說明在原代乳鼠心肌細(xì)胞中,C反應(yīng)蛋白是通過上調(diào)活化蛋白-1蛋白來實現(xiàn)對 MMP-10基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。

本研究闡明,炎性因子 C反應(yīng)蛋白促進(jìn)心肌細(xì)胞MMP-10的活性增加,是通過活化心肌細(xì)胞內(nèi)的 ERK通路和上調(diào) MMP-10轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白-1的蛋白表達(dá),從基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) MMP-10mRNA得以實現(xiàn)。所以,深入研究信號通路對 MMP-10的表達(dá)調(diào)控,將有助于我們揭示 MMP-10的產(chǎn)生是如何參與心肌重塑的過程,為心力衰竭防治提供一個新的治療靶點。

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(編輯：漆利萍)

Effect of C-Reactive Protein on Matrix Metalloproteinase-10 Expression With the Under lying Mechanism in Cardiomyocyte of Neonatal Rats

CUIChuan-jue,WEI Ying-jie,ZHANG Xiu-fang,SHIQiang,HU Sheng-shou.
Key Laboratory of Cardiovascular Regenerative Medicine,Ministry of Health,Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital,CAMSand PUMC,Beijing(100037),China Corresponding Author：WEIYing-jie,Email：weiyingjie@yahoo.com

科技部“973”項目課題(2010CB 529506)

100037 北京市,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 心血管病研究所 阜外心血管病醫(yī)院 衛(wèi)生部心血管疾病再生醫(yī)學(xué)重點實驗室

崔傳玨 技師 學(xué)士 主要從事心臟病的分子生物學(xué)研究 Email：cuichuanjue@126.com通訊作者：魏英杰 Email：weiyingjie@yahoo.com

R541

A

1000-3614(2010)06-0476-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2010.06.020

2010-07-06)

?冠心病研究?