陜西理工學(xué)院 陳 琛

植酸酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，能將植酸分解為肌醇和無機(jī)磷的一類磷酸單脂水解酶。文章介紹了植酸酶活性的測定方法，除了以前的傳統(tǒng)方法外，近10多年植酸酶活性檢測出現(xiàn)了許多新的方法，如近紅外光譜法、瓊脂平板法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器法、高效液相色譜法等，這些新方法為植酸酶活性測定開辟了新的檢測途徑。

1 植酸酶活性測定方法的發(fā)展及意義

1.1 植酸酶活性測定方法的發(fā)展 植酸酶發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有100余年，植酸酶的研究已經(jīng)取得了豐碩的成果?；仡欀菜崦富钚缘臏y定方法：1925年Fiske-SubbaRow法，即鉬黃法，因由Fiske和SubbaRow兩人發(fā)現(xiàn)，所以早期鉬黃法也叫Fiske-SubbaRow法；1943年Holman等發(fā)現(xiàn)了硫酸亞鐵-鉬藍(lán)法，曾在國外許多國家發(fā)展為植酸酶測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，至今還在許多研究中采用（Fu等，2008；Huang等，2008）；1981 年 Heinonen 和 Lahti建立了丙酮-磷鉬酸銨法。植酸酶活性的測定方法除了這些傳統(tǒng)的方法外，近10多年來隨著科學(xué)技術(shù)和檢測手段的提高，植酸酶活性分析檢測及標(biāo)準(zhǔn)化方面出現(xiàn)了許多新的方法，并頒布了新的標(biāo)準(zhǔn)，如近紅外光譜法（NIR）、瓊脂平板法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、生物傳感器法、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）等。

1.2 植酸酶活性測定意義 植酸酶沒有特定光吸收波和鑒定試劑，所以植酸酶的分析和活性測定比較困難（Lasztity等，1990）。動(dòng)、植物植酸酶的提取、分離純化，微生物植酸酶菌株的篩選，基因工程植酸酶表達(dá)產(chǎn)物等研究中都需要測定植酸酶活性。隨著植酸酶在飼料中的廣泛應(yīng)用，飼料管理部門、飼料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、科研部門以及生產(chǎn)企業(yè)均面臨植酸酶定量測定的工作。目前存在著植酸酶酶活單位混亂、檢測手段落后，測定結(jié)果誤差大等一些問題，所以規(guī)范植酸酶酶活性定義和檢測方法勢在必行。

植酸酶活性的定義方法主要有以下幾種：（1）酶活定義為每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 μmol的無機(jī)磷為一個(gè)酶活單位。（2）酶活定義為每分鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol的無機(jī)磷為一個(gè)酶活單位。（3）酶活定義為每秒鐘從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 nmol的無機(jī)磷為一個(gè)酶活單位。（4）酶活定義為每小時(shí)從一定濃度的植酸鈉溶液中釋放1 mg的無機(jī)磷為一個(gè)酶活單位。這四種定義中第一種的酶活單位最大，國外采用此種單位較多，我們稱之為國際單位；第二種酶活單位是第一種的1000倍；第三種為第一種酶活單位的17倍；第四種與第一種酶活單位大小相近。

目前，植酸酶活性單位大多用FTU（fytase unit）表示。植酸酶樣品在植酸鈉濃度為5.0 mmol/L、溫度37℃、pH值5.50的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1 μmol無機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活性單位，以U表示。1994年該標(biāo)準(zhǔn)被AOAC（美國公定化學(xué)分析）在推薦方法中直接引用，作為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)使用。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18634-2002也采納同樣的定義。

2 植酸酶活性測定方法

2.1 分光光度測定法 分光光度法，也叫吸光光度法，是基于物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括可見分光光度法、紫外分光光度法及紅外光譜法等。

植酸酶酶活力測定的基本原理是利用酶水解植酸鈉（肌醇六磷酸十二鈉）形成無機(jī)磷，然后測定無機(jī)磷的釋放量。常用底物植酸鈉有兩種型號：一種是Sigma p-3168，目前用p-0109替代，相對分子質(zhì)量為923.8；另一種是Sigma p-8810，相對分子質(zhì)量為660.03。根據(jù)國標(biāo)要求，植酸鈉應(yīng)為Sigma p-3168。常用的方法有偏釩酸銨法、硫酸亞鐵-鉬藍(lán)法、VC-鉬藍(lán)法、丙酮-磷鉬酸銨法，其中前三種是基于可見分光光度法，丙酮-磷鉬酸銨法是基于近紫外法測定。

2.1.1 釩-鉬酸銨法 釩-鉬酸銨法，又稱鉬黃法、偏釩酸銨法。該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放出無機(jī)磷的原理。在酸性環(huán)境下，通過加入鉬-釩試劑與水解釋放出來的無機(jī)磷產(chǎn)生顏色反應(yīng)，形成黃色的釩鉬磷絡(luò)合物，在415 nm波長下比色測定磷的含量，以標(biāo)準(zhǔn)植酸酶為參照物，間接計(jì)算被測樣品中植酸酶的含量。Kim和Lei（2005）系統(tǒng)研究了該方法的影響因素，并對該方法進(jìn)行了優(yōu)化研究，增加了該方法的精確性和重復(fù)性。鉬黃法因其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，顏色穩(wěn)定，干擾物質(zhì)相對較少而成為測定低含量磷的經(jīng)典方法。本法于1994年列入AOAC，我國在參考AOAC方法的基礎(chǔ)上制定了 《飼用植酸酶活性的測定—分光光度法》（GB/T18634-2002，修訂GB/T18634-2009）。

2.1.2 硫酸亞鐵-鉬藍(lán)法 該方法利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機(jī)磷的原理，通過加入三鹽酸使水解反應(yīng)停止，然后加入鉬酸銨及FeSO4·7H2O的混合液使溶液顯色，在720 nm波長下測定其吸收值，以標(biāo)準(zhǔn)酶為參照物，間接計(jì)算被測樣品中植酸酶的含量，稱該方法為FeSO4-鉬藍(lán)法。

2.1.3 VC-鉬藍(lán)法 該方法的原理是在酸性條件下，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)，當(dāng)有還原劑存在時(shí)，磷鉬酸立即變成藍(lán)色的還原物質(zhì)——鉬藍(lán)，形成的藍(lán)色物質(zhì)最大吸收峰在650～660 nm，再以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對應(yīng)的酶活單位建立直線回歸方程，測定無機(jī)磷的含量，最后以待測樣品吸光度代入方程，計(jì)算出酶活性。

2.1.4 丙酮-磷鉬酸銨法 丙酮-磷鉬酸銨法，依據(jù)的原理是磷酸鹽與過量的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可緩慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后將黃色物質(zhì)抽提出來，在355 nm波長處測吸光度，靈敏度增加10倍。

評價(jià)一種測定方法重要的標(biāo)準(zhǔn)是精確度、靈敏度、穩(wěn)定性、抗干擾能力、便宜和方便。不同的測定方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)。釩-鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強(qiáng)，在測定飼料、發(fā)酵產(chǎn)物中植酸酶活性，采用丙酮-磷鉬酸銨方法較好。黃遵錫（1999）研究結(jié)果也表明：從靈敏度來說，釩-鉬酸銨法最高，VC-鉬藍(lán)法和FeSO4-鉬藍(lán)法次之，丙酮法最低，丙酮法的靈敏度與后兩者相比相差較大，近1倍。但是，丙酮法較其他3種方法穩(wěn)定性及抗干擾能力都較另外3種方法好。

2.1.5 近紅外光譜法 近紅外光譜是可見光與中紅外光譜之間的一段譜區(qū)，其波長范圍為750～2500 nm，近紅外光譜分析是指利用近紅外光譜區(qū)包含的物質(zhì)信息，主要用于有機(jī)物質(zhì)定性和定量分析的一種分析技術(shù)，具有對樣品無破壞性、操作簡便、分析迅速、測量信號可以遠(yuǎn)距離傳輸和分析等特點(diǎn)。Smith等（2001）利用近紅外光譜技術(shù)，建立了雞糞便中植酸磷的定量分析模型，對其進(jìn)行了快速定量分析。楊海鋒等（2008）通過廣譜分析建立了校正模型，認(rèn)為近紅外光譜技術(shù)快速檢測植酸酶酶活含量可行。Selle和Ravindran（2008）認(rèn)為對近紅外光譜在植酸酶活性分析中應(yīng)用非常有前景。

2.2 瓊脂平板法 Bae等（1999）建立并優(yōu)化了瓊脂平板法測定了微生物產(chǎn)植酸酶活性的方法，基于該方法，篩選了動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物中產(chǎn)植酸酶厭氧細(xì)菌。具體方法如下：分離細(xì)菌，在含有植酸鈉的培養(yǎng)基 （10%瘤胃液，0.25%葡萄糖，0.25%纖維二糖，0.3%淀粉，1.8%瓊脂，1.0%植酸鈉）上厭氧培養(yǎng)5 d后，移出培養(yǎng)皿置于需氧環(huán)境下，洗去培養(yǎng)基表面的細(xì)菌，培養(yǎng)皿中加入2%的氯化鈷溶液，室溫培養(yǎng)5 min，傾倒出氯化鈷溶液；培養(yǎng)皿中再加入6.25%的鉬酸銨-0.42%釩酸銨溶液，室溫培養(yǎng)5 min，可產(chǎn)植酸酶的微生物在菌落周圍可產(chǎn)生清晰的條帶。

2.3 基于高效液相色譜測定法 Berry等（2009，2007，2005）人工合成了一個(gè)新的發(fā)色底物植酸的類似物（TInsP5），以TInsP5作為探針，建立一種快速、高效的測定土壤中植酸酶酶活性的反相高效液相色譜（RP-HPLC）-紫外（UV）檢測方法。方法色譜柱為Sigma公司Supelcosil LC-18-T（150 mm×4.6 mm ID，3 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），比例由 19∶1 變化為11.5∶1，流速1.0 mL/min；檢測波長為 226 nm。TInsP5與待測樣品在45℃溫孵80 min，然后煮沸20 min終止反應(yīng)，離心用0.22 μm濾膜過濾，樣品與甲醇-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）等體積混合用于HPLC分析。該方法快速、穩(wěn)定、靈敏度高，適合體外植酸酶活性的評價(jià)研究。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法是以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶底物的高效催化產(chǎn)物作用相結(jié)合的一種敏感性很高的檢測技術(shù)。其具有特異性高、敏感性強(qiáng)、結(jié)果易于檢測等特點(diǎn)。Zahradnik等（2004）將酶聯(lián)免疫吸附法用于檢測了黑曲霉、大豆、小麥、大米、飼料等11種樣品中的植酸酶活性，檢測靈敏度均達(dá)到40 pg/mL，批間變異系數(shù)＜10%。

2.5 生物傳感器法 生物傳感器是在生命科學(xué)和信息科學(xué)之間發(fā)展起來的一門交叉學(xué)科，對生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行檢測的儀器。最早的生物傳感器發(fā)明于1962年，Clark和Lyon利用不同的物質(zhì)與不同的酶層發(fā)生反應(yīng)的工作原理，在傳統(tǒng)的離子選擇性電極上固定了具有生物功能選擇的酶，從而構(gòu)成了最早的生物傳感器——酶電極。生物傳感器是由固定化的生物敏感材料作識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)）與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等等）及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。生物傳感器具有接受器與轉(zhuǎn)換器的功能。Mak等（2004）把植酸酶生物傳感器固定于丙酮酸氧化酶上用于測定植酸酶活性，制備的植酸酶生物傳感器線性范圍0.5～6.0 U/mL，檢測限達(dá)到0.002 mmol。生物傳感器法具有線性范圍大、靈敏、操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合于植酸酶活性檢測.

3 總結(jié)及展望

綜上所述，目前植酸酶的測定方法有基于分光光度測定的鉬黃法、鉬藍(lán)法、近紅外光譜法，以及近年來新建立的瓊脂平板法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和生物傳感器法。分光光度測定法對設(shè)備要求相對較低，能在基層實(shí)驗(yàn)室和企業(yè)開展，目前發(fā)展的比較成熟，應(yīng)用廣泛；高效液相色譜法對設(shè)備要求相對較高，普通實(shí)驗(yàn)室不能開展；生物傳感器法靈敏度高，但是作為一項(xiàng)新技術(shù)新方法未能成為廣泛普及的常規(guī)分析方法；綜合各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，分光光度法中的鉬黃法是目前科研機(jī)構(gòu)、酶制劑企業(yè)等的常規(guī)分析方法。植酸酶在飼料工業(yè)、食品添加劑、醫(yī)藥工業(yè)等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的植酸酶測定底物的發(fā)現(xiàn)，新技術(shù)和新方法研究的深入，簡便、高靈敏度、低成本、穩(wěn)定性和重復(fù)率高的植酸酶活性測定方法可能被開發(fā)并應(yīng)用。

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