羅永華,丁兆忠

(河北滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北滄州061001)

隨著人類和很多動物的基因組測序完成,以基因組功能研究為主要目標(biāo)的后基因組時代的來臨,基因功能信息的獲取將成為基因研究的重點(diǎn)。基因差異表達(dá)分析是獲取基因功能信息的重要方法。高等生物大約有3～5萬個不同的基因,在每一個正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝,但在不同的組織細(xì)胞中僅有10%～20%的少部分基因被選擇性表達(dá),它將最終控制生物的形態(tài)和生理過程,是調(diào)控細(xì)胞生命活動過程的核心機(jī)制。了解不同細(xì)胞或同類細(xì)胞在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)狀況,可為研究生命活動過程提供重要信息,對調(diào)控生物的生長發(fā)育各階段及代謝途徑具有重大的理論和實(shí)踐意義。目前常用研究基因差異表達(dá)的方法有:mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR),抑制消減雜交(suppression substractive hybridization,SSH),基因表達(dá)系列分析技術(shù)(serial analysis of gene expression,SAGE)和基因芯片(gene chip)。本文對這幾種方法進(jìn)行了簡要的綜述和比較。

1 mRNA差異顯示技術(shù)

1992年Liang和Pardee建立了mRNA差異顯示技術(shù)[1]。根據(jù)成熟的mRNA 3′端具有poly(A)尾巴這一特性,以一系列olige(dT)12MN引物中的一種(M=A 、C 、G,N=A 、C 、G 、T),用此引物對來自兩種或兩種以上對比材料的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,形成cDNA,并用此引物錨定cDNA第二條鏈的3′端,用另一條隨機(jī)寡核苷酸引物與cDNA第一鏈互補(bǔ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于寡核苷酸隨機(jī)結(jié)合在cDNA的互補(bǔ)靶點(diǎn)上,來自不同mRNA擴(kuò)增片段的大小是不同的,利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳,對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離,并可顯示差異表達(dá)的cDNA片段。

mRNA差異顯示技術(shù),具有起始RNA用量少(僅需0.2 μ g總RNA 作為起始材料)、簡便快速、準(zhǔn)確、靈敏度高,可同時比較多個樣品,并可以通過PCR獲得全長,來深化分子及功能特性的研究等優(yōu)點(diǎn)。目前已廣泛用于發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、病理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、植物生理等方面的研究。但也存在一些問題,如出現(xiàn)差別的條帶太多,電泳顯示的差異條帶不能用Northern blot完全驗(yàn)證,假陽性率有時高達(dá)70%以上[2];擴(kuò)增片段的分子長度較短,一般不大于600 bp;其中某些片段源自差異表達(dá)的基因,某些源自組成型表達(dá)的基因;檢測到的往往是3′端出現(xiàn)差異的基因,使上游的差異表達(dá)信息得不到檢測;此外還有重復(fù)性較差,不能檢測低豐度mRNA。

為了克服以上的缺點(diǎn),mRNA差異顯示技術(shù)得到了許多改進(jìn):最初的DDRT-PCR其3′端為 T11 MN(M=A 、C 、G,N=A 、C 、G 、T)的錨定引物 ,有12個組合,因此要全面分析總mRNA的差異工作量巨大,且在變性膠中容易產(chǎn)生smear帶[3],因此改為T11M(M=A、C、G),這樣將總mRNA 分為3個亞群,這樣大大減少了DDRT-PCR的工作量,避免了smear狀態(tài);隨機(jī)引物也由10個堿基增加到了13、18、25個等等,這樣不但可以提高重復(fù)性,避免過多的差異條帶出現(xiàn),還可以盡量覆蓋所有的差異表達(dá)基因。將差異條帶利用反向Northern blot雜交驗(yàn)證大大降低了假陽性[4]。此外還在RNA提取后采用DNA酶消化處理來減少DNA污染,PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化,電泳條件等方面做了一些改進(jìn)。

2 抑制消減雜交

1996年,Diatchenko L等[5]建立了一種新的以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交方法,稱為抑制消減雜交。該方法運(yùn)用了雜交二極動力學(xué)原理,即高豐度單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于低豐度的單鏈cDNA,從而使原來在豐度上有差別的單鏈cDNA相對含量達(dá)到基本一致。而所謂抑制PCR,則是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)先于鏈間退火的規(guī)律使非目的序列片段3′端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),無法與引物配對,從而選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。這種方法克服了以往任何一種差減方法的技術(shù)限制,在差減雜交的過程中使不同豐度cDNA拷貝數(shù)差異趨于均衡,因此不同豐度的差異表達(dá)基因都能得到有效克隆。雜交雙方為Tester和Driver,首先提取待比較的兩組細(xì)胞的mRNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后,將分為兩份,分別接上不同的接頭,分別向兩個樣品中加入過量的,于雜交緩沖液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。第一輪雜交反應(yīng)完畢后,將兩個樣品混合,再加入過量變性的繼續(xù)雜交。兩輪雜交后的群體經(jīng)末端補(bǔ)平后,用與接頭外測序列對應(yīng)的一對巢式引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增,二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物既可直接用于構(gòu)建差減cDNA文庫,又能用做雜交探針對文庫進(jìn)行差示篩選,篩選出來的克隆經(jīng)雜交驗(yàn)證后,可進(jìn)行測序分析。

SSH技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn),主要表現(xiàn)在以下幾個方面:基于雜交動力學(xué)原理使不同豐度的mRNA分子趨于一致,SSH克服了不同mRNA分子拷貝數(shù)目不同對雜交結(jié)果的影響,從而大大提高了差減的靈敏度。僅需一輪差減雜交,即可對差異表達(dá)的cDNA分子達(dá)到1 000多倍的富集[6],保證了低豐度mRNA的檢出。速度快,效率高,一次SSH 可以同時分離到幾十甚至幾百個差異表達(dá)的基因。陽性率可高達(dá)94%[7]。SSH技術(shù)也存在一些缺點(diǎn):需要較多的起始材料,不能同時進(jìn)行數(shù)個材料之間的比較,對材料的要求也較高,存在小片段缺失時也不能有效檢測。

3 基因表達(dá)系列分析技術(shù)

基因表達(dá)系列分析是Velculescu V E等[8]在1995年建立的一種快速而高效地大規(guī)模研究基因表達(dá)的方法,其主要依據(jù)兩個理論:(1)一個來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一個短的寡核苷酸序列(9～11 bp),含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性所需的足夠信息,可以作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽。(2)這些標(biāo)簽可以通過簡單的方法串聯(lián)在一起,形成大量多聯(lián)體(concatemer),對每個克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測序并應(yīng)用SAGE軟件分析,可確定表達(dá)的基因種類,并根據(jù)標(biāo)簽的數(shù)量來確定基因的表達(dá)豐度。

SAGE技術(shù)流程主要包括:提取mRNA,以生物素化的oligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。錨定酶(anchoring enzyme,AE)酶切生物素標(biāo)記的cDNA,如NlaIII作為錨定酶。錨定酶酶切產(chǎn)物通過生物素磁珠分離含有3′端poly(A)尾巴的cDNA片段。將cDNA酶切片段等分為A和B兩部分,分別與設(shè)計好的兩種連接子A或B結(jié)合。每一種接頭都含有標(biāo)簽酶(tagging enzyme,TE)酶切位點(diǎn)序列,標(biāo)簽酶是一種Ⅱ類限制酶,它能在距識別位點(diǎn)約2O堿基的位置切割DNA雙鏈。用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段(約9～10堿基),即釋放cDNA標(biāo)簽。連接產(chǎn)物A和B經(jīng)標(biāo)簽酶酶切后,產(chǎn)生的兩個含有接頭序列和標(biāo)簽序列的短cDNA片段混合,進(jìn)行平端連接。用接頭引物A和引物B擴(kuò)增雙標(biāo)簽,用錨定酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物,并分離雙標(biāo)簽。含有粘性末端的雙標(biāo)簽連接形成含多標(biāo)簽連接子,克隆并測序。測序結(jié)果采用SAGE分析軟件對標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。統(tǒng)計原始序列中每個標(biāo)簽序列、數(shù)目及其發(fā)生率,生成相應(yīng)的報告和豐度指標(biāo),分析整理數(shù)據(jù)。比較SAGE文庫標(biāo)簽的豐度,分析其意義。

基因表達(dá)系列分析是一種高效、快捷、低成本的研究生物基因表達(dá)水平的方法,可在整體水平對細(xì)胞或組織中的大量轉(zhuǎn)錄本同時進(jìn)行分析,從而全面反映細(xì)胞或組織中的基因表達(dá)情況,同時還可進(jìn)行不同組織或細(xì)胞的所有差別表達(dá)基因的比較和研究。但由于SAGE程序的復(fù)雜性,在應(yīng)用過程中還存在一些問題,如平端連接的效率低和連接速率受末端DNA序列的影響明顯,測序過程中產(chǎn)生誤差等。這些問題在很大程度上影響了后期的統(tǒng)計分析結(jié)果。SAGE方法需要較多的mRNA,因此對于微量樣本受到了很大的限制,科學(xué)家對此方法做了改進(jìn),建立了多種微量的試驗(yàn)方法,如micro SAGE[9]和mini SAGE[10]等。

4 基因芯片

基因芯片是指把大量核酸片段固定在載體基片上,組成密集的按序排列的探針集群,通過與標(biāo)記樣品核酸雜交,雜交信號檢測,判斷靶核酸的有無或數(shù)量的一項(xiàng)技術(shù)。常見的芯片可分為兩大類:一種是原位合成,適用于寡核苷酸;一種是直接點(diǎn)樣,多用于大片段DNA,有時也適用于寡核苷酸,甚至mRNA。基因芯片技術(shù)主要包括3個方面的內(nèi)容:芯片的制備、雜交、檢測?；蛐酒瑢雽?dǎo)體工業(yè)的微型制造技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來,通過把巨大數(shù)量的寡核苷酸、cDNA等固定在一塊面積極小的硅片、玻片或尼龍膜等基片上而構(gòu)成。由于該技術(shù)同時將大量的探針固定于支持物上,所以可以一次對大量序列進(jìn)行檢測和基因分析,解決了傳統(tǒng)的核酸印跡雜交操作復(fù)雜、自動化程度低、檢測序列數(shù)量少等缺點(diǎn)。具有并行性、多樣化、微型化、自動化等特點(diǎn)。但其價格昂貴,探針的合成和固定比較復(fù)雜,低豐度表達(dá)基因不易被檢測,還有待于改進(jìn)提高。目前基因芯片在基因表達(dá)分析[11]、醫(yī)學(xué)科研與疾病診斷[12]等各領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

5 展望

以上幾種方法都是目前常用的分離差異表達(dá)基因的方法,在技術(shù)操作方面都比較成熟,也有許多成功的先例。這幾種方法在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,如對不同發(fā)育時期、生理狀態(tài)或病理過程中基因表達(dá)進(jìn)行分析,能揭示發(fā)育過程、生理活動或病理過程的分子機(jī)制分離抗病相關(guān)基因;尋找病原應(yīng)答EST s,這些ESTs可作為研究機(jī)體疾病抗性主效基因的良好候選基因,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可培育出抗病品種;對生產(chǎn)性能不同的動物進(jìn)行品種間或個體間分析,尋找與生產(chǎn)性相關(guān)的差異表達(dá)基因,可為分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行育種奠定基礎(chǔ)。雖然這幾種方法在技術(shù)上比較成熟,但都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn),因此有著不同的應(yīng)用范圍,在試驗(yàn)中要根據(jù)實(shí)際情況加以利用。為了克服這幾種方法的缺點(diǎn),在不斷需求改進(jìn)的同時,可將其結(jié)合使用,來取長補(bǔ)短。例如本實(shí)驗(yàn)室將mRNA差異顯示技術(shù)和微陣列技術(shù)結(jié)合使用得到了很好的結(jié)果。

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