張 鈺 李俊霞 顧 艷 李 奕

早期復發(fā)性流產(ERSA)是指妊娠 12周以前,連續(xù)發(fā)生2次或 2次以上的自然流產,臨床發(fā)病率 3%～5%。排除臨床上可查出的病因(染色體、解剖、內分泌及感染因素),仍有近 1/2的ERSA患者病因未明,稱不明原因早期復發(fā)性流產(UERSA),是臨床上難治性的不育癥。隨著生殖免疫學的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)UERSA因母胎免疫調節(jié)異常所致。最新的研究資料顯示,巨噬細胞移動抑制因子(MIF)在胚胎種植和生長發(fā)育過程中起著極為重要的作用[1]。本文旨在探討 UERSA患者血清 MIF水平及MIF-mRNA在絨毛、蛻膜組織中的表達水平,試圖從母胎界面細胞免疫角度闡明 UERSA發(fā)病機制,為臨床建立有效的監(jiān)測指標和治療方案提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

1.UERSA組 知情同意下選取 2008年 1～12月在天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院計劃生育門診因 UERSA就診的患者 30例。病例選擇條件：連續(xù)發(fā)生至少2次早期自然流產,年齡 20～40歲,孕周為 7～12周,超聲檢查證實胚胎發(fā)育停止或枯萎孕卵、無原始胎心搏動;夫婦外周血染色體核型檢查正常;婦科檢查、超聲、子宮輸卵管造影排除生殖器官畸形;性激素、甲狀腺功能、血糖、胰島素等內分泌檢查均正常;排除生殖道感染性疾病,如支原體、衣原體等感染;優(yōu)生 5項(TORCH)檢驗均為陰性;自身抗體(抗心磷脂抗體)陰性,部分凝血活酶時間正常;男方精液常規(guī)檢查無異常。

2.正常早孕組 知情同意下選取自愿要求終止妊娠的健康早孕婦女 30例,年齡 20～40歲,孕周均在 7～12周,有 1次正常生育史,無自然流產或早產等不良孕產史。本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產癥狀和體征;超聲檢查證實胚胎發(fā)育正常,見胚芽和胎心搏動,接收當日進行吸宮手術。

二、實驗室檢測

1.血清MIF測定 兩組均在吸宮術前空腹抽肘靜脈血5ml加入促凝管中,上下混勻數(shù)次,室溫靜置 2h后,2 500r/m in離心 15min后,取上清液,置于 -80℃冰箱凍存待測。

2.絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達 兩組均于吸宮術中取樣,于無菌條件下取絨毛、蛻膜組約 0.3g,立刻用DEPC水沖洗,迅速投入液氮,繼之保存于 -80℃低溫水箱中。RNAiso Plus抽取絨毛、蛻膜總RNA,cDNA合成按照逆轉錄試劑盒說明書進行。實驗所用引物應用引物設計軟件 Gene runner自行設計,由六合通生物技術有限公司合成。序列如下：β -actin：FW 5′-GCAAAGACCTGTACGCCAAC-3′,RV 5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′;MIF： FW 5′-CGCAGAACCGCTCCTACAG-3′,RV 5′-GCGTTCATGTCGTAATACTTGATG-3′。 總反應體系 20μl。 實時定量 PCR用SDS211軟件進行,選擇相對定量模式,每個標本均作 2個重復孔。PCR循環(huán)條件：95℃預變性 10s,溫度變化速度為20℃/s;95℃ 5s、60℃(Cyclophilin 55℃)20s、 72℃10s,進行 40個循環(huán),溫度變化速度為 20℃/s。在每個循環(huán)的延伸末檢測熒光信號。隨后是升溫程序：95℃ 0s,65℃ 15s,95℃ 0s,溫度變化速度為 0.1℃/s,繪制PCR產物的熔解曲線。PCR結束后,分析各孔CT值(模板擴增到一定量拷貝數(shù)時即處于指數(shù)上升期所需反應循環(huán)數(shù)大小)。根據(jù) 2-△△CT法,得出目的基因的量等于 2-△△CT的值。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、血清MIF的水平

血清中 MIF濃度 UERSA組(10.98±3.02ng/m l)低于正常早孕組(16.53±4.34ng/ml),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

二、絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達水平

UERSA組絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的 2-△△CT值為0.022±0.001,0.97±0.58;正常早孕組絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的 2-△△CT值為 1.29±1.11,1.20±0.85。 UERSA組患者絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達均低于正常早孕婦女,差異有統(tǒng)計學意義(均 P＜0.05)。

三、血清MIF濃度與絨毛、蛻膜組織中 MIF-m RNA表達的相關性

UERSA組和正常早孕組血清中 MIF濃度與絨毛組織中MIF-mRNA的表達呈正相關(r=0.69,P＜0.05),與蛻膜組織中 MIF-mRNA的表達也呈正相關(r=0.71,P＜0.05)。

討 論

一、MIF的來源和功能

1966年 Bloom和 David將由活化的 T淋巴細胞分泌的可抑制單核/巨噬細胞移動的細胞因子正式命名為 MIF。近年來,隨著體內 MIF蛋白分離、純化和MIF cDNA克隆的成功,人們對MIF的產生有了更深入的認識?，F(xiàn)已證實 MIF在腺垂體細胞、活化的T淋巴細胞、單核/巨噬細胞等細胞中高表達產生。巨噬細胞是 MIF的主要來源,MIF作用的靶細胞主要為巨噬細胞。巨噬細胞作為機體免疫反應中的重要角色,不僅參與非特異性免疫防御,而且是特異性免疫應答中一類關鍵細胞,它可以直接吞噬抗原異物,而且能呈遞抗原,分泌多種細胞因子和直接殺傷腫瘤細胞,廣泛參與免疫應答、免疫效應與免疫調節(jié),在許多疾病的病理變化中起關鍵作用。MIF具有多種生物活性,主要是抑制巨噬細胞游走,促進其在炎癥局部浸潤、增生,并促使巨噬細胞分泌多種細胞因子及化學物質(如白介素 -1、腫瘤壞死因子 -a、一氧化氮),共同參與調節(jié)炎癥反應和機體免疫[2]。

二、UERSA患者血清 MIF水平變化的意義

近年來,隨著免疫學研究的深入,逐步認識到 UERSA的發(fā)生與母胎界面局部細胞功能和細胞因子表達關系密切。目前,已知與妊娠相關的許多細胞因子的主要功能和作用機制,但針對MIF在正常妊娠和流產發(fā)生中的作用還鮮為報道。Arcuri等[3]報道,在子宮蛻膜的活性細胞、腺上皮細胞、間質細胞及滋養(yǎng)細胞中均有MIF的表達,表明在胚胎植入期及發(fā)育期,該細胞因子扮演了重要角色。Yamada等[4]研究表明,一些胎兒染色體核型正常而反復流產的婦女,與有反復流產史但已有活產的婦女相比,早孕時期,前者血清中 MIF濃度有極顯著下降,與正常妊娠相比也有顯著差異,故推測她們早孕期間血清MIF濃度下降與流產相關。本研究也證實,UERSA組血清中MIF濃度較正常早孕組降低,差異有統(tǒng)計學意義,由此推測 MIF在妊娠的建立和維持中起著重要作用,是有助于建立早孕的因子,MIF的降低可能導致流產的發(fā)生,但具體作用機制還有待進一步研究。

三、絨毛、蛻膜組織中 MIF-mRNA表達下降與 UERSA發(fā)生

母胎界面-蛻膜面富含母體來源且蛻膜浸潤的免疫活性細胞和胎兒來源的滋養(yǎng)細胞,它們通過分泌細胞因子構成復雜的細胞間信息網絡,進行母胎間的免疫對話,形成有利于維持正常妊娠的免疫微環(huán)境。蛻膜免疫活性細胞主要由NK細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞組成。已有研究證實,MIF可提高巨噬細胞在種植部位的濃度,激活巨噬細胞,增強其黏附力和吞噬作用,觸發(fā)吞噬活性破壞細菌,但不破壞胎盤細胞,保護胚胎免遭感染,激活的巨噬細胞在滋養(yǎng)細胞的誘導下還會分泌促進滋養(yǎng)細胞生長和發(fā)育的細胞因子[5]。Ap te等[6]研究證實MIF屬于免疫抑制細胞因子,具有Th2型細胞因子的作用,MIF對胚胎植入時的細胞免疫有抑制作用,通過阻止自然殺傷細胞(NK細胞)釋放細胞毒性穿孔顆粒而發(fā)揮其抑制NK細胞活性的作用,從而抑制活化的 NK細胞溶解滋養(yǎng)層細胞,使母體子宮接受胚胎。Bacher等[7]認為母胎界面MIF還參與調節(jié)母體 T細胞激活和維持母胎界面 Th2型免疫,Th2型免疫偏移對正常妊娠胎盤的生長是必要的,對胚胎植入和妊娠維持有重要意義[8]。最新研究還證實,MIF除調節(jié)炎癥和免疫功能外,也促進細胞生長分化和新生血管的形成,對妊娠建立后滋養(yǎng)細胞的增殖,胚胎的正常分化、發(fā)育和胎盤血管的生成可能有非常重要的作用[9]。

目前國內外文獻尚未見關于 MIF在UERSA患者母胎界面的蛻膜、絨毛中表達水平的研究。本研究表明,UERSA患者母胎界面的蛻膜、絨毛中 MIF-mRNA的表達水平均較正常早孕婦女降低,表明這種異常,可能影響了滋養(yǎng)細胞與母體免疫細胞之間的免疫對話,不利于母胎界面的免疫微環(huán)境發(fā)生正常妊娠的改變,導致母胎界面免疫耐受的格局被打破,最終導致了 UERSA的發(fā)生。

四、血清MIF水平和絨毛、蛻膜組織中 MIF-m RNA表達的相關性及意義

本研究顯示,UERSA組血清中MIF濃度較正常早孕組降低;血清MIF水平和絨毛、蛻膜組織中MIF-mRNA表達呈正相關性,表明妊娠期母體血清MIF主要來源于胎兒胎盤循環(huán),MIF的低血清濃度提示其可做為預測 UERSA發(fā)生發(fā)展的有效監(jiān)測指標。

總之,通過上述研究結論提示 UERSA患者母胎界面蛻膜、絨毛MIF表達異常,可能在UERSA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們可以嘗試對既往有 UERSA病史的患者進行血清MIF篩查,血清 MIF水平降低者可預防性給予 MIF或其人工合成類似物治療,可能提高其妊娠成功率,這將給 UERSA的預測和治療帶來新的突破。

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3 Arcuri F,RicciC,Ietta F,et al.Macrophage nigration inhibitory factor in the human endometrium：expression and localization during themenstrual cyc le and early pregnancy.Biol Reprod,2001,64(4)：1200～1205.

4 Yamada H,Kato EH,Morikawa M,et al.Decreased serum levels of macrphage migration inhibition factor in normalchromosome karyotype.Hum Reprod,2003,18(3)：616～621.

5 Fest S,Aldo PB,Abrahams VM,et al.Trophoblast-macrophage interactions：a regulatory network for the protection of pregnancy.Am J Reprod Immunol,2007,57(1)：55～ 66.

6 Apte RS,Sinha D,Mayhew E,et al.Cutting edge：role ofmacrophage nigration inhibitory factor in inhibiting NK cess activity and preserving immune privilege.J Immunol,1998,160(12)：5693～5696.

7 Bacher M,MetzCH,Calandra T,et al.An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in Tcell activation.Proc Natl Acad Sci U SA,1996,93(15)：7849～ 7854.

8 Bulla R,Fischetti F,Bossi F,et al.Feto-maternal immune interaction at the placental level.Lupus,2004,13(9)：625～ 629.

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