采用非浸潤(rùn)模板制作納米顆?；蛩幬?/h1>
2010-03-16 07:43:38高欣DorianCanelas田少敏
高欣，Dorian A.Canelas，田少敏
(美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)教堂山分校，教堂山市 27599)
1 RNA干擾的機(jī)理及應(yīng)用
1.1 RNA干擾的機(jī)理
作為合成蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)，mRNA(messengerRNA，信使RNA)承載著生物體中至關(guān)重要的遺傳信息?？梢砸种?mRNA物質(zhì)主要有 RNA酶、ASOs(Antisense Oligonucleotides，反義寡核苷酸)和siRNA(smallinterferingRNA，小型干擾RNA)。其中，發(fā)現(xiàn)于1998年的siRNA因其較高的基因沉默率而廣受關(guān)注。siRNA為短小的雙鏈RNA，每條鏈包含21到23個(gè)核苷酸，通常3'端有2到3個(gè)未配對(duì)的核苷酸，并在5'端基核苷酸上有一個(gè)單磷酸鹽基團(tuán)[1，2]。
siRNA靶向降解相應(yīng)mRNA的過(guò)程稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)。在RNA干擾中，siRNA首先與多蛋白復(fù)合體—RISC(RNA-induced silencingcomplex，RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體)結(jié)合。而后 siRNA發(fā)生解旋，只由一條單鏈引導(dǎo) mRNA的降解[3]。siRNA的定向識(shí)別和定向降解過(guò)程如圖1所示。
1.2 RNAi基因治療
發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象的科學(xué)家AndrewFire于1998年被授予諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[4]。這主要是由于 RNA干擾在癌癥、病毒感染治療方面的巨大潛力。傳統(tǒng)的癌癥藥物靶向定位的只是蛋白質(zhì)。而RNA干擾藥物直接定向并降解致病基因，理論上可以設(shè)計(jì)降解任意突變基因的siRNA，并有望解決傳統(tǒng)藥物副作用高的缺點(diǎn)。
目前，RNA干擾基因治療的難點(diǎn)在于 siRNA的傳輸。這主要因?yàn)閟iRNA雙鏈骨架上的磷酸鹽基團(tuán)荷負(fù)電，而生物體細(xì)胞膜也荷負(fù)電，兩者彼此排斥。假設(shè)沒(méi)有傳輸載體的幫助，siRNA是不可能自動(dòng)越過(guò)細(xì)胞膜的。最早應(yīng)用于siRNA傳輸?shù)氖遣《据d體，但是它具有引發(fā)生物體免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)，甚至導(dǎo)致癌癥[5]。
圖1 核糖核酸干擾(RNAi)過(guò)程[6]Fig.1 The process of RNA interference
近年來(lái)非病毒載體得到了廣泛的研究，最有成效的包括以下幾類：一，化學(xué)修飾可以提高 siRNA的穩(wěn)定性并提高siRNA的藥理性質(zhì)。特別是膽固醇修飾的siRNA在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)了很好的藥物理化性質(zhì)[7]。二，脂質(zhì)體能夠提高siRNA在血清中的穩(wěn)定性，降低藥物腎排泄并提高細(xì)胞對(duì)藥物的吸收。但其缺點(diǎn)是大小難以控制(50-1000nm)，而且?guī)в姓姾傻闹|(zhì)體毒性較大[8，9]。三，細(xì)胞穿透多肽可以和siRNA形成復(fù)合體并將其直接傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。其缺點(diǎn)是在體內(nèi)循環(huán)中的壽命較短[10]。四，高分子類載體品種繁多，近年來(lái)得到深入的研究。相對(duì)于其它載體，高分子類載體的優(yōu)勢(shì)主要是：不易引發(fā)免疫反應(yīng)；可盛載數(shù)量較多的基因藥物；有多種多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)可供選擇；提高了基因藥物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和循環(huán)穩(wěn)定性。高分子類載體的應(yīng)用機(jī)理是：首先，高分子載體材料通過(guò)靜電吸引、包覆或是吸附的方式與基因藥物結(jié)合形成復(fù)合體。例如，線狀的或支鏈狀的聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)在中性pH條件下是帶正電的高分子，通過(guò)調(diào)節(jié)PEI和基因藥物的比值可以獲得大小合適的運(yùn)載復(fù)合體，從而實(shí)現(xiàn)基因傳輸[11]。其次，在靶向細(xì)胞內(nèi)部，高分子運(yùn)載復(fù)合體可通過(guò)自身的結(jié)構(gòu)特征引發(fā)復(fù)合體的降解，釋放基因藥物。比如，許多高分子載體中包含雙硫鍵，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)都含有的谷光甘肽可將雙硫鍵還原成兩個(gè)巰基，從而破壞了高分子交聯(lián)體系，釋放出基因藥物[12]。本文中介紹的PRINT納米顆粒即可歸為此類載體。
2 高分子PRINT納米顆粒
2.1 PRINT技術(shù)的來(lái)源和基本流程
PRINT技術(shù)的靈感源自于新興的微電子制造技術(shù)。借助于光蝕作用，這種技術(shù)可以連續(xù)、價(jià)廉地在硅圓片上刻畫納米級(jí)的復(fù)雜花紋。北卡大學(xué) De-Simone實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的PRINT技術(shù)可以通過(guò)光蝕后的硅圓片制作出多種多樣的納米顆粒[13]。
與傳統(tǒng)的軟版模制技術(shù)不同，PRINT技術(shù)能夠制作出彼此完全分離的納米顆粒。PRINT所用的模具是光蝕刻畫后的硅圓片，其上均勻排列著重復(fù)一致的納米花紋。PFPE DMA(perfluoropolyether dimethacrylate，全氟聚乙烯二甲基丙烯酸酯)和光引發(fā)劑的混合溶液被滴加到硅圓片表面。待粘稠的混合溶液將硅圓片完全覆蓋后，用紫外燈照射整個(gè)體系而引發(fā)光聚合。在三到五分鐘的時(shí)間內(nèi)，聚合基本完成，原本粘稠的混合溶液通過(guò)交聯(lián)而成為便于后續(xù)操作的PFPE彈性膜。將彈性膜從硅圓片上撕下后，它與模具接觸的一面上復(fù)印了全部的納米花紋。本實(shí)驗(yàn)中將不同的單體溶液滴加到PFPE彈性膜上，光引發(fā)聚合后制作出了各種各樣的高分子顆粒。這主要是由于含氟量高的PFPE膜不能浸潤(rùn)有機(jī)單體溶液所致。具體的PRINT步驟如圖2所示。
2.2 PRINT納米顆粒的優(yōu)勢(shì)
PRINT技術(shù)的獨(dú)特之處在于可以保證所制作的顆粒(如圖3所示)大小形狀均一，并且具有一致的化學(xué)組成和表面特征。這一點(diǎn)對(duì)于研究顆粒在生物體內(nèi)各器官的分布十分重要，同時(shí)還有可能制作出與病毒或蛋白質(zhì)形狀類似的顆粒[14]。與脂質(zhì)體等其他載體相比，大小形狀均一分布的PRINT顆粒能更容易地開展劑量及細(xì)胞穿透研究。同時(shí)，PRINT技術(shù)使得人們可以更方便、更精確地調(diào)節(jié)納米顆粒的各種性質(zhì)，其中包括：顆粒的交聯(lián)密度、電荷量、化學(xué)組成和表面修飾情況等[15]。
3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和數(shù)據(jù)結(jié)果
3.1 使用薄的模具制作PVP PRINT納米顆粒
RNA藥物傳輸實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)制作許多不同組分的納米顆粒(例如組分中含有不同百分含量的交聯(lián)劑或正電荷試劑)來(lái)優(yōu)化藥物傳輸系統(tǒng)。如果此時(shí)還是頻繁的制作傳統(tǒng)的厚模具(每張厚度約為1毫米，需消耗10-15mL的全氟預(yù)聚物)就顯得很不經(jīng)濟(jì)了。為了解決這一問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)中選用了薄的模具(由美國(guó)北卡州三角科技園區(qū)的Liquidia公司提供)，每張厚度為微米級(jí)，僅消耗1mL左右的全氟預(yù)聚物。同時(shí)使用可雙向運(yùn)動(dòng)的層合機(jī)制作納米顆粒。
本實(shí)驗(yàn)中制作200納米*200納米圓柱形顆粒的流程如圖 2所示。首先，將包含乙烯吡咯烷酮單體、siRNA藥物和其他組分的單體混合液滴加到薄模具表面(模具表面上刻有許多200納米*200納米的圓柱形凹坑)；而后，將一張PET膜壓到薄膜具表面從而使單體混合液展開，并填滿模具中的納米凹坑；然后把PET膜揭掉，由于PFPE薄模具表面勢(shì)能低于PET膜，未進(jìn)入納米凹坑中的殘余單體混合液會(huì)被PET膜帶走；在揭走PET膜的同時(shí)，雙向?qū)雍蠙C(jī)將另一張新的PET膜覆蓋到PFPE模具的表面。這是為了防止乙烯吡咯烷酮蒸發(fā)損失；最終，使用紫外燈引發(fā)單體混合液的光聚合，由于PET膜和PFPE模具緊密貼合，排除了單體周圍的空氣，聚合過(guò)程中無(wú)需通氮?dú)獬?。PRINT過(guò)程之后，將PET膜和PFPE模具分離，大部分的PRINT納米顆粒被表面勢(shì)能較高的PET膜帶走(如圖4所示)，通過(guò)細(xì)胞收集掃可將納米顆粒收入純水中(如圖3所示)。顆粒的收集過(guò)程都通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM，ScanningElectronMicroscope)照片得到證實(shí)(圖3、圖4)。
圖2 在非浸潤(rùn)模板中制作納米顆粒的技術(shù)流程圖(帶有孔洞的模板為全氟聚乙烯二甲基丙烯酸酯膜，液體1為單體混合物)Fig.2 The procedures of fabricating PRINT nanoparticles
圖3 實(shí)現(xiàn)沉默核苷核酸(siRNA)傳輸?shù)姆墙?rùn)模板(PRINT)中制作的納米級(jí)顆粒Fig.3 PRINT nanoparticles for siRNA delivery
圖4 聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜上的納米顆粒Fig4 Nanoparticles on the surface of PFPE mold
3.2 實(shí)現(xiàn)siRNA傳輸?shù)念w粒化學(xué)組成
通過(guò)上面對(duì)PRINT技術(shù)流程的了解，不難發(fā)現(xiàn)只要單體混合物各組分能夠互溶即可運(yùn)用PRINT模制高分子顆粒，這意味著PRINT技術(shù)在材料選擇上具有相當(dāng)?shù)亩鄻有?。為了保護(hù)并定向傳輸易分解的siRNA，本實(shí)驗(yàn)選用了PVP制作顆粒。因此，單體混合液的主體是 VP(N-vinyl Pyrrolidone，乙烯吡咯烷酮單體)。VP分子中含有一個(gè)碳碳雙鍵，可以參與光聚合反應(yīng)。而其聚合產(chǎn)物PVP是易溶于水的無(wú)毒高分子，在醫(yī)療材料中有廣泛應(yīng)用。
除VP以外，單體混合液中還含有許多功能成分。正電荷試劑AETMAC(2-acryloxyethyltrimethylammonium)就是其中之一。AETMAC上帶有正電荷，可以有效的吸引帶負(fù)電荷的siRNA從而達(dá)到包裝基因藥物的目的，并使整個(gè)傳輸顆粒荷正電。這樣，顆粒與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互吸引，可以輕易地將siRNA傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部。另一個(gè)重要的功能單體分子是交聯(lián)劑。在實(shí)驗(yàn)中試用了 bis(ethyldisulfide)acrylate(BEDSA)交聯(lián)劑和N，N'-cystaminebisacrylamide交聯(lián)劑。其中BEDSA顯示出最好的siRNA傳輸效果。BEDSA分子中含有的雙硫鍵在細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境作用下可被還原成兩個(gè)巰基，從而降解了PRINT顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有助于釋放出siRNA藥物。其它成分有熒光標(biāo)記物Fluorescein-o-acrylate和光聚合引發(fā)劑1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone(HCPK)。以上所述的各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示：
3.3 PVP PRINT納米顆粒的細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)
用PVP PRINT納米顆粒包裹敏感的siRNA分子實(shí)現(xiàn)藥物傳輸，首先要保證顆?？杀患?xì)胞吸收。由于顆粒成分中包含熒光標(biāo)記 Fluorescein-o-acrylate，可以通過(guò)液式細(xì)胞計(jì)檢查的方法檢測(cè)顆粒的細(xì)胞吸收情況。
圖5顯示的就是含有不同量AETMAC正電荷試劑 PVP PRINT顆粒的細(xì)胞吸收率隨顆粒濃度變化的情況。
圖5 PVP PRINT顆粒吸收率隨顆粒濃度變化的曲線Fig5 The percentage of particles with particles vs.particle concentration
值得注意的是，圖5中縱坐標(biāo)代表的是吸收了PVPPRINT顆粒的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素基因的 HeLa癌癥細(xì)胞。當(dāng)顆粒中所含正電荷試劑量大于9%時(shí)，顆粒細(xì)胞吸收率可達(dá)90%以上。最終選定的正電荷試劑含量為10%。顆粒各組分含量如表1所示。
表1 用于基因傳輸?shù)募{米顆粒組成成分Tab.1 The chemical composition of the nanoparticles for siRNA delivery
3.4 PVP PRINT顆粒的熒光素酶量降低實(shí)驗(yàn)
為了評(píng)價(jià) PVP PRINT顆粒的藥物傳輸效果，對(duì)經(jīng)過(guò)顆粒處理的HeLa癌癥細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染螢火蟲熒光素酶)進(jìn)行了兩項(xiàng)細(xì)胞檢驗(yàn)：一是熒光素酶量降低檢驗(yàn)，二是細(xì)胞存活率檢驗(yàn)。在熒光素酶量降低檢驗(yàn)中，將被顆粒處理后細(xì)胞的熒光素酶含量與只被營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)處理后細(xì)胞的熒光素酶含量進(jìn)行了比較。同時(shí)，還要檢測(cè)細(xì)胞的存活率以保證熒光素酶量的降低并非來(lái)源于細(xì)胞大量死亡。因此，熒光素酶的降低效率是通過(guò)比較熒光素酶量降低和細(xì)胞存活率得到的，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所使用siRNA的有效性，用一種已知有效的脂質(zhì)體傳輸siRNA，作為PVP PRINT納米顆粒的比照組。
首個(gè)成功的PVP納米顆粒表現(xiàn)出約40%的熒光素酶基因抑制量(如圖6)。所用納米顆粒的劑量為20-40g/mL。HeLa細(xì)胞接觸顆粒的時(shí)間為4h。其間，細(xì)胞培養(yǎng)皿被放置在37°C的保溫槽中。具體的實(shí)驗(yàn)步驟是：在96孔細(xì)胞盤的每個(gè)孔中放入約20000個(gè)HeLa細(xì)胞。第二天，將不同劑量的含siRNA PVP PRINT顆粒加入不同的孔中，然后在37°C下培養(yǎng)細(xì)胞。4h后，將還未被細(xì)胞吸收的顆粒移走，加入新鮮的培養(yǎng)液。此時(shí)即可進(jìn)行熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率的測(cè)量。
圖6 熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率圖：實(shí)驗(yàn)組為吸收聚乙烯吡咯烷酮納米顆粒的HeLa細(xì)胞，比照組為吸收脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(已知有效的傳輸系統(tǒng))的HeLa細(xì)胞Fig.6 The graphs of Luciferase expression and cell viability:use HeLa cells taking up PVP PRINT nanoparticles as the experiment group and use HeLa cells taking up Lipofectamine 2000 as the control group
3.5 PVP PRINT顆粒化學(xué)成分的優(yōu)化
圖7中所示的PVP顆粒中含有10%的交聯(lián)劑，所達(dá)到的熒光素酶降低量為40%。為了提高PVP納米顆粒的siRNA傳輸效率，實(shí)驗(yàn)中嘗試提高交聯(lián)劑的含量。圖7展示了含有10%，20%和30%交聯(lián)劑的PVP納米顆粒的熒光素酶降低率。其中含有30%交聯(lián)劑的納米顆粒表現(xiàn)出最高的基因抑制效率，熒光素酶表達(dá)量降低了約65%。
圖7 熒光素酶表達(dá)量及細(xì)胞存活率：傳輸系統(tǒng)為200*200納米聚乙烯吡咯烷酮納米顆粒，三組顆粒中含有交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%，20%，30%Fig.7 The graphs of Luciferase expression and cell viability:use 200*200nm PVP PRINT nanoparticles as the delivery system，the percentages of crosslinker are 10%，20%，30%
4 結(jié)論
主要探討了PRINT納米顆粒這一新型非病毒傳輸系統(tǒng)在siRNA藥物傳輸方面的一些嘗試。從中可見(jiàn)，PRINT技術(shù)用于siRNA藥物傳輸有著巨大的潛力：首先，SEM電鏡照片證實(shí)了我們確實(shí)可以制作出大小、形狀、化學(xué)成分一致的單分散顆粒；其次，熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率兩項(xiàng)檢驗(yàn)證明了PVPPRINT納米顆粒經(jīng)過(guò)成分優(yōu)化可達(dá)到65%的基因抑制效率。本項(xiàng)目未來(lái)的工作將致力于設(shè)計(jì)出針對(duì)于真實(shí)致病基因的PRINT顆粒傳輸系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)的基因抑制。
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siRNA靶向降解相應(yīng)mRNA的過(guò)程稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)。在RNA干擾中，siRNA首先與多蛋白復(fù)合體—RISC(RNA-induced silencingcomplex，RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體)結(jié)合。而后 siRNA發(fā)生解旋，只由一條單鏈引導(dǎo) mRNA的降解[3]。siRNA的定向識(shí)別和定向降解過(guò)程如圖1所示。
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發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象的科學(xué)家AndrewFire于1998年被授予諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[4]。這主要是由于 RNA干擾在癌癥、病毒感染治療方面的巨大潛力。傳統(tǒng)的癌癥藥物靶向定位的只是蛋白質(zhì)。而RNA干擾藥物直接定向并降解致病基因，理論上可以設(shè)計(jì)降解任意突變基因的siRNA，并有望解決傳統(tǒng)藥物副作用高的缺點(diǎn)。
目前，RNA干擾基因治療的難點(diǎn)在于 siRNA的傳輸。這主要因?yàn)閟iRNA雙鏈骨架上的磷酸鹽基團(tuán)荷負(fù)電，而生物體細(xì)胞膜也荷負(fù)電，兩者彼此排斥。假設(shè)沒(méi)有傳輸載體的幫助，siRNA是不可能自動(dòng)越過(guò)細(xì)胞膜的。最早應(yīng)用于siRNA傳輸?shù)氖遣《据d體，但是它具有引發(fā)生物體免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)，甚至導(dǎo)致癌癥[5]。
圖1 核糖核酸干擾(RNAi)過(guò)程[6]Fig.1 The process of RNA interference
近年來(lái)非病毒載體得到了廣泛的研究，最有成效的包括以下幾類：一，化學(xué)修飾可以提高 siRNA的穩(wěn)定性并提高siRNA的藥理性質(zhì)。特別是膽固醇修飾的siRNA在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)了很好的藥物理化性質(zhì)[7]。二，脂質(zhì)體能夠提高siRNA在血清中的穩(wěn)定性，降低藥物腎排泄并提高細(xì)胞對(duì)藥物的吸收。但其缺點(diǎn)是大小難以控制(50-1000nm)，而且?guī)в姓姾傻闹|(zhì)體毒性較大[8，9]。三，細(xì)胞穿透多肽可以和siRNA形成復(fù)合體并將其直接傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。其缺點(diǎn)是在體內(nèi)循環(huán)中的壽命較短[10]。四，高分子類載體品種繁多，近年來(lái)得到深入的研究。相對(duì)于其它載體，高分子類載體的優(yōu)勢(shì)主要是：不易引發(fā)免疫反應(yīng)；可盛載數(shù)量較多的基因藥物；有多種多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)可供選擇；提高了基因藥物的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和循環(huán)穩(wěn)定性。高分子類載體的應(yīng)用機(jī)理是：首先，高分子載體材料通過(guò)靜電吸引、包覆或是吸附的方式與基因藥物結(jié)合形成復(fù)合體。例如，線狀的或支鏈狀的聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)在中性pH條件下是帶正電的高分子，通過(guò)調(diào)節(jié)PEI和基因藥物的比值可以獲得大小合適的運(yùn)載復(fù)合體，從而實(shí)現(xiàn)基因傳輸[11]。其次，在靶向細(xì)胞內(nèi)部，高分子運(yùn)載復(fù)合體可通過(guò)自身的結(jié)構(gòu)特征引發(fā)復(fù)合體的降解，釋放基因藥物。比如，許多高分子載體中包含雙硫鍵，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)都含有的谷光甘肽可將雙硫鍵還原成兩個(gè)巰基，從而破壞了高分子交聯(lián)體系，釋放出基因藥物[12]。本文中介紹的PRINT納米顆粒即可歸為此類載體。
2 高分子PRINT納米顆粒
2.1 PRINT技術(shù)的來(lái)源和基本流程
PRINT技術(shù)的靈感源自于新興的微電子制造技術(shù)。借助于光蝕作用，這種技術(shù)可以連續(xù)、價(jià)廉地在硅圓片上刻畫納米級(jí)的復(fù)雜花紋。北卡大學(xué) De-Simone實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的PRINT技術(shù)可以通過(guò)光蝕后的硅圓片制作出多種多樣的納米顆粒[13]。
與傳統(tǒng)的軟版模制技術(shù)不同，PRINT技術(shù)能夠制作出彼此完全分離的納米顆粒。PRINT所用的模具是光蝕刻畫后的硅圓片，其上均勻排列著重復(fù)一致的納米花紋。PFPE DMA(perfluoropolyether dimethacrylate，全氟聚乙烯二甲基丙烯酸酯)和光引發(fā)劑的混合溶液被滴加到硅圓片表面。待粘稠的混合溶液將硅圓片完全覆蓋后，用紫外燈照射整個(gè)體系而引發(fā)光聚合。在三到五分鐘的時(shí)間內(nèi)，聚合基本完成，原本粘稠的混合溶液通過(guò)交聯(lián)而成為便于后續(xù)操作的PFPE彈性膜。將彈性膜從硅圓片上撕下后，它與模具接觸的一面上復(fù)印了全部的納米花紋。本實(shí)驗(yàn)中將不同的單體溶液滴加到PFPE彈性膜上，光引發(fā)聚合后制作出了各種各樣的高分子顆粒。這主要是由于含氟量高的PFPE膜不能浸潤(rùn)有機(jī)單體溶液所致。具體的PRINT步驟如圖2所示。
2.2 PRINT納米顆粒的優(yōu)勢(shì)
PRINT技術(shù)的獨(dú)特之處在于可以保證所制作的顆粒(如圖3所示)大小形狀均一，并且具有一致的化學(xué)組成和表面特征。這一點(diǎn)對(duì)于研究顆粒在生物體內(nèi)各器官的分布十分重要，同時(shí)還有可能制作出與病毒或蛋白質(zhì)形狀類似的顆粒[14]。與脂質(zhì)體等其他載體相比，大小形狀均一分布的PRINT顆粒能更容易地開展劑量及細(xì)胞穿透研究。同時(shí)，PRINT技術(shù)使得人們可以更方便、更精確地調(diào)節(jié)納米顆粒的各種性質(zhì)，其中包括：顆粒的交聯(lián)密度、電荷量、化學(xué)組成和表面修飾情況等[15]。
3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和數(shù)據(jù)結(jié)果
3.1 使用薄的模具制作PVP PRINT納米顆粒
RNA藥物傳輸實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)制作許多不同組分的納米顆粒(例如組分中含有不同百分含量的交聯(lián)劑或正電荷試劑)來(lái)優(yōu)化藥物傳輸系統(tǒng)。如果此時(shí)還是頻繁的制作傳統(tǒng)的厚模具(每張厚度約為1毫米，需消耗10-15mL的全氟預(yù)聚物)就顯得很不經(jīng)濟(jì)了。為了解決這一問(wèn)題，在實(shí)驗(yàn)中選用了薄的模具(由美國(guó)北卡州三角科技園區(qū)的Liquidia公司提供)，每張厚度為微米級(jí)，僅消耗1mL左右的全氟預(yù)聚物。同時(shí)使用可雙向運(yùn)動(dòng)的層合機(jī)制作納米顆粒。
本實(shí)驗(yàn)中制作200納米*200納米圓柱形顆粒的流程如圖 2所示。首先，將包含乙烯吡咯烷酮單體、siRNA藥物和其他組分的單體混合液滴加到薄模具表面(模具表面上刻有許多200納米*200納米的圓柱形凹坑)；而后，將一張PET膜壓到薄膜具表面從而使單體混合液展開，并填滿模具中的納米凹坑；然后把PET膜揭掉，由于PFPE薄模具表面勢(shì)能低于PET膜，未進(jìn)入納米凹坑中的殘余單體混合液會(huì)被PET膜帶走；在揭走PET膜的同時(shí)，雙向?qū)雍蠙C(jī)將另一張新的PET膜覆蓋到PFPE模具的表面。這是為了防止乙烯吡咯烷酮蒸發(fā)損失；最終，使用紫外燈引發(fā)單體混合液的光聚合，由于PET膜和PFPE模具緊密貼合，排除了單體周圍的空氣，聚合過(guò)程中無(wú)需通氮?dú)獬?。PRINT過(guò)程之后，將PET膜和PFPE模具分離，大部分的PRINT納米顆粒被表面勢(shì)能較高的PET膜帶走(如圖4所示)，通過(guò)細(xì)胞收集掃可將納米顆粒收入純水中(如圖3所示)。顆粒的收集過(guò)程都通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM，ScanningElectronMicroscope)照片得到證實(shí)(圖3、圖4)。
圖2 在非浸潤(rùn)模板中制作納米顆粒的技術(shù)流程圖(帶有孔洞的模板為全氟聚乙烯二甲基丙烯酸酯膜，液體1為單體混合物)Fig.2 The procedures of fabricating PRINT nanoparticles
圖3 實(shí)現(xiàn)沉默核苷核酸(siRNA)傳輸?shù)姆墙?rùn)模板(PRINT)中制作的納米級(jí)顆粒Fig.3 PRINT nanoparticles for siRNA delivery
圖4 聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯膜上的納米顆粒Fig4 Nanoparticles on the surface of PFPE mold
3.2 實(shí)現(xiàn)siRNA傳輸?shù)念w粒化學(xué)組成
通過(guò)上面對(duì)PRINT技術(shù)流程的了解，不難發(fā)現(xiàn)只要單體混合物各組分能夠互溶即可運(yùn)用PRINT模制高分子顆粒，這意味著PRINT技術(shù)在材料選擇上具有相當(dāng)?shù)亩鄻有?。為了保護(hù)并定向傳輸易分解的siRNA，本實(shí)驗(yàn)選用了PVP制作顆粒。因此，單體混合液的主體是 VP(N-vinyl Pyrrolidone，乙烯吡咯烷酮單體)。VP分子中含有一個(gè)碳碳雙鍵，可以參與光聚合反應(yīng)。而其聚合產(chǎn)物PVP是易溶于水的無(wú)毒高分子，在醫(yī)療材料中有廣泛應(yīng)用。
除VP以外，單體混合液中還含有許多功能成分。正電荷試劑AETMAC(2-acryloxyethyltrimethylammonium)就是其中之一。AETMAC上帶有正電荷，可以有效的吸引帶負(fù)電荷的siRNA從而達(dá)到包裝基因藥物的目的，并使整個(gè)傳輸顆粒荷正電。這樣，顆粒與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互吸引，可以輕易地將siRNA傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部。另一個(gè)重要的功能單體分子是交聯(lián)劑。在實(shí)驗(yàn)中試用了 bis(ethyldisulfide)acrylate(BEDSA)交聯(lián)劑和N，N'-cystaminebisacrylamide交聯(lián)劑。其中BEDSA顯示出最好的siRNA傳輸效果。BEDSA分子中含有的雙硫鍵在細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境作用下可被還原成兩個(gè)巰基，從而降解了PRINT顆粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有助于釋放出siRNA藥物。其它成分有熒光標(biāo)記物Fluorescein-o-acrylate和光聚合引發(fā)劑1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone(HCPK)。以上所述的各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示：
3.3 PVP PRINT納米顆粒的細(xì)胞吸收實(shí)驗(yàn)
用PVP PRINT納米顆粒包裹敏感的siRNA分子實(shí)現(xiàn)藥物傳輸，首先要保證顆?？杀患?xì)胞吸收。由于顆粒成分中包含熒光標(biāo)記 Fluorescein-o-acrylate，可以通過(guò)液式細(xì)胞計(jì)檢查的方法檢測(cè)顆粒的細(xì)胞吸收情況。
圖5顯示的就是含有不同量AETMAC正電荷試劑 PVP PRINT顆粒的細(xì)胞吸收率隨顆粒濃度變化的情況。
圖5 PVP PRINT顆粒吸收率隨顆粒濃度變化的曲線Fig5 The percentage of particles with particles vs.particle concentration
值得注意的是，圖5中縱坐標(biāo)代表的是吸收了PVPPRINT顆粒的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素基因的 HeLa癌癥細(xì)胞。當(dāng)顆粒中所含正電荷試劑量大于9%時(shí)，顆粒細(xì)胞吸收率可達(dá)90%以上。最終選定的正電荷試劑含量為10%。顆粒各組分含量如表1所示。
表1 用于基因傳輸?shù)募{米顆粒組成成分Tab.1 The chemical composition of the nanoparticles for siRNA delivery
3.4 PVP PRINT顆粒的熒光素酶量降低實(shí)驗(yàn)
為了評(píng)價(jià) PVP PRINT顆粒的藥物傳輸效果，對(duì)經(jīng)過(guò)顆粒處理的HeLa癌癥細(xì)胞(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染螢火蟲熒光素酶)進(jìn)行了兩項(xiàng)細(xì)胞檢驗(yàn)：一是熒光素酶量降低檢驗(yàn)，二是細(xì)胞存活率檢驗(yàn)。在熒光素酶量降低檢驗(yàn)中，將被顆粒處理后細(xì)胞的熒光素酶含量與只被營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)處理后細(xì)胞的熒光素酶含量進(jìn)行了比較。同時(shí)，還要檢測(cè)細(xì)胞的存活率以保證熒光素酶量的降低并非來(lái)源于細(xì)胞大量死亡。因此，熒光素酶的降低效率是通過(guò)比較熒光素酶量降低和細(xì)胞存活率得到的，為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中所使用siRNA的有效性，用一種已知有效的脂質(zhì)體傳輸siRNA，作為PVP PRINT納米顆粒的比照組。
首個(gè)成功的PVP納米顆粒表現(xiàn)出約40%的熒光素酶基因抑制量(如圖6)。所用納米顆粒的劑量為20-40g/mL。HeLa細(xì)胞接觸顆粒的時(shí)間為4h。其間，細(xì)胞培養(yǎng)皿被放置在37°C的保溫槽中。具體的實(shí)驗(yàn)步驟是：在96孔細(xì)胞盤的每個(gè)孔中放入約20000個(gè)HeLa細(xì)胞。第二天，將不同劑量的含siRNA PVP PRINT顆粒加入不同的孔中，然后在37°C下培養(yǎng)細(xì)胞。4h后，將還未被細(xì)胞吸收的顆粒移走，加入新鮮的培養(yǎng)液。此時(shí)即可進(jìn)行熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率的測(cè)量。
圖6 熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率圖：實(shí)驗(yàn)組為吸收聚乙烯吡咯烷酮納米顆粒的HeLa細(xì)胞，比照組為吸收脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(已知有效的傳輸系統(tǒng))的HeLa細(xì)胞Fig.6 The graphs of Luciferase expression and cell viability:use HeLa cells taking up PVP PRINT nanoparticles as the experiment group and use HeLa cells taking up Lipofectamine 2000 as the control group
3.5 PVP PRINT顆粒化學(xué)成分的優(yōu)化
圖7中所示的PVP顆粒中含有10%的交聯(lián)劑，所達(dá)到的熒光素酶降低量為40%。為了提高PVP納米顆粒的siRNA傳輸效率，實(shí)驗(yàn)中嘗試提高交聯(lián)劑的含量。圖7展示了含有10%，20%和30%交聯(lián)劑的PVP納米顆粒的熒光素酶降低率。其中含有30%交聯(lián)劑的納米顆粒表現(xiàn)出最高的基因抑制效率，熒光素酶表達(dá)量降低了約65%。
圖7 熒光素酶表達(dá)量及細(xì)胞存活率：傳輸系統(tǒng)為200*200納米聚乙烯吡咯烷酮納米顆粒，三組顆粒中含有交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%，20%，30%Fig.7 The graphs of Luciferase expression and cell viability:use 200*200nm PVP PRINT nanoparticles as the delivery system，the percentages of crosslinker are 10%，20%，30%
4 結(jié)論
主要探討了PRINT納米顆粒這一新型非病毒傳輸系統(tǒng)在siRNA藥物傳輸方面的一些嘗試。從中可見(jiàn)，PRINT技術(shù)用于siRNA藥物傳輸有著巨大的潛力：首先，SEM電鏡照片證實(shí)了我們確實(shí)可以制作出大小、形狀、化學(xué)成分一致的單分散顆粒；其次，熒光素酶表達(dá)量和細(xì)胞存活率兩項(xiàng)檢驗(yàn)證明了PVPPRINT納米顆粒經(jīng)過(guò)成分優(yōu)化可達(dá)到65%的基因抑制效率。本項(xiàng)目未來(lái)的工作將致力于設(shè)計(jì)出針對(duì)于真實(shí)致病基因的PRINT顆粒傳輸系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)的基因抑制。
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