施冰,米林,王娟,崔慶華,郭艷紅,于海弈,高煒

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院干部病房一科,北京 100700;2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)信息學(xué)系;3.北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科)

越來越多的證據(jù)表明,microRNA(miRNA)在很多重要的生命過程中(如細(xì)胞生長、組織分化、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育以及細(xì)胞凋亡等)起著關(guān)鍵作用。急性心肌梗死是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,及時診斷和治療對患者的生活質(zhì)量有重要影響。本研究采用 microarray篩選與急性心肌梗死相關(guān)的 miRNA,用生物信息學(xué)方法分析了 miRNA的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的功能,探討其與急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,以其為闡明早期發(fā)現(xiàn)心肌梗死的生物標(biāo)記物提供新的依據(jù)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 大鼠急性心肌梗死模型的制備 雄性清潔級SD大鼠(180 g),復(fù)合麻醉劑行腹腔注射麻醉,固定于手術(shù)臺上,四肢皮下連接心電圖電極,記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖,胸骨上窩上正中切開皮膚,向下鈍性分離推開下頜下腺,使氣管充分顯露,于第 2～3氣管環(huán)間行氣管橫行切開,插入氣管插管(用套管針自制),連接動物呼吸機(jī)進(jìn)行人工控制呼吸。順肋間隙方向于胸骨左旁第 3～4肋間切開皮膚,逐層分離皮下組織、肌肉,于 3～4肋骨間撐開進(jìn)胸,暴露心臟,在左心耳下緣與肺動脈圓錐間可以看見左冠脈前降支起始部,用 6～0線縫針穿過左冠狀動脈前降支,連同一小束心肌一起結(jié)扎,結(jié)扎后左室壁變蒼白,并出現(xiàn)室壁運(yùn)動減弱。心電監(jiān)護(hù)可見Ⅱ?qū)?lián) ST段明顯抬高,證實(shí)模型制作成功。觀察 10 min后徹底止血,逐層關(guān)胸?；謴?fù)大鼠自主呼吸,撥出氣管內(nèi)插管,縫合氣管切口和頸部切口。假手術(shù)組除縫線不結(jié)扎外,其他制作程序與心肌梗死模型組完全相同。

1.2 RNA提取和芯片檢測

1.2.1 總 RNA抽提 采用液氮研磨法將 100 mg缺血區(qū)心肌組織磨成粉末,加入 1ml Trizol混合,按trizol說明抽提總 RNA。

1.2.2 miRNA芯片檢測 應(yīng)用北京博奧公司 microarraymammalian V3.0芯片檢測(包括 924條探針,針對人、大鼠、小鼠的成熟 miRNA,及預(yù)測的miRNA)。為保證結(jié)果的重復(fù)性和可靠性,每個實(shí)驗(yàn)組用三張芯片進(jìn)行試驗(yàn),每張芯片重復(fù) l次.用Significance Analysis of Microarrays(SAM,version 3.0)軟件挑選差異表達(dá)基因。用 Cluster 3.0對差異表達(dá) miRNA進(jìn)行聚類分析。

1.2.3 應(yīng)用 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的 miRNA 應(yīng)用 stem-loop RT引物進(jìn)行RT反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件:95℃,15 s,60℃,30 s,40個循環(huán);75℃至 95℃繪制溶解曲線,非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴(kuò)增情況。

1.3 m iRNA的靶基因/轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測和功能分析

1.3.1 miRNA靶基因的預(yù)測 目前預(yù)測 miRNA靶基因的常用數(shù)據(jù)庫有:① miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/);②TargetScan(http://targets-can.org/index.htm l/);③PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/new PicTar-vertebrate.cgi);④miRanda(http://m icrorna.org/microrna/home.do)。由于 miRNA與靶 mRNA的互補(bǔ)性不高,在進(jìn)行預(yù)測時僅僅依賴 6～8個堿基之間的互補(bǔ)。因此,預(yù)測結(jié)果可能會有一定的假陽性。為了克服這一不足,我們同時利用上述 4個數(shù)據(jù)庫對同一 miRNA的靶基因進(jìn)行交叉預(yù)測,這樣既提高了預(yù)測的準(zhǔn)確性,也縮減了靶基因的數(shù)量,節(jié)省了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的工作量。

1.3.2 miRNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選 miRNA是一種在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小分子 RNA,其可與轉(zhuǎn)錄因子(TF)組成配偶體,對共同作用的靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié),構(gòu)成基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在 m iRNA-TF共同對靶基因調(diào)節(jié)作用的過程中,TF可以調(diào)節(jié)miRNA,反過來也可受到 miRNA的調(diào)節(jié),形成多樣性的前饋環(huán)路(FFL s)。

我們通過 TransmiR[1]數(shù)據(jù)庫(TransmiR,http://cmbi.bjmu.edu.cn/transmir),篩選了與差異表達(dá)的 miRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

1.3.3 功能富集分析 我們應(yīng)用 EASE[2]對篩選的轉(zhuǎn)錄因子,miRNA的靶基因,m iRNA的宿主基因進(jìn)行了基因功能富集分析,并利用超幾何分布假設(shè)檢驗(yàn)分析了各 miRNA相關(guān) TF的富集度,還對獲得的 P值進(jìn)行了 Bonferroni多重比較校正。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片檢測結(jié)果 與正常心肌組織比較,共篩選出 17個與急性心肌梗死相關(guān)的差異表達(dá)的 miRNA(上調(diào) ＞2倍或下調(diào) ＜0.5倍)。其中表達(dá)上調(diào)的 miRNA為 9個,分別是 m ir-31,miR-214,miR-923,miR-711,m iR-199a-3p,miR-199a-5p,mir-18a,m iR-18b。表達(dá)下調(diào)的 miRNA為 8個,分別是miR-1,miR-126,miR-29b,miR-26b,miR-451,miR-181c,miR-181d,miR-499-5p。

2.2 實(shí)時定量 RT-PCR檢測 隨機(jī)選取 4個 miRNA(miR-31,miR-214,miR-126,miR-499-5p)進(jìn)行實(shí)時定量 RT-PCR驗(yàn)證.擴(kuò)增曲線,融解曲線及 PCR產(chǎn)物電泳顯示該方法具有良好的擴(kuò)增效率及特異性。

2.3 實(shí)時定量 RT-PCR與 miRNA芯片結(jié)果比較參照文獻(xiàn),對芯片數(shù)據(jù)及實(shí)時定量 RT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,以使兩者具有可比性,即從 miRNA芯片得到缺血心肌與正常心肌中不同 miRNA的信號平均值,將缺血心肌的信號值除以健康對照組的信號值,得到比值 Rarray(缺血/正常對照)。定量RT-PCR計(jì)算公式 :Rpcr=EmiR-x△CP(對照-樣本)/Eu6△CP(對照-樣本),U6為內(nèi)參;E表示擴(kuò)增效率;CP(crossing point)表示實(shí)時熒光強(qiáng)度顯著大于背景值時的循環(huán)數(shù)。得到兩組比值 Rarray與 RTPCR,比值大于 1表示上調(diào),比值小于 1表示下調(diào),相對于 U6,miR-31,miR-214的表達(dá)在芯片和實(shí)時定量 RT-PCR均上調(diào);miR-499,miR-126的表達(dá)在芯片和實(shí)時定量 RT-PCR均下調(diào),結(jié)果表明實(shí)時定量RT-PCR與芯片結(jié)果相符。

2.4 m iRNA的靶基因、轉(zhuǎn)錄因子及功能分析 我們發(fā)現(xiàn) 17個差異表達(dá)的 miRNA中的 9個有一個或以上的靶 mRNA,共篩選了 195對 miRNA-靶基因。從 TransmiR識別了 14對試驗(yàn)證明的 TF-miRNA,其中,14個 TF調(diào)節(jié)了 6個 miRNA(表 1)。

表1 試驗(yàn)證明的TF-m iRNA

這些結(jié)果提示缺血心肌中差異表達(dá)的 miRNA趨向于通過和心血管功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因配對而在心血管疾病中發(fā)生作用。

絕大多數(shù) miRNA在基因組上的位置是位于一個編碼基因的內(nèi)含子(intron)里,此類 miRNA叫做內(nèi)含子miRNA(intronicmiRNA)。有報道表明內(nèi)含子miRNA往往和宿主基因共表達(dá)[3-4],則內(nèi)含子 miRNA和其宿主基因就有比較高的概率功能相關(guān)。因此可以通過了解其宿主基因的功能以及所參與的疾病預(yù)測該 miRNA可能的功能以及可能參與的疾病。

我們分析了 17個差異表達(dá)的 miRNA的宿主基因的功能,發(fā)現(xiàn)其中 7個 miRNA坐落在蛋白編碼基因的內(nèi)含子(表 2)。宿主基因的功能富集分析沒有發(fā)現(xiàn)富集的功能,可能是由于樣本量太小的原因(僅分析 7個宿主基因)。其次,我們分析了宿主基因的功能,發(fā)現(xiàn) 6個 miRNA的宿主基因的功能與心血管疾病相關(guān)。microRNA的這些特性進(jìn)一步說明miRNA可能成為急性心肌梗死的生物學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

表2 內(nèi)含子m iRNA及其宿主基因的功能

3 討論

miRNA的表達(dá)具有組織特異性和時序性。對于差異表達(dá)的 miRNA的組織特異性分析,我們發(fā)現(xiàn)平素在心肌組織中特異性高表達(dá)的 miR-1和 miR-499-5p在缺血心肌中表達(dá)顯著下調(diào)。而非心肌組織特異性表達(dá)的 miR-31和 miR-214在心肌梗死后缺血心肌中表達(dá)上調(diào)。提示心肌組織特異性 miRNA可能成為心肌梗死的新的生物標(biāo)記物。

對 miRNA的轉(zhuǎn)錄因子靶基因及其宿主基因的功能分析發(fā)現(xiàn),缺血心肌中差異表達(dá)的 miRNA趨向于通過和心血管功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因配對而在心血管疾病中發(fā)生作用。這些結(jié)果進(jìn)一步提示miRNA可能成為心肌梗死的新的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

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