高曦,李倩,張海兵,李登宇,孫忠人

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

夾脊電針治療神經(jīng)根型頸椎病有著可靠地臨床鎮(zhèn)痛療效,且無明顯不良反應(yīng)。但我們發(fā)現(xiàn)對夾脊電針治療神經(jīng)根型頸椎病根性痛的機制尚不明確,給治療方法的臨床推廣帶來了諸多的困難。

本實驗旨在探討夾脊電針對頸神經(jīng)根炎的頸椎病模型大鼠的丘腦痛感區(qū) FOS蛋白及脊髓背角COX-2蛋白含量表達的影響,為從分子生物學(xué)角度,明確夾脊電針針刺效應(yīng)與中樞鎮(zhèn)痛的關(guān)系,揭示夾脊電針治療神經(jīng)根型頸椎病的鎮(zhèn)痛機制,為夾脊電針臨床治療神經(jīng)根型頸椎病提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 取成年 Wistar大鼠 40只,體質(zhì)量(300±20)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。主要儀器試劑:腦立體定向儀(江灣 I型),德國萊卡 2135型切片機,美國 Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng),上海一恒電熱恒溫箱,醫(yī)用微波爐,KWD-808I全能脈沖電療儀,免疫組織化學(xué) FOS抗體、COX-2一抗抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與治療 將 40只大鼠隨機分為健康對照組、模型對照組、手針對照組和電針治療組,每組10只。健康對照組:正常飼養(yǎng),不做任何處置。模型對照組:于造模后第 3天開始,每日抓取 1次,不做針刺處置。手針對照組:于造模后第 3天開始手針治療。電針治療組:于造模后第 3天開始電針治療。根據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的動物針灸穴位圖譜[1],取雙側(cè) C6、C7“夾脊”(位于大鼠頸椎棘突間旁開約0.5 cm處),常規(guī)消毒穴區(qū)皮膚,選用華佗牌 28號 0.5寸不銹鋼毫針,直刺進針,進針深度 0.3～0.6 cm,輕捻轉(zhuǎn)提插后,針柄接 KWD-808I全能脈沖電療儀,夾脊穴正負極左右交替聯(lián)。密波型,頻率 75Hz,電流強度以大鼠頸肌及前肢輕度抖動為度。1次/d,每次 15 min。連續(xù)治療 3周后處死。

1.2.2 動物模型的制作 各組大鼠在 10%水合氯醛 380mg/kg腹腔注射麻醉后,俯臥位固定于操作臺上,頸前部墊小棉墊,以利頸椎后突,便于操作,以第七頸椎作為骨性標(biāo)志,作頸部后正中切口,逐層切開皮膚、皮下組織、頸部筋膜,用骨刀緊貼棘突,鈍性剝離左側(cè)頸部肌肉達椎板,確認 C6-C7椎間隙,用止血鉗咬除左側(cè) C6、C7部分椎板,顯露出 C7神經(jīng)根,將浸有甲醛的定量濾紙片放在 C7神經(jīng)根肩上,逐層縫合,關(guān)閉切口。所有操作均在無菌條件下進行,術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素 1萬 u,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 指標(biāo)觀察及檢測

1.2.3.1 丘腦痛感受區(qū) FOS蛋白表達的檢測 取材:在麻醉下剖開胸腔,經(jīng)左心室插管至升主動脈。先快速灌注。0.9%氯化鈉溶液 100～150 ml,繼之灌注含 4%多聚甲醛的 0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)300～350 m l。立即斷頭,在腦立體定向儀(江灣 I型)上固定,參照大鼠腦立體定位圖譜[2],在丘腦范圍內(nèi)(AP1.0～3.0)定位取腦組織塊,置于上述灌流液中固定 1 h,移至 20%蔗糖溶液中過夜(4℃)。以約在 AP2.2～2.3范圍內(nèi)以韁核腳間束為標(biāo)志冰凍切片(40μm),每塊切 6～10片。

免疫組織化學(xué)法檢測 FOS蛋白表達:組織切片收集于 0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS,pH7.4)內(nèi) 30 min,浸入含 0.2%TritonX-100的 PBS內(nèi)30min,FOS抗體用血清稀釋液(1%牛血清白蛋白;0.2%TritonX-100,0.08%疊氮鈉)稀釋成 1∶500,40℃孵育 48 h,陰性對照片以正常血清代之;加二抗(Vector Lab,1∶200稀釋),室溫下反應(yīng) 2 h;加 ABC(Vector Lab,1∶100稀釋),室溫下反應(yīng) 1 h,DAB顯色液顯色 15～20min。各步驟之間均以0.01mol/L PBS液沖洗 3次。顯色后貼片涼干,系列乙醇脫水,二甲苯透明,封片,光鏡下觀察。每只動物隨機取 5張組織切片,在 Leica Qwin圖像分析儀上,分別計數(shù)丘腦左右韁核腳間束外側(cè)束旁核區(qū)域 FOS免疫陽性細胞數(shù)。

1.2.3.2 脊髓背角 COX-2蛋白表達的檢測 取材:將大鼠用 8%的水合氯醛 1m l麻醉,左心室插管灌注固定,先以 250 ml 0.9%氯化鈉注射溶液快速灌沖,繼之灌入 250ml含 4%多聚甲醛的 0.1 M磷酸鹽緩沖液(PBS)。灌注完畢后,剝離鼠脊髓頸膨大,置于上述固定液 4℃過夜,隨后分別浸泡在含10%,20%,30%蔗糖的 0.1MPBS中,4℃放置。在Reichert-Jung半導(dǎo)體致冷的切片機(德國)上制備30μm厚冰凍冠狀切片。

免疫組織化學(xué)法檢測 COX-2蛋白表達:切片收集于含 30%蔗糖、30%乙二醇的 0.05M PBS中,置-20℃保存。免疫組織化學(xué) COX-2一抗抗體(Santa Cruz公司)稀釋度為 1∶400,染色步驟按華美ABC免疫組織化學(xué)檢測即用型試劑盒使用說明進行,用 PBS代替一抗作為陰性對照。觀察脊髓背角COX-2樣免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)的變化,經(jīng) DAB顯色,陽性細胞呈紅棕色。以脊髓背角的 RexedⅡ?qū)幼鳛橹饕^察部位,在 Leica Qwin圖像分析儀上計數(shù)免疫陽性細胞數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩組間比較用 t檢驗,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

各組大鼠光密度測定結(jié)果比較見表 1。

表1 各組大鼠光密度測定結(jié)果比較(±s)

表1 各組大鼠光密度測定結(jié)果比較(±s)

注:與健康對照組比較,a P＜0.01;與模型對照組比較,b P＜0.05,c P＜0.01;與手針對照組比較d P＜0.05

組別 鼠數(shù)(只) FOS蛋白 COX-2蛋白健康對照組 10 0.1484±0.0231 0.1637±0.0233模型對照組 10 0.2239±0.0419a 0.2501±0.0379a手針對照組 10 0.1852±0.0304ab 0.2182±0.0353a電針治療組 10 0.1581±0.0261cd 0.1859±0.0254cd

3 討論

3.1 選穴依據(jù) 中醫(yī)認為夾脊穴位于督脈與足太陽膀胱經(jīng)之間,夾督脈伴太陽經(jīng)而行,其定位、循行,以及作用功能與督脈和膀胱經(jīng)的循行密切相關(guān)。其中,督脈能“總督諸陽”,為“陽脈之?！?督脈行于脊里,入絡(luò)于腦。足太陽膀胱經(jīng)在背部的循行路線上分布著臟腑的背俞穴。通過各種方法刺激夾脊穴可以暢通督脈及太陽經(jīng)氣而調(diào)和陰陽,為夾脊穴治療脊柱相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)[3-4]。

3.2 夾脊電針治療對神經(jīng)根型頸椎病大鼠丘腦痛感區(qū) FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白含量的影響

現(xiàn)代研究表明,FOS蛋白是 c-fos基因的表達產(chǎn)物,正常生理情況下 c-fos基因在多種細胞中均有低水平的表達,參與細胞的生長、分化、信息傳遞等生理功能。其特征為當(dāng)神經(jīng)元受到某種刺激時,神經(jīng)元胞核內(nèi)的 c-fos基因可產(chǎn)生迅速表達,轉(zhuǎn)錄形成mRNA,進入胞漿翻譯合成分子量為 55kd的核磷蛋白,即 FOS蛋白,并且在丘腦痛感區(qū)表達顯著。因此,廣泛用于痛覺定位和神經(jīng)科學(xué)中樞通路研究[5]。

脊髓 COX-2蛋白在炎癥痛的中樞敏化中起至關(guān)重要的作用。COX-2蛋白在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中都有分布,外周炎癥時脊髓 COX-2的表達增加,并與神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中的興奮性氨基酸及其受體、P物質(zhì)等形成中樞敏化的正反饋環(huán)路[6]。

本研究觀察了大鼠丘腦痛感區(qū) FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白含量的表達,發(fā)現(xiàn)頸神經(jīng)根炎大鼠,FOS蛋白、COX-2蛋白含量較健康對照組的表達明顯升高,這與以往的研究相符合。夾脊電針治療能降低神經(jīng)根型頸椎病大鼠丘腦痛感區(qū) FOS蛋白及脊髓背角 COX-2蛋白的表達,對神經(jīng)根組織具有保護作用。

[1] 華興邦.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991,(1):1-5.

[2] 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:57-64.

[3] 安光輝,趙毅,孫鵬.夾脊穴治療頸椎病的理論與應(yīng)用[J].中國臨床康復(fù),2006,10(31):130.

[4] 李金虎.活血止痛膠囊結(jié)合推拿治療神經(jīng)根型頸椎病32例療效觀察[J].中國臨床保健雜志,2008,11(4):408-409.

[5] 方向義,胡海濤.中樞神經(jīng)系統(tǒng)fos蛋白的表達與外周傷害性刺激[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,1996,12(3):281-283.

[6] 方劍喬.環(huán)氧合酶-2在炎癥疼痛中的表達及電針干預(yù)的可能性[J].浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2002,26(2):51.