液相色譜-質譜法在非法添加化學藥物檢測中的應用

北京市海淀區(qū)藥品檢驗所(100083） 饒金華

北京市垂楊柳醫(yī)院（100022）陸紅柳

北京市海淀區(qū)藥品檢驗所(100083）李東輝 王永欣

非法添加化學藥指在中成藥中添加與此中成藥療效相似或者一致的西藥成分，以提高療效、增加銷量的一種不法行為。檢測中成藥中是否非法添加化學藥的工作至關重要。中藥制劑通常含有多種中藥材，每種藥材的成分又復雜多樣，鑒別檢查此類復雜化學環(huán)境中非法添加的化學成分，選擇專屬性高的分析手段尤為關鍵，液相色譜-質譜法（LS-MS）由于具有高度專屬性，成為國內外研究普遍采用的方法?，F將有關研究近況綜述如下：

1 液相色譜-質譜法原理及應用

HPLC-MS 是當前鑒別檢查中藥制劑中摻入化學藥物的有效分析方法之一。由于其分析不需要實現待測物質與干擾組分的完全色譜分離,可以通過對質荷比的篩選得到單一組分的色譜圖，同時還可以通過二級質譜分析對結構做進一步確證。更重要的是,常規(guī)的HPLC分析時，如果手頭沒有相應的對照品，實驗就很難開展，但HPLC-MS 可從得到的質譜信息中篩選出供試品中各組分的準分子離子峰質荷比，從而推斷其分子量，將得到的分子量信息與相關文獻資料比較,從中可以發(fā)現有價值的信息。事實上,質譜相當于一種特殊的HPLC檢測器。色譜質譜的在線聯用將色譜的分離能力與質譜的定性功能結合起來，實現對復雜混合物更準確的定量和定性分析，而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。

2002年，美國質譜協會統(tǒng)計了藥物色譜分析各種不同方法所占的比例。1990年，HPLC高達85%，而2000年下降到15%，相反，LC-MS所占的份額從3%提高到大約80%。我國目前在這方面相當于美國九十年代的水平，液相色譜-質譜技術在我國有著廣泛的發(fā)展空間。

2 具體應用

2.1 止咳平喘類制劑的檢查 劉起中等采用XTerra C18柱(5μm,2.1 mm ×150 mm)，以甲醇-10mmol/L醋酸胺溶液為流動相，以梯度洗脫程序進行洗脫。通過與對照品的液相色譜保留時間、相對分子質量、二級質譜信息比較，對治療哮喘中藥制劑中非法摻入的化學藥物進行鑒別，分別檢測到沙丁胺醇、茶堿、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松四種化學藥物。夏瑞、車寶泉、張喆等建立了鑒別中藥制劑中可能添加的糖皮質激素的液相色譜-質譜分析方法。針對不同的中藥劑型，采用不同的試樣處理方式。提取后的樣品溶液采用Diamond C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分離，以流動相A （水-四氫呋喃,體積比為100∶1）和B （乙腈-水-四氫呋喃，體積比為80∶20∶1）進行梯度洗脫。通過與對照品保留時間、一級質譜及二級質譜圖的對比進行定性。應用該法鑒定了中藥制劑中的糖皮質激素，在供試品溶液中檢出了醋酸潑尼松等15種糖皮質激素。張西如、姜建國、張素萍等采用液相色譜-質譜聯用法。選用VenusilMP C18柱，以0.01mol·L-1醋酸銨（含0.1%醋酸） -乙腈（60∶40）為流動相，對非法添加醋酸潑尼松的復方川羚定喘膠囊制劑的提取液進行液相色譜-質譜聯用分析。通過與對照品的色譜、紫外及質譜行為相比較，對此類非法添加醋酸潑尼松的藥物進行定量測定和定性鑒別。結果在這些制劑中均檢出醋酸潑尼松，且回收率為98.62% （n=6）。

2.2 降糖類制劑的檢查 董宇、孔璋、鐘大放等采用液相色譜-離子阱質譜聯用法。選用Diamonsil C18柱，以乙腈-水-甲酸（V ∶V ∶V=60.0∶40.0∶0.1）為流動相，對中藥降糖制劑的提取液進行液相色譜-離子阱質譜分析。通過與對照品的色譜及質譜行為相比較，對中藥降糖制劑中非法摻入的合成降糖藥進行定性鑒別。結果在4種受試中藥降糖制劑中，2種被檢測到同時摻有苯乙雙胍和格列本脲，1 種被檢測到摻有格列本脲。鄭成、向智敏等以Altima C18色譜柱為固定相，以乙腈-0.1%甲酸溶液（65：35）為流動相，用液相色譜-質譜-質譜法進行定性分析鑒定。

結果顯示，在一批降糖膠囊中檢測到非法摻入的化學藥格列本脲和苯乙雙胍。程顯隆、劉卉等以Agilent C18柱(5μm,250 mm ×4.6 mm)分離，以甲醇-0.1%甲酸水溶液（30∶70）為流動相，流速為1.0ml/min）分流比為4：1。采用電噴霧離子化正離子檢測模式（ESI＋），m/z范圍為100-800amu，毛細管電壓為＋3.2kV，脫溶劑氣（N2）為350L/h，錐孔反吹氣為50L/h，錐孔電壓為45V，脫溶劑溫度為150℃，源溫度為105℃，檢測方式為全掃描質譜。根據液相色譜保留時間、相對分子質量及源內CID（碰撞誘導裂解）碎片離子等信息，對中藥降糖制劑及膠囊殼的提取液進行液相色譜-質譜分析，在市售某中藥降糖制劑中檢測到羅格列酮。吳美香、李煥德采用HPLC-MS 法，質譜條件：采用電噴霧電離正離子源(ESI +)，毛細管噴口電離電壓3kV，孔電壓45 V，離子源溫度105℃，去溶劑氣溫260℃，去溶劑氣流速420L/h。采用選擇離子監(jiān)測（SIR）模式進行定性分析。色譜柱:Thermo TM C8（250 mm ×4.6mm，5μm），柱溫40℃，檢測波長230 nm，流動相梯度洗脫程序：乙腈-30 mmoL/L 醋酸銨溶液(5∶95～30∶70,0～20 min)，(30∶70～65∶35，20～40min)，（65∶35～5∶95,40～45 min），（5∶95，45～50 min）,流速1.0 ml/min，進樣量20μl。

結果顯示，本實驗建立的條件能夠把中藥制劑中添加的磺酰脲類（格列本脲、格列齊特、格列吡嗪、格列喹酮） 和4 種硝基咪唑類藥物（甲硝唑、替硝唑、奧硝唑、塞克硝唑) 同時完全分離開來。對8種制劑建立的檢測技術進行了分析，經與相應的標準物質比較，得到有2種中成藥中非法摻有降糖化學藥品格列本脲：有2 種中成藥制劑同時非法摻入了降糖化學藥品格列本脲和格列齊特。

2.3 抗風濕類制劑的檢查 劉福艷、謝元超等采用Agilent C18柱(5μm,150 mm ×4.6 mm)分離，以0.02mol/L醋酸胺-1%醋酸溶液-甲醇（32：3：65）為流動相，流速為0.4ml/min，柱溫30℃。采用電噴霧離子化負離子檢測模式（ESI－），m/z范圍為100-400amu，干燥器溫度350℃；干燥氣流速10L/min；干燥氣壓力為276kPa；源電壓為5kV。通過液相色譜保留時間、一級及二級質譜碎片等信息，對抗風濕類中藥的提取液中非法摻入的萘普生、吲哚美辛進行定性鑒別，在6批抗風濕類中藥中3批檢出萘普生，其中2批同時檢出吲哚美辛。

2.4 降壓類制劑的檢查 高青、張喆、車寶泉等采用Waters Sunfire C18色譜柱，梯度洗脫：流動相A為20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇-乙腈（2∶1）,檢測波長為230nm,流速為1 ml·min-1（分流比為4∶1）。選擇正負離子全掃描方式檢測臨床常用的15種降壓藥，利用質譜解析軟件研究了上述化合物的質譜裂解規(guī)律。通過比較樣品峰與對照品峰的一級質譜、二級質譜質荷比，確定樣品中是否摻雜了化學藥物。結果在上述色譜及質譜條件下，15種降壓藥物HPLC圖譜分離度良好，質譜分辨率符合鑒別要求。HPLC-MS/MS方法測定上述化學物質的最小檢出量為1～80ng。

2.5 減肥類制劑的檢查 車寶泉、張喆、黃曉君采用UtimatesXB-C18色譜柱，梯度洗脫：流動相A為含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇，流速為1 ml·min-1。選擇正負離子全掃描方式檢測臨床常用的10種減肥藥，利用質譜解析軟件研究了上述化合物的質譜裂解規(guī)律，通過比較樣品峰與對照品峰的一級質譜、二級質譜質荷比,確定樣品中是否摻雜了化學藥物。結果檢出西布曲明、芬氟拉明、酚酞。樣品各色譜峰間分離度良好，質譜分辨率符合要求,最小檢出量為2～100ng。王珂等采用Agilent C18柱(5μm,150mm ×2.1mm)分離，分別以不同比例的0.5%甲酸溶液-乙腈或0.5%甲酸溶液-甲醇進行梯度洗脫：流動相A為含0.1%醋酸的20 mmol/L 醋酸銨溶液，流動相B為甲醇，流速為1ml·min-1。質譜條件：離子源ESI，霧化氣壓力2.07×105Pa，干燥器溫度350℃；干燥氣流速8L/min，自動掃描方式。結果在1000批供試品中分別檢測到西布曲明、芬氟拉明、咖啡因、番瀉苷、酚酞等。

2.6 蘇丹紅系列染料的檢查 馮家力、王一紅、丁力等建立了蘇丹紅系列染料（蘇丹I、蘇丹II、蘇丹III、蘇丹IV） 靈敏、專一的液相色譜-質譜檢測方法。將樣品用乙腈提取過濾后，無需其他處理，直接用95 %乙腈+5 %水（含0.1 %甲酸） 為流動相進行反相液相色譜分離，用電噴霧正離子源進行離子化，選擇反應監(jiān)測方式（SRM）對這4種物質各自的母離子（m/ z249、277、353、381） 及其4對子離子（m/ z232和93、121 和106、197和92、225 和106)進行監(jiān)測,三級四極質譜測定;用全掃描方式對每種物質進行了結構解析。

結果表明，樣品處理極其簡單，7min內完成分離，方法抗干擾能力強，回收率98 %～103 %，檢出限0.02～0.04μg/ L，RSD0.8 %～1.6 %，相關系數0.9993～0.9998；同時首次發(fā)現食品中添加有與蘇丹III 和IV結構極其近似的同分異構體存在，且其同分異構體也為紅色物質。

3 總結

針對不法藥品生產廠家在中成藥中非法添加化學物質的現狀，各藥檢部門一般采用化學方法、薄層色譜、液相色譜等進行初篩，而后用液質聯用等手段進行確證定量，建立了一系列分析方法。HPLC-MS方法已經成為了“非法添加化學藥”定量檢測的首選方法,為打擊藥品制假和保障用藥安全提供了有力的技術支持。