賈 剛 王康寧 鄧秋紅

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,雅安 625014）

胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like pep tide-2, GLP-2）對大鼠、小鼠、胎豬、新生仔豬等動物的腸營養(yǎng)效應(yīng)（intestinotrophic）主要體現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞保護(hù)等方面而維持細(xì)胞發(fā)育、適應(yīng)的穩(wěn)態(tài),它可以通過多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實現(xiàn)對細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控,并且各信號途徑之間也進(jìn)行著有機(jī)地整合。本文將對GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的效果及其分子機(jī)制作一綜述。

1 GLP-2的基本性質(zhì)

GLP-2是腦下垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽/胰高血糖素超家族成員之一,含33個氨基酸殘基,分子量約為3 900 u,其氨基酸序列在哺乳動物上具有高度的同源性和保守性,丙氨酸位于氨基末端第2位,這使它易被肽末端降解酶水解。GLP-2主要在胃腸道中特異性表達(dá)并分泌,被二肽基肽酶-Ⅳ降解,由腎臟清除,半衰期為7 min,它通過與GLP-2受體（GLP-2 recep tor,GLP-2R）特異性結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。

2 GLP-2的主要生物學(xué)作用——腸營養(yǎng)效應(yīng)

GLP-2具有腸營養(yǎng)效應(yīng)和調(diào)節(jié)胃酸分泌、胃排空和攝食、骨代謝等生物學(xué)功能,其中,腸營養(yǎng)效應(yīng)是GLP-2的主要功能。GLP-2的腸營養(yǎng)效應(yīng)主要體現(xiàn)在通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞保護(hù)等作用而維持腸細(xì)胞發(fā)育、適應(yīng)的穩(wěn)態(tài)。

2.1 GLP-2腸營養(yǎng)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)

Gleeson等[1]發(fā)現(xiàn)高血糖素瘤病人有很高的腸高血糖素并促進(jìn)了腸道增生,Bloom[2]研究表明腸高血糖素的腸營養(yǎng)效應(yīng)可能歸因于GLP-2。Drucker等[3]將胰高血糖素原提取物注入大鼠體內(nèi)導(dǎo)致了腸黏膜增生,對提取物的分離發(fā)現(xiàn)GLP-2是促進(jìn)腸黏膜增生的主要因子。Drucker等[4]、Sigalet等[5]在大鼠、小鼠上的研究表明GLP-2可以提高腸道DNA、蛋白質(zhì)含量,從而使腸絨毛高度、腸重增加,進(jìn)而證實了GLP-2的腸營養(yǎng)效應(yīng)。

2.2 GLP-2腸營養(yǎng)效應(yīng)的體現(xiàn)——促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡

GLP-2的腸營養(yǎng)效應(yīng)主要體現(xiàn)在:增加腸道組織的重量和腸黏膜的厚度;增加絨毛的高度和隱窩的深度,調(diào)節(jié)絨毛高度/隱窩深度比值;刺激腸細(xì)胞的增殖、存活;細(xì)胞保護(hù)功能及抑制細(xì)胞凋亡等。其中后2點尤為重要。表1列出了部分GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的依據(jù)。

表1 G LP-2對腸道細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Ef fec ts of GLP-2 on intestinal cell proliferation and apoptosis

3 GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

3.1 細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基本通路

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要研究細(xì)胞感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境刺激的分子途徑及其在生物個體發(fā)育過程中細(xì)胞調(diào)節(jié)基因表達(dá)和代謝反應(yīng)的機(jī)理,其主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如下:G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞表面受體的酶活性及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和胞質(zhì)受體或細(xì)胞核受體途徑等。

3.2 GLP-2的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究進(jìn)展

目前對GLP-2調(diào)節(jié)腸道細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)理的研究主要集中在3個方面:GLP-2R特性、GLP-2與GLP-2R結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、不同信號途徑之間的整合。

3.2.1 GLP-2受體的基本性質(zhì)

GLP-2R是由550個氨基酸組成的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一,它主要表達(dá)于胃腸道與腦中。在胃腸道,GLP-2R主要在回腸和結(jié)腸表達(dá),分布于小腸內(nèi)分泌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞或上皮下成肌纖維細(xì)胞、腸神經(jīng)元細(xì)胞上。Estall等[13]的研究發(fā)現(xiàn): GLP-2R有7個跨膜區(qū)域;纈氨酸-64（Val-64）和蘇氨酸-65（Thr-65）之間的信號肽切割位點、氨基末端N-糖基化位點、氨基末端的6個半胱氨酸殘基是GLP-2R的保守特征;大鼠GLP-2R的蛋氨酸-1（M et-1）和蛋氨酸-42（M et-42）位于氨基末端跨膜區(qū)域,可能是GLP-2的識別位點;C端的444～553氨基酸殘基可能起調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)整合信號及受體內(nèi)在化的作用。因此,GLP-2R僅能特異性地與GLP-2相結(jié)合,而對其他相關(guān)胰高血糖素原衍生肽（PGDPs）無反應(yīng)。

3.2.1.1 GLP-2結(jié)合GLP-2R后對cAMP蓄積的影響

Munroe等[14]用1 nmol/L的GLP-2處理轉(zhuǎn)染了GLP-2R的COS細(xì)胞,cAMP的水平比對照組上升了4倍,大約相當(dāng)于10μm ol/L福斯高林的反應(yīng)（圖1）。用10 nmol/L的胰高血糖素樣肽-1 （GLP-1）、胰高血糖素、抑胃肽（GIP）、exendin-3和其他7種B族G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的配體也不能引起轉(zhuǎn)染了p587-70（表達(dá)GLP-2R的片段）的細(xì)胞cAMP蓄積。在大鼠G2R細(xì)胞中cAMP對GLP-2響應(yīng)的半數(shù)有效濃度為0.58 nmo l/L（圖2）。W alsh等[6]也發(fā)現(xiàn)除GLP-2外其他胰高血糖素超家族成員也不能引起表達(dá)GLP-2R的大鼠腸黏膜細(xì)胞中cAMP水平的變化,GLP-2誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生在10-11mo l/L時達(dá)到最高,之后在更高劑量時cAMP的蓄積減少。Walsh等[6]在表達(dá)GLP-2R的大鼠腸黏膜細(xì)胞上研究發(fā)現(xiàn):GLP-2R的激活使GLP-2劑量依賴地激活cAMP,生理學(xué)劑量（10-11mol/L）的GLP-2以PKA依賴的方式刺激cAMP的產(chǎn)生和3H-脫氧胸腺嘧啶苷的整合,即刺激了小腸黏膜細(xì)胞增殖。

圖1 cAMP對B族GPCR配體的肽類類似物的響應(yīng)Fig.1 The cAMP response to peptide analogs o f fam ily BGPCR ligands[14]

3.2.1.2 GLP-2R的脫敏（desensitization）及復(fù)敏（resensitization）

Walsh等[6]發(fā)現(xiàn)先用GLP-2預(yù)處理后再次接觸GLP-2,將會出現(xiàn)GLP-2R的脫敏現(xiàn)象,表現(xiàn)為10-9m ol/L的GLP-2處理細(xì)胞可引起cAM P的相應(yīng)變化,而若在先用10-6m ol/L的GLP-2預(yù)處理細(xì)胞后的短期內(nèi),再用GLP-2處理則不能引起cAMP的濃度變化。Estall等[13]使用hGLP-2預(yù)處理表達(dá)GLP-2R的幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK∶GLP-2R）和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系（DLD-1∶GLP-2R）后,發(fā)現(xiàn)若再接受GLP-2處理,細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度隨預(yù)處理時間-劑量依賴性地下降;用FLAG標(biāo)記GLP-2R的試驗顯示GLP-2R快速地、劑量-時間依賴地發(fā)生內(nèi)陷并從細(xì)胞表面消失,而之后內(nèi)陷的受體又出現(xiàn)在細(xì)胞表面,cAM P的最大濃度也逐漸恢復(fù),表明GLP-2R存在脫敏和復(fù)敏現(xiàn)象。這提示我們, GLP-2調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡的效應(yīng)應(yīng)該具有劑量-時間依賴性。

圖2 GLP-2引起cAMP蓄積的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig.2 Concentration-response curve for cAMP accumulation in response to GLP-2[14]

3.2.2 GLP-2結(jié)合GLP-2R后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

GLP-2能夠直接作用于分布有GLP-2R的腸上皮細(xì)胞或作用于上皮下成肌纖維細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞,并通過它們釋放其他生長因子或神經(jīng)遞質(zhì)間接地實現(xiàn)細(xì)胞調(diào)節(jié)作用（圖3）。

3.2.2.1 G蛋白介導(dǎo)的cAMP/PKA（PKB）途徑

Yusta等[16]在BHK∶GLP-2R的研究結(jié)果顯示,GLP-2能激活cAMP效應(yīng)元件（CRE）-β-半乳糖苷酶和活化蛋白-1（AP-1）熒光素酶,顯著提高PKA和AP-1依賴式報告基因表達(dá),并誘導(dǎo)即早基因IE表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖,即GLP-2影響AP-1的表達(dá)主要由cAMP/PKA介導(dǎo);但AP-1的活性并不會被PKA的抑制劑H89和負(fù)抑制子M tR（AB）完全抑制,這些結(jié)果表明在BHK∶GLP-2R細(xì)胞中GLP-2不止激活PKA和AP-1旁路,還存在不依賴PKA的一條或多條未確認(rèn)的旁路與GLP-2誘導(dǎo)的即早基因的表達(dá)和促有絲分裂的激活相偶聯(lián);同時,該試驗測定了Ca2+水平的變化,發(fā)現(xiàn)GLP-2不能引起細(xì)胞Ca2+的改變,表明GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖可能與磷脂酶C（PLC）/Ca2+途徑無關(guān)。W alsh等[6]在體外利用表達(dá)GLP-2R的大鼠腸黏膜細(xì)胞培養(yǎng)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP-2R的激活使GLP-2劑量依賴地激活cAMP,生理學(xué)劑量的（10-11mol/L） GLP-2以PKA依賴的方式刺激cAMP的產(chǎn)生和3H-脫氧胸腺嘧啶苷的整合,即刺激了黏膜細(xì)胞增殖,與Y usta等[16]的結(jié)果相類似,研究還發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的GLP-2R不與Ca2+途徑相偶聯(lián),最重要的是,在體外培養(yǎng)細(xì)胞中也不與p44/p42促分裂原活化蛋白激酶（p44/p42MAPK）途徑相偶聯(lián)。以上研究結(jié)果表明GLP-2主要是與G蛋白偶聯(lián)受體GLP-2R相結(jié)合,刺激cAMP的產(chǎn)生,激活PKA的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育。

圖3 腸道L細(xì)胞受養(yǎng)分刺激后釋放的GLP-2通過旁分泌或自分泌的方式作用于表達(dá)GLP-2R的鄰近細(xì)胞Fig.3 Upon release of GLP-2 from the intestinal L cells after nutrient ingestion,the pep tide hormone is believed to act in a paracrine or endocrinemanner on neighboring cells expressing the GLP-2 receptor[15]

GLP-2/GLP-2R信號參與經(jīng)典的G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),它通過偶聯(lián)Gαs激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）,從而增加cAM P和PKA蓄積,最終激活轉(zhuǎn)錄因子ELK-1、引起c-fos、c-jun基因的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖;然而,將細(xì)胞用百日咳毒素（Gαi抑制劑）預(yù)處理后,作為細(xì)胞增殖標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶苷的整合率受到顯著抑制,細(xì)胞增殖降低與cAMP蓄積的減少之間存在顯著相關(guān)關(guān)系[17]。許多研究都表明高劑量的GLP-2才有利于細(xì)胞增殖,但Estall等[13]研究表明高劑量的GLP-2會使GLP-2R脫敏,使得cAM P的蓄積降低,這提示我們GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖需要cAMP的濃度在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)。同時,cAMP/PKA細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑雖然是GLP-2引起細(xì)胞增殖的主要途徑,但應(yīng)該還存在其他旁路作為補充。

另外,cAMP/PKA信號可能還參與了GLP-2抑制細(xì)胞凋亡的作用。Yusta等[18]在體外以BHK∶GLP-2R為模型發(fā)現(xiàn),放線菌酮可抑制細(xì)胞的生存力,使DNA分解、細(xì)胞凋亡增加,而用GLP-2與福斯高林處理則可使這些參數(shù)都得到改善,降低caspase-3的活性,減少細(xì)胞色素C（CytC）從線粒體中釋放,降低多聚聚合酶被剪切的量,使細(xì)胞核DNA完整性增加。隨后,Y usta等[19]在BHK∶GLP-2R中的研究顯示,GLP-2的抗凋亡作用不需要磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）下游Ak t、p90Rsk、p70S6等激酶的參與,因為在它們不存在的情況下,LY 94002處理后GLP-2也能減少caspase活性及Cyt C的釋放;GLP-2抑制凋亡是通過PKA依賴式旁路調(diào)節(jié)磷酸化促凋亡分子（Bad）表達(dá),并磷酸化糖原合成激酶（GSK）-3α的21位的絲氨酸（Ser）和GSK-3β的Ser9抑制GSK-3的活性實現(xiàn)的（圖4）。與Yusta等[18]的研究相同的是,福斯高林能模擬GLP-2抑制LY 294002引起的細(xì)胞凋亡,提示cAMP的蓄積對于GLP-2抑制細(xì)胞凋亡作用的實現(xiàn)是必需的,GLP-2抑制細(xì)胞凋亡的途徑可能經(jīng)由cAMP/PKA/CytC/caspase-3介導(dǎo)。

圖4 GLP-2以依賴PKA的方式通過Bad和GSK-3調(diào)節(jié)LY294002相關(guān)的細(xì)胞存活Fig.4 GLP-2 regu lates LY 294002-associated cell survival in a PKA-dependentmanner via Bad and GSK-3[19]

Dube′等[20]研究表明,腸黏膜中Akt的激活參與了GLP-2的抗凋亡效應(yīng)。Koehler等[21]在Hela細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn),GLP-2通過Gαs/cAMP激活PKA信號途徑,抑制PARP的分解,促進(jìn)GSK-3β的磷酸化,這與Yusta等[19]在BHK∶GLP-2R中的結(jié)果一致,使用細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK 1/2）的抑制劑PD98059不能影響GLP-2抑制細(xì)胞凋亡的效果,表明GLP-2抗凋亡作用可能不依賴ERK 1/2信號途徑。

Burrin等[8]報道GLP-2在新生仔豬腸上皮中激活A(yù)kt后伴隨著細(xì)胞凋亡信號的減少,Dube′等[22]在小鼠的研究結(jié)果表明GLP-2能時間-劑量依賴性地激活小腸黏膜的隱窩及絨毛細(xì)胞的Akt信號,伴隨caspase-3的分解增加,其下游靶蛋白GSK-3β的磷酸化增加,具有促細(xì)胞增殖作用的胰島素樣生長因子-1（IGF-1）并不參與GLP-2對Akt的作用。Burrin等[23]在新生仔豬上也觀察到GLP-2能快速激活GLP-2下游信號,包括磷酸化PKA或PKB、ERK 1/2、轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)因子連接蛋白和c-fos,快速抑制caspase-3活性,上調(diào)Bcl-2豐度,而凋亡抑制因子（XIAP）和細(xì)胞凋亡抑制子-2（cIAP-2）也分別在1 h和4～48 h內(nèi)增加。結(jié)果表明GLP-2能快速上調(diào)caspase-3的上游目標(biāo)基因（如Bcl-2和IAPs）的PKA/PKB/GSK-3磷酸化作用,抑制caspase-3的活性,實現(xiàn)對細(xì)胞抗凋亡的調(diào)節(jié)。

以上結(jié)果表明G蛋白偶聯(lián)的cAMP/PKA經(jīng)典途徑是GLP-2調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的主要途徑,但是其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的下游信號通路存在差異,而且不排除還存在其他途徑對其進(jìn)行補充。

3.2.2.2 W ingless（W nt）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和PI-3K/Ak t（PKB）途徑

調(diào)節(jié)腸隱窩細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖、分化、存活及功能發(fā)揮還有2條經(jīng)典的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑:對隱窩細(xì)胞增殖和分化起重要作用的W nt/β-catenin信號途徑[24]和影響上皮細(xì)胞存活和功能發(fā)揮的PI-3K/Akt（PKB）途徑。

小腸自我更新的能力依賴于干細(xì)胞的存在。許多研究證明W nt信號途徑是干細(xì)胞維持增殖與凋亡動態(tài)平衡的關(guān)鍵,是調(diào)控細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸進(jìn)行分化的主導(dǎo)因素[25]。而β-連環(huán)蛋白是W nt信號途徑的重要成員。

GLP-2R不能在隱窩干細(xì)胞中表達(dá),這使得要和GLP-2R結(jié)合才能發(fā)揮作用的GLP-2需要通過其他介質(zhì)間接地促進(jìn)隱窩細(xì)胞的增殖。Bjerknes等[26]在小鼠上通過免疫組織化學(xué)和原位雜交的研究顯示,小鼠隱窩細(xì)胞不表達(dá)GLP-2R,GLP-2很可能是通過旁分泌的方式,與上皮下成肌纖維細(xì)胞上的GLP-2R結(jié)合發(fā)揮作用的。?rskov等[27]研究發(fā)現(xiàn)GLP-2可能直接作用或者經(jīng)由腸內(nèi)分泌細(xì)胞、其他黏膜細(xì)胞或腸神經(jīng)細(xì)胞分泌的因子介導(dǎo)間接作用于腸上皮細(xì)胞。進(jìn)一步的試驗表明,長期使用GLP-2誘導(dǎo)小腸生長和隱窩細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是由IGF-1介導(dǎo)的（圖5）。它通過誘導(dǎo)腸肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生IGF-1,IGF-1以旁分泌方式誘導(dǎo)位于上皮隱窩細(xì)胞的IGF-1R表達(dá),通過一條PI-3K依賴式旁路啟動β-連環(huán)蛋白信號,并激活Ras,抑制GSK-3β,增加核中β-連環(huán)蛋白的積累[28],調(diào)控下游目標(biāo)基因c-myc的表達(dá),最終促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖。Dube′等[22]在小鼠上急性使用GLP-2顯著促進(jìn)了小鼠空腸非潘式隱窩細(xì)胞的β-連環(huán)蛋白的表達(dá)和增殖;而使用IGF-1R抑制劑（NVP-AEW 541）阻斷IGF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后,GLP-2促進(jìn)β-連環(huán)蛋白表達(dá)的程度降低,而對于IGF-1基因敲除小鼠,GLP-2沒有促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加,表明GLP-2促進(jìn)小腸上皮增殖層細(xì)胞β-連環(huán)蛋白的表達(dá)需要經(jīng)過IGF-1介導(dǎo)。由此可以推斷,GLP-2通過IGF-1介導(dǎo)調(diào)控β-連環(huán)蛋白而參與Wnt信號的調(diào)節(jié)作用（圖6）。

圖5 調(diào)節(jié)腸道生長過程中GLP-2與IGF-1互作的示意圖Fig.5 Schematic represen tation o f interactions between GLP-2 and IGF-1 in the regulation of intestinalgrow th[22]

GLP-2是如何通過另一條調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、存活的經(jīng)典細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PI-3K/Akt（PKB）來影響細(xì)胞發(fā)育的呢?

Anini等[30]研究表明PI-3Kγ對小腸黏膜的基礎(chǔ)生長有重要作用,而且如上文提到的,PI-3K/Akt信號也參與了IGF介導(dǎo)的GLP-2促隱窩細(xì)胞增殖的作用。近年發(fā)現(xiàn)PI-3K/Akt通路還可調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性,活化的Akt可使eNOS磷酸化激活,可能主要調(diào)節(jié)腸道供血的變化。Akt除被PI-3K活化外,能被多種Akt活化因子激活,且活化后能調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)功能,包括細(xì)胞周期、發(fā)育、凋亡和存活。

圖6 隱窩細(xì)胞增殖和分化調(diào)控的整合模型Fig.6 Integrated model for control o f crypt cell proliferation and dif ferentiation[29]

Dube′等[22]研究了GLP-2對Akt/PKB信號的作用,發(fā)現(xiàn)GLP-2呈時間劑量依賴地誘導(dǎo)Ak t的磷酸化,隨著Ak t的磷酸化,其下游分子GSK-3β磷酸化增加,caspase-3激活比例降低,并且Ak t的磷酸化出現(xiàn)在整個小腸黏膜中,包括隱窩細(xì)胞核絨毛上皮細(xì)胞,說明Ak t響應(yīng)GLP-2的刺激并不在隱窩中特異產(chǎn)生;GLP-2激活pAkt的效應(yīng)可被PI-3K的抑制劑——渥曼青霉素（wortmanin）阻斷;使用IGF-1R抑制劑（NVP-AEW 541）阻斷IGF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后,GLP-2的效應(yīng)削弱;GLP-2顯著提高了敲除IGF-1基因鼠的pAkt的磷酸化效應(yīng),表明具有促細(xì)胞增殖作用的IGF-1與GLP-2對Akt的激活并不是嚴(yán)格必需的,試驗也不能排除其他Akt激活因子參與對GLP-2促細(xì)胞存活或其他作用的調(diào)節(jié),這與前文提到的GLP-2通過cAMP/PKA/PKB抑制細(xì)胞凋亡的作用相一致。

3.2.2.3 GLP-2通過ERK 1/2信號途徑直接促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖

MAPK家族包括ERK 1/2、c-jun N端激酶（JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）、p38及ERK5等。其中,ERK 1/2信號通路（Ras/Raf/MEK 1/2, ERK 1/2）是經(jīng)典的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

Yusta等[16]報道20 nmo l/L的GLP-2沒有增加ERK 1/2的磷酸化,反而降低了ERK的基礎(chǔ)磷酸化水平;當(dāng)抑制PKA時,ERK 1的下游信號ELK-1表達(dá)升高。Walsh等[6]用表達(dá)有GLP-2R的大鼠腸黏膜細(xì)胞為模型發(fā)現(xiàn),GLP-2以PKA依賴的方式刺激cAMP的產(chǎn)生,并使3H-脫氧胸腺嘧啶苷整合到細(xì)胞中,即刺激了黏膜細(xì)胞增殖,與Yusta等[16]結(jié)果相似,在培養(yǎng)細(xì)胞中GLP-2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不與p44/p42MAPK途徑相偶聯(lián),說明MAPKs的p44/p42信號途徑可能是PKA的補充。

Jasleen等[31]報道利用10 mm ol/L GLP-2刺激人腸上皮細(xì)胞株Caco-2約5 m in發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)ERK1、ERK 2活化形式明顯增加,腸上皮細(xì)胞的增殖反應(yīng)增加了10倍。用MAPKK（M EK）抑制劑PD98059以劑量依賴性方式阻斷GLP-2的促細(xì)胞增生作用,證實GLP-2通過激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增生。同樣的,Jasleen等[32]在人Caco-2的研究表明GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖伴隨著ERK磷酸化的瞬間升高,這種反應(yīng)會被MAPKK抑制劑PD 98059所阻斷。

Koehler等[21]在Hela細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn),GLP-2介導(dǎo)ERK 1/2的激活不會通過減少GLP-2R cDNA的轉(zhuǎn)染而消除,也不受因Gαs激活而導(dǎo)致cAMP的蓄積途徑或表皮生長因子受體（EGFR）途徑受影響,而ERK 1/2對百日咳毒素敏感是因為百日咳毒素能通過Gi/Go蛋白α亞基ADP核糖基化作用使這些G蛋白與GDP結(jié)合,阻礙Gi/Go蛋白介導(dǎo)的信號,從而降低GLP-2對ERK 1/2的磷酸化作用。β-腎上腺素能受體激酶可分離βγ亞基從而抑制Gβγ介導(dǎo)的信號,試驗中它抑制了GLP-2誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化;并且GLP-2誘導(dǎo)的ERK 1/2的磷酸化還被下調(diào)Ras基達(dá)的表達(dá)所抑制。以上結(jié)果表明在Hela中GLP-2可能部分通過偶聯(lián)G蛋白的βγ亞基激活Ras/Raf/MAPK旁路,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖的,然而Gi/Go蛋白激活后通過何種途徑激活Ras/Raf/MAPK信號的還不清楚。PI-3K是由調(diào)節(jié)蛋白p101和催化亞基p110γ組成的異二聚體,介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體βγ亞基對p101的活化,即它會被GPCR激活,對M APK的活化與絲裂原刺激導(dǎo)致的細(xì)胞增殖有關(guān)（圖7）,這是否提示我們PI-3K的亞型ⅠB可能參與了該過程的銜接呢?這還有待于研究。

3.2.2.4 其他的信號途徑——鈣離子介導(dǎo)的信號通路

細(xì)胞轉(zhuǎn)染GLP-2R后,GLP-2促進(jìn)了cAM P的蓄積,然而GLP-2沒有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加（Yusta等[16]、W alsh等[6]）,表明GLP-2信號作用的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能不經(jīng)過Ca2+通道,但是否經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)受體或細(xì)胞核受體介導(dǎo),目前尚未見相關(guān)研究報道。

圖7 GLP-2R信號旁路在Hela細(xì)胞上的模型Fig.7 Model for GLP-2R signaling pathw ays in Hela cells[21]

3.2.3 GLP-2調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的整合

3.2.3.1 PKA/PKB介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的整合

Yusta等[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制PI-3K活性時,GLP-2主要通過PKA途徑改變GSK-3和Bad蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞的成活和增殖,據(jù)此推測,cAMP/PKA和PI-3K/Ak t（PKB）是可以整合的。用LY 294002抑制PI-3K活性,GLP-2也能使細(xì)胞凋亡減弱,細(xì)胞活力升高,但不如添加福斯高林的效應(yīng)明顯,表明LY 294002抑制了Akt的表達(dá),GLP-2和福斯高林都能減輕LY 294002引起的Cy tC的釋放和caspase蛋白的活化。GLP-2、福斯高林使細(xì)胞活力提高的效應(yīng)可被H 89和M tR（AB）抑制,因此PKA可能參與GLP-2對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。進(jìn)一步研究沒有LY 294002抑制PI-3K時,GLP-2和福斯高林沒有介導(dǎo)Akt的磷酸化,Akt的下游信號蛋白p70 S6K的表達(dá)沒有變化,提示我們GLP-2防止細(xì)胞凋亡的信號途徑可能不經(jīng)過Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)。GLP-2和福斯高林誘導(dǎo)的影響細(xì)胞凋亡的GSK-3活性變化和Bad蛋白Ser155的磷酸化過程是依賴于PKA途徑、獨立于PI-3K途徑的。

3.2.3.2 PKA/PKC/EGFR/受體酪氨酸蛋白激酶（TyrK）信號途徑的整合

GLP-2的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由G蛋白所介導(dǎo),它偶聯(lián)Gαs,激活A(yù)C后增加cAMP和PKA蓄積,最終激活ELK-1、c-fos、c-jun基因,增加細(xì)胞增殖;然而,將細(xì)胞用百日咳毒素（Gαi的抑制劑）預(yù)處理后,作為細(xì)胞增殖標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶苷的整合顯著受到抑制（圖8）[17]。對圖8（B）的解釋為:使用百日咳毒素或MAPK阻斷劑發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對胸苷的攝取減少（細(xì)胞增殖受到抑制）,表明Gαi抑制劑或EGFR/TyrK旁路可能參與了GLP-2的作用,并且還提示我們cAMP的水平降低與細(xì)胞增殖有關(guān)。

圖8 GLP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路Fig.8 The signal transduction pathw ay of G LP-2 stimulating cell p roliferation[17]

Hare等[33]研究發(fā)現(xiàn)GLP-2能夠抵消表皮生長因子（EGF）-酪氨酸激酶抑制劑引起的腸道發(fā)育遲緩和萎縮;添加GLP-2沒有使腸黏膜的發(fā)育完全恢復(fù),提示GLP-2的信號途徑可能部分經(jīng)過表皮生長因子-酪氨酸激酶途徑,GLP-2與表皮生長因子有協(xié)同效應(yīng)。

4 小 結(jié)

GLP-2能通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的激活而參與腸黏膜細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)節(jié):GLP-2促進(jìn)腸細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡主要通過G蛋白偶聯(lián)的經(jīng)典信號途徑cAMP/PKA進(jìn)行調(diào)節(jié);對于隱窩細(xì)胞的增殖則主要通過旁分泌作用于能表達(dá)GLP-2R的成肌纖維細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞,通過IGF-1調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號途徑間接促進(jìn)隱窩細(xì)胞增殖;另外,PI-3K/Ak t信號也作為補充信號途徑參與了調(diào)節(jié);最后,GLP-2還可以通過激活Ras/Raf/MAPK/ERK 1/2信號途徑影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

總的說來,GLP-2的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或凋亡的效應(yīng)依賴于GLP-2R分布的細(xì)胞位置、類型和數(shù)量,但可能也存在不經(jīng)GLP-2R介導(dǎo)的途徑[34]。而且關(guān)于GLP-2的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑雖然取得了一定進(jìn)展,但總體上仍然尚未完全明確,例如GLP-2介導(dǎo)NO引起的血管舒張,涉及到Ca2+和環(huán)化一磷酸鳥苷（cGMP）通道,但相關(guān)的研究表明GLP-2似乎并不參與Ca2+和cGMP的調(diào)節(jié);GLP-2的主要信號途徑之間是如何整合的,整合的關(guān)鍵調(diào)控點及反饋抑制是什么也需要我們進(jìn)一步的研究。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:w kn@sicau.edu.cn

（編輯 何麗霞）