唐 勇 劉 旭 周定剛

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,雅安 625014）

黃鱔（Monop terus albus）是廣泛分布于我國(guó)南北水域的名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一,目前其主要來(lái)源還是在天然水域,濫捕濫撈已導(dǎo)致其野生資源急劇下降,面臨枯竭。我國(guó)人工養(yǎng)殖黃鱔已經(jīng)有多年的歷史,但一直未能形成規(guī)模,要使其成為一個(gè)真正穩(wěn)定的產(chǎn)業(yè),還有許多疑難問(wèn)題需要解決。動(dòng)物在與外界環(huán)境相互作用的過(guò)程中,主要靠消化道來(lái)完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,滿足機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝的需要,維持自身生命活動(dòng)。黃鱔腸道內(nèi)與營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的細(xì)胞種類豐富,具有與消化相關(guān)的多種酶類[1]。腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)相關(guān)功能基因的主要表達(dá)中心,大量的腸上皮細(xì)胞還是消化道阻止病原體入侵的物理屏障,在生長(zhǎng)代謝和黏膜免疫中占有相當(dāng)重要的地位[2]。

構(gòu)建cDNA文庫(kù)是研究功能基因組學(xué)的基本手段之一。cDNA在研究某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢(shì),且出現(xiàn)假陽(yáng)性的幾率低。隨著構(gòu)建cDNA文庫(kù)的技術(shù)方法逐步完善,近年在水產(chǎn)領(lǐng)域已陸續(xù)建立了鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）[3]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[4]、草魚(yú)（Ctenopharyngodn idellus）[5]、大海馬（Hippocampus kuda）[6]、日本七鰓鰻（Lampetra japonica）[7]、大鯢（Andrias davidianus）[8]、石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）[9]、文昌魚(yú)（Branchiostoma belcheri）[10]等多種重要水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物不同組織的cDNA文庫(kù),并通過(guò)測(cè)序獲得了大量有研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值的新基因。但目前尚未見(jiàn)黃鱔腸道cDNA文庫(kù)構(gòu)建的報(bào)道。為此,筆者以黃鱔全腸為材料,用Gateway技術(shù)構(gòu)建了黃鱔腸道未剪切cDNA文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行了規(guī)模EST測(cè)序及分析,旨在為黃鱔營(yíng)養(yǎng)代謝與免疫相關(guān)基因的篩選提供基因序列資源,并為營(yíng)養(yǎng)代謝等相關(guān)功能基因在腸道的差異表達(dá)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品及試劑

試驗(yàn)選擇平均體重為（231±3）g的健康活體成年黃鱔3尾,分別在冰盤上取出新鮮的全腸組織,去除內(nèi)容物后液氮迅速冷凍,保存于-80℃冰箱備用。

Trizol Reagent試劑盒,FastTrackTM2.0試劑盒,CloneM inerTMcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒,Super-Scrip tTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶,RNase H,PureLinkTMQuick Gel Extraction and PCR Purification Combo試劑盒,載體pDONRTM222,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B均購(gòu)自Invitrogen公司;卡那霉素（kanam ycin,Kan）和X-gal購(gòu)自Sigm a公司;T4DNA連接酶和T4 DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。常規(guī)溶液和試劑按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[11]配制。

1.2 總RNA提取與mRNA分離

采用Trizo l Reagent試劑盒一步法提取總RNA, mRNA分離按FastTrackTM2.0試劑盒說(shuō)明書(shū)完成;用1%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)總RNA和m RNA。

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

以m RNA為模板,使用SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶和C loneM inerTMcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒中提供的Biotin-attB2-Oligo（dT）引物合成cDNA第1鏈;cDNA第2鏈?zhǔn)褂肈NA聚合酶Ⅰ和RNase H合成;用T4DNA聚合酶補(bǔ)平cDNA末端,然后用T4DNA連接酶加上attB1接頭。采用PureLinkTMQuick Gel Extraction and PCR Purification Combo試劑盒分級(jí)分離純化cDNA。

選擇符合條件的cDNA進(jìn)行BP重組〔利用一個(gè)attB DNA片段或表達(dá)克隆和一個(gè)attP供體載體（donor vector）之間的重組反應(yīng),創(chuàng)建一個(gè)入門克隆〕進(jìn)入載體pDONRTM222,連接產(chǎn)物純化后用電激轉(zhuǎn)化儀將重組子轉(zhuǎn)化到DH 10B感受態(tài)細(xì)胞,電壓為2.0 kV,電擊時(shí)間為5ms。

從2m L轉(zhuǎn)化細(xì)菌原液中取10μL稀釋1 000倍后,從中取出50μL涂布含有Kan+X-gal的LB平板,過(guò)夜培養(yǎng),第2天計(jì)數(shù)。文庫(kù)指標(biāo)計(jì)算公式:

滴度（titer）即cDNA文庫(kù)菌液的濃度（CFU/ m L）=平板上的菌落數(shù)（CFU）×稀釋系數(shù)/涂板體積（m L）;

庫(kù)容即總克隆生成單位數(shù)（CFU）=滴度（CFU/m L）×總體積（m L）。

剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%存于-80℃,即為文庫(kù)菌液。隨機(jī)挑取平板上陽(yáng)性克隆進(jìn)行插入片段的PCR鑒定。

1.4 測(cè)序與數(shù)據(jù)處理

隨機(jī)挑取1 056個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行5′單向測(cè)序,測(cè)序引物為M 13（5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′）,3730測(cè)序儀（ABI）測(cè)序及序列初步分析由上海英駿生物公司完成。

通過(guò)Cross_M atch程序?qū)⑿蛄形募c載體序列進(jìn)行比對(duì),篩選并屏蔽掉載體序列,用BLASTCLUST軟件采取單鏈法的聚類方法,通過(guò)序列間的兩兩比對(duì),建立距離矩陣,把同屬于一個(gè)基因的EST數(shù)據(jù)聚在一起,使用Phrap軟件將待拼接序列中同屬于1個(gè)轉(zhuǎn)錄本的EST序列聯(lián)結(jié)起來(lái),拼接形成重疊群（contig）,從而降低序列的冗余。

將contig序列和單拷貝EST（singleton）序列合并,得到最終的單基因簇（unigene）序列。使用批量化b lastx和blastn程序?qū)nigene序列進(jìn)行比對(duì),數(shù)據(jù)庫(kù)選擇nr和nt數(shù)據(jù)庫(kù),得到每個(gè)unigene所對(duì)應(yīng)的序列相似程度最高（score＞80,E＜10-10）[12]的基因。BatchBLAST對(duì)unigene進(jìn)行比對(duì)得到相似程度最高的基因,利用SeqGO進(jìn)行功能基因的注釋,得到每個(gè)基因的功能[13]。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提取及mRNA分離

提取的黃鱔腸道組織總RNA在1%的甲醛變性凝膠電泳圖（圖1）上能觀察到很清晰的28S rRNA與18S rRNA、以及5S rRNA 3條帶,無(wú)明顯脫尾,也沒(méi)有明顯的基因組和蛋白質(zhì)污染雜帶;28S和18S的亮度比基本上為2∶1的關(guān)系,由此說(shuō)明總RNA無(wú)降解,完整性比較好,適合下一步試驗(yàn)使用。

圖1 總RNA的1%甲醛變性凝膠電泳Fig.1 1%formaldehyde denaturing gel electrophoresis of total RNA

分離結(jié)果顯示mRNA呈彌散分布,也無(wú)降解現(xiàn)象,說(shuō)明mRNA足夠純度,完全符合逆轉(zhuǎn)錄要求。

2.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建與鑒定

過(guò)夜培養(yǎng)后檢測(cè)平板的單菌落數(shù)為364個(gè)（圖2）,滴度為7.28×106CFU/m L,庫(kù)容量為1.46×107CFU。

圖2 cDNA文庫(kù)平板計(jì)數(shù)Fig.2 Plate count o f cDNA library

2.3 重組率和插入片段的PCR鑒定

隨機(jī)挑取32個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,電泳（圖3）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明陽(yáng)性克隆率為96.88%（31/ 32）,平均插入片段約2.11 kb,84.38%（27/32）的插入片段大于850 bp。

圖3 黃鱔cDNA文庫(kù)中32個(gè)重組克隆的PCR鑒定Fig.3 PCR analysis o f random 32 recombinant clones of the cDNA library

2.4EST測(cè)序結(jié)果

2.4.1 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

測(cè)序得到1 056個(gè)序列,結(jié)果經(jīng)過(guò)Sequencing A-nalysis軟件以及DNA STAR軟件分析,得到實(shí)際可用高質(zhì)量EST序列906條（GenBank accession number:GW 584265～GW585168）。使用Phrap軟件拼接（表1）,拼出61個(gè)contig包含205條EST,其中包含10條以上EST的contig有4個(gè),最多的包含19個(gè)EST（圖4）;singleton 701個(gè),總計(jì)unigene 762個(gè),由此得到冗余度為8.00%（61/762）。（795/906）的EST處于700～999 bp之間,而850～899 bp的EST最多,占25.50%（231/906）。

表1 黃鱔cDNA文庫(kù)的EST初步統(tǒng)計(jì)Table 1 Prelim inary statistics of EST from the cDNA library of Monop terus albus

圖4 Contig序列分布比例Fig.4 Distribution ratio of contig sequence

2.5 營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)EST

腸道作為主要的消化吸收?qǐng)鏊?包含有大量與營(yíng)養(yǎng)代謝功能相關(guān)的EST。初步統(tǒng)計(jì)有5類59種,其中:蛋白質(zhì)/氨基酸代謝類25種,碳水化合物代謝類13種,脂類代謝類5種,能量代謝類12種,無(wú)機(jī)離子代謝類4種（表2,同種基因只列出1個(gè)EST）。其中表達(dá)量最高的是幾丁質(zhì)酶類,共有46個(gè)EST （5.10%,46/906）;其次是胰蛋白酶原,有41個(gè)EST （4.50%,41/906）。

表2 黃鱔腸道cDNA文庫(kù)營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)EST統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of nutrition metabolism related EST from cDNA library of M.albus

編號(hào)Number同源登錄號(hào)Accession number E值E-value功能Function同源物種H omologous species TY-I14 AAX21768.2 1.00E-144磷酸烯醇丙酮酸羧激酶Acanthopagrus schlegelii TY-K 69 NP_001002205.1 1.00E-129脫氫酶/還原酶Danio rerio能量代謝Energymetabolism TY-A 41 AAT48993.1 8.00E-71 ATP酶α亞基Rhabdosargus sarba TY-A 56 Q 04467.2 1.00E-61異檸檬酸脫氫酶Bos taurus TY-C9 ACI69505.1 1.00E-118蘋(píng)果酸脫氫酶Salmo salar TY-A 85 Q0MQI5.1 1.00E-99 NADH脫氫酶Solanum tuberosum TY-B18 ACI69327.1 2.00E-49 ADP/ATP轉(zhuǎn)移酶2 Salmo salar TY-B68 NP_443645.1 1.00E-94 NADH脫氫酶亞基1 M onop terus albus TY-C67 NP_443646.1 3.00E-71 NADH脫氫酶亞基2 M onop terus albus TY-C29 NP_998163.1 1.00E-115電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白Danio rerio TY-C39 NP_443657.1 2.00E-85細(xì)胞色素b Monopterus albus TY-D17 NP_443648.1 1.00E-20細(xì)胞色素c氧化酶亞基ⅡM onop terus albus TY-I87 ACM 08737.1 4.00E-50細(xì)胞色素c Salmo salar TY-G48 ACH 45590.1 3.00E-67肌酸激酶B Taeniopygia guttata脂類代謝Lipid metabolism TY-C10 ACM 41850.1 4.00E-88載脂蛋白A Epinephelus coioides TY-C66 XP_694827.3 8.00E-19載脂蛋白B Danio rerio TY-G5 NP_001072060.1 1.00E-68載脂蛋白E1 Takifugu rubripes TY-G 20 XP_001918547.1 4.00E-91羧基酯脂肪酶Danio rerio TY-K 96 CAQ14192.1 1.00E-114脂酰輔酶A硫脂酶Danio rerio無(wú)機(jī)離子代謝Inorganic ionm etabolism Contig5 ACM 08897.1 7.00E-17鐵蛋白Salmo salar TY-B4 ABB70391.1 2.00E-46轉(zhuǎn)鐵蛋白Oreochrom is niloticus TY-J35 ABY 21333.1 3.00E-89鐵蛋白H Oncorhynchusmasou formosanus TY-G 86 ACI66713.1 4.00E-87鐵蛋白M Salmo salar

3 討 論

3.1 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

高質(zhì)量的起始總RNA和m RNA是成功構(gòu)建cDNA文庫(kù)最重要的因素,本試驗(yàn)采用進(jìn)口一次性槍頭和離心管,所需液體試劑現(xiàn)用現(xiàn)配,并對(duì)所有試劑、器械進(jìn)行嚴(yán)格去RNA處理,盡量減少外源RNA的污染,有效保證了總RNA和m RNA的質(zhì)量。

未剪切文庫(kù)構(gòu)建采用Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的專用CloneM inerTMcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒,在構(gòu)建過(guò)程中利用Gateway技術(shù),不需要使用限制性內(nèi)切酶切割等步驟,不會(huì)對(duì)任何基因產(chǎn)生剪切;Super-Scrip tTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶具有獨(dú)特的降低RNA酶活性的功能,充分保證了合成的cDNA第1鏈的長(zhǎng)度和產(chǎn)量;利用與Gatew ay技術(shù)結(jié)合的重組酶可以將構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)穿梭于任何表達(dá)載體間,并保證文庫(kù)的庫(kù)容量無(wú)明顯損失;這樣構(gòu)建的未剪切cDNA文庫(kù)的全長(zhǎng)比例和庫(kù)容量等均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫(kù)。

cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定主要包括2部分內(nèi)容,即文庫(kù)的代表性和重組cDNA片段的序列完整性。一個(gè)高質(zhì)量的cDNA文庫(kù),其庫(kù)容量應(yīng)大于5×106CFU,本試驗(yàn)成功構(gòu)建了未剪切cDNA文庫(kù),文庫(kù)的容量為1.46×107CFU,符合高質(zhì)量文庫(kù)的要求,并充分保證了大分子cDNA的完整性,有利于獲得較多的基因信息;通過(guò)PCR檢測(cè),文庫(kù)的平均插入片段為2.11 kb,重組率為96.88%,能充分保證下一步的EST分析及目的基因篩選。

3.2 黃鱔腸道營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)EST

黃鱔消化道內(nèi)存在蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶[1]。從黃鱔腸道cDNA文庫(kù)中,我們發(fā)現(xiàn)了大量與蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類代謝酶類高度相似的蛋白編碼序列,并且蛋白質(zhì)、氨基酸代謝酶的種類與EST數(shù)目明顯多于脂肪酶,如各種蛋白酶原、羧肽酶A和B、氨肽酶、谷氨酸脫氫酶,而僅發(fā)現(xiàn)1個(gè) α-淀粉酶EST（表2）。胰蛋白酶是魚(yú)類腸道內(nèi)的一種主要的堿性蛋白質(zhì)水解酶之一,其前體形式為胰蛋白酶原,這也是黃鱔腸道中表達(dá)量較高的酶類（共有41個(gè)EST）。目前還沒(méi)有從分子水平具體闡明胰蛋白酶對(duì)黃鱔消化作用機(jī)制的研究報(bào)道。

在大量與碳水化合物代謝有關(guān)EST中,代表幾丁質(zhì)酶（chitinase）的EST共計(jì)46個(gè),是文庫(kù)中表達(dá)量最高的酶蛋白基因序列。幾丁質(zhì)酶可以將幾丁質(zhì)水解為N-乙酰氨基葡萄糖。幾丁質(zhì)作為至關(guān)重要的有機(jī)碳源和氮源參與到生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量流中[14],這主要?dú)w功于許多生物存在與幾丁質(zhì)親和的代謝酶系,使幾丁質(zhì)能被相對(duì)高效地降解和再利用[15];幾丁質(zhì)酶同時(shí)具有識(shí)別和結(jié)合含幾丁質(zhì)的病原菌并抑制其生長(zhǎng)的作用[16-17]。黃鱔腸道內(nèi)大量的幾丁質(zhì)酶可能與其在野外常攝食昆蟲(chóng)和甲殼類水生動(dòng)物有關(guān)。

在黃鱔腸道中,還發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A（apo lipoprotein A,apo-A）、載脂蛋白B（apolipoprotein B,apo-B）和載脂蛋白E（apo lipop rotein E,apo-E）等多種載脂蛋白編碼序列（表2）。載脂蛋白在血漿脂質(zhì)代謝中起著較重要的作用,其基本功能是運(yùn)載脂類物質(zhì)及穩(wěn)定脂蛋白的結(jié)構(gòu)。魚(yú)體通過(guò)幾種載脂蛋白將脂類和脂溶性成分從腸道輸送到肝臟或外周組織。從較早的研究中可見(jiàn),飼料組成也能調(diào)控魚(yú)類肝臟和血清脂蛋白中apo A-Ⅰ和apo C-Ⅱ的基因表達(dá)[18]。飼料中的營(yíng)養(yǎng)組分可通過(guò)影響脂蛋白中載脂蛋白組分的表達(dá)調(diào)控脂蛋白的合成[19-20]。因此對(duì)脂類運(yùn)輸?shù)鞍椎难芯?有助于尋找魚(yú)類配合飼料中植物性油源的最佳配比。同時(shí),載脂蛋白還有抗菌活性[21],在腸道中起著重要的免疫作用。

腸道內(nèi)旺盛的物質(zhì)代謝必然伴隨大量的能量代謝,從文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)黃鱔腸道內(nèi)含有黃素蛋白、細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素c氧化亞基、NADH脫氫酶、ATP酶等呼吸鏈組分。呼吸鏈在傳遞氫或電子的過(guò)程中,為腸道消化吸收作用源源不斷地產(chǎn)生能量。另外在無(wú)機(jī)離子代謝方面,鐵蛋白是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種主要的鐵結(jié)合蛋白,可以保護(hù)細(xì)胞免受高鐵的氧化作用帶來(lái)的損害[22-23]或清除來(lái)自于細(xì)菌等微生物的游離鐵,促進(jìn)腸道對(duì)鐵的吸收[24]。轉(zhuǎn)鐵蛋白則是一種存在于血漿中的結(jié)合鐵離子的蛋白,主要生理功能是在血清中將食物中吸收到血液中的鐵運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體的需鐵部位,調(diào)節(jié)鐵離子平衡和能量平衡、并通過(guò)與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合以吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞,抗菌殺菌等[25]。

3.3 與不同食性魚(yú)類腸道cDNA文庫(kù)的比較

我們將獲得的黃鱔腸道營(yíng)養(yǎng)相關(guān)EST（表3）與草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）[5]和大西洋鮭（Salmo salar）[26]腸道獲得的EST比較,發(fā)現(xiàn)黃鱔與草魚(yú)相似性極小,與其僅有1個(gè)胰彈性蛋白酶前體（pancreatic elastase precursor）基因具有同源性;而與大西洋鮭比較,有8種同源的基因,這可能與黃鱔和大西洋鮭同屬于肉食性魚(yú)類,而草魚(yú)屬于草食性魚(yú)類有關(guān)。黃鱔腸道其余營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因中與肉食性的牙鲆（Paralichthys olivaceus）比較有9種同源,與模式物種斑馬魚(yú)（Danio rerio）比較也有9種同源基因,余下的也多數(shù)與肉食性的魚(yú)類,如青鱂（Oryzias latipes）、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、斑鱖（Siniperca scherzeri）、斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）、條紋鱸（Morone saxatilis）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）等同源。這表明魚(yú)類消化道中各種基因的表達(dá)與其生態(tài)環(huán)境和生活習(xí)性等密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本文首次成功構(gòu)建了黃鱔腸道cDNA文庫(kù),并進(jìn)行了EST測(cè)序,一方面可以永久保存其基因資源;另一方面可以利用功能篩選、免疫學(xué)篩選、EST分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)闡明其與營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫相關(guān)的功能基因,為探討黃鱔分子營(yíng)養(yǎng)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:Zhoudg2004@126.com

（編輯 李一航）